乳房外Paget病bcl-2及bax原癌基因表达
作者：方红 沈奇范 王海军
单位：310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院皮肤科(方红 沈奇范)；浙江医科大学肿瘤研究所(王海军)
关键词：
中华皮肤科杂志980615 乳房外Paget病(EMPD)是一种较为少见的皮肤肿瘤，其组织发生和生物学行为尚不清楚。近年来研究表明，原癌基因bcl-2家族与细胞凋亡密切相关，且与一些肿瘤组织的分化程度和侵袭性相关[1]。鉴于EMPD Paget细胞(PC)增殖潜力相对较弱，大多数患者带瘤生存时间较长，预后较好，这是否与PC表达凋亡相关基因有关，尚未见文献报道。我们采用抗bcl-2及抗bax原癌基因表达蛋白抗体对10例EMPD皮损进行免疫组织化学研究，旨在阐明凋亡相关基因在PC的表达特点并探讨其意义。
一、材料与方法
, 百拇医药
(一)标本：EMPD 10例，男8例，女2例；年龄46～72岁。皮损分布于肛旁皮肤4例，阴囊2例，邻近阴囊皮肤3例，大阴唇1例，除1例肛周EMPD合并直肠腺癌(管状腺癌)以外，其余未发现原发肿瘤病灶。另1例右肛旁EMPD就诊时已出现右腹股沟淋巴结转移。对照组为正常人皮肤4份，取自成人躯干部非皮肤疾病外科手术标本。所有病例均经组织病理证实，材料均选自存档蜡块。
(二)方法：
试剂：第一抗体bcl-2(N-19)和抗bax(N-20)原癌基因产物为多克隆抗体。均为美国Santa Crutz公司产品，购自北京中山生物技术公司。
免疫组化染色：组织切片厚4μm，脱蜡后放入枸橼酸缓冲液(10mmol/L，pH6.0)95℃，10分钟。正常羊血清封闭15分钟。分别加入抗bcl-2抗体(1∶100)及抗bax抗体(1∶100)，在室温孵育4小时，采用S-P染色。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
, 百拇医药
阳性结果判断：bcl-2和bax阳性染色均为细胞浆或细胞膜棕黄色颗粒着色，根据着染细胞数目及染色深浅判断，分级如下：着色细胞数超过肿瘤细胞总数的50%以上为强阳性()，25%～50%为中度阳性()，5%～24%为弱阳性(+)，< 5%为阴性(-)。
二、结果
(一)组织病理：EMPD的PC呈单个或巢状分布，细胞大而圆，胞浆淡染透亮，少数为嗜酸性改变(3/10例)，核圆形、卵圆形或稍不规则形，位于中央，染色质淡。3例切片可见部分PC核偏位或印戒状细胞，核分裂相易见。除累及表皮外，伴毛囊受累2例(2/10例)。真皮浸润且呈多灶性3例(3/10例)。
(二)免疫组化染色：bcl-2基因表达产物阳性颗粒位于细胞浆，也见于细胞膜及核膜。10例EMPD中7例PC不同程度表达bcl-2蛋白，其中2例()、2例()、3例(+)。在EMPD皮损周围，正常角朊细胞bcl-2蛋白表达阴性。2例毛根鞘细胞bcl-2表达阳性，5例汗腺上皮细胞表达bcl-2。正常人对照切片，基底层细胞可见bcl-2表达，其上方表皮角朊细胞不表达bcl-2。bax基因产物阳性颗粒位于细胞浆。10例EMPD中6例PC不同强度表达bax，其中2例()、2例()、2例(+)。皮损周围角朊细胞不表达bax。3例毛根鞘细胞表达阳性，8例汗腺上皮细胞表达bax。正常皮肤角朊细胞bax表达阴性。
, http://www.100md.com
三、讨论
对10例EMPD皮损bcl-2表达研究发现，7例PC有不同程度的bcl-2表达。表达阴性的3例EMPD，1例肛周Paget病伴有直肠腺癌，1例肛旁Paget病就诊时已出现腹股沟淋巴结转移，另1例皮损面积较大。该3例EMPD组织病理均可见皮损累及真皮，部分PC胞浆嗜酸性，PC核偏位呈印戒状，核分裂像多见，呈不规则巢状排列，而bcl-2表达阳性的病例，均未见印戒状PC。许红民等[2]对EMPD进行病理形态观察分析，认为Paget病PC分化程度有高低之别，印戒细胞为分化低的表现，易发生侵袭和转移。本文结果提示bcl-2蛋白的表达与EMPD的PC生物学行为及病情严重性之间可能存在着相关性，不表达bcl-2的PC分化较差，转移或侵袭生长能力较强。但由于本研究样本较小，bcl-2是否作为一独立的EMPD预后指标尚有待积累更多的病例进行分析。
bax(bcl-2-associated x protein)是bcl-2基因家族成员，其作用与bcl-2正好相反，是凋亡诱导基因[3]，bax可能通过与bcl-2形成bcl-2-bax异二聚体或与其它bcl-2作用靶竞争而引起诱导细胞凋亡的作用。本文10例EMPD 中6例PC有不同程度的bax基因蛋白表达，bax与bcl-2表达相符率比较，bcl-2表达阳性的7例EMPD中4例bax表达亦阳性，即2例()、1例()、1例(+)，而bcl-2表达阴性的3例EMPD，bax表达1例()、1例(+)、1例(-)。提示两种癌基因的表达无明显的相关性，bax与PC的生物学行为及侵袭性亦无明显的相关性，bax在皮肤肿瘤发生中的确切机理有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Lipponen P, Pietilainen T, Kosma VM, et al. Apoptosis suppression protein bcl-2 is expressed in well-differentiated breast carcinomas with favorable prognosis. J Pathol, 1995,177∶49-55.
2 许红民, 李宁, 李维华, 等. 乳房外Paget病的印戒状Paget细胞发生侵袭和转移的观察. 中华病理学杂志, 1996,25∶294-295.
3 黄晓明综述. bcl-2及其相关蛋白与细胞凋亡的调节. 国外医学分子生物学分册, 1997,19∶16-18.
(收稿：1997-10-15 修回：1998-04-28), 百拇医药
单位：310003 杭州，浙江医科大学附属第一医院皮肤科(方红 沈奇范)；浙江医科大学肿瘤研究所(王海军)
关键词：
中华皮肤科杂志980615 乳房外Paget病(EMPD)是一种较为少见的皮肤肿瘤，其组织发生和生物学行为尚不清楚。近年来研究表明，原癌基因bcl-2家族与细胞凋亡密切相关，且与一些肿瘤组织的分化程度和侵袭性相关[1]。鉴于EMPD Paget细胞(PC)增殖潜力相对较弱，大多数患者带瘤生存时间较长，预后较好，这是否与PC表达凋亡相关基因有关，尚未见文献报道。我们采用抗bcl-2及抗bax原癌基因表达蛋白抗体对10例EMPD皮损进行免疫组织化学研究，旨在阐明凋亡相关基因在PC的表达特点并探讨其意义。
一、材料与方法
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(一)标本：EMPD 10例，男8例，女2例；年龄46～72岁。皮损分布于肛旁皮肤4例，阴囊2例，邻近阴囊皮肤3例，大阴唇1例，除1例肛周EMPD合并直肠腺癌(管状腺癌)以外，其余未发现原发肿瘤病灶。另1例右肛旁EMPD就诊时已出现右腹股沟淋巴结转移。对照组为正常人皮肤4份，取自成人躯干部非皮肤疾病外科手术标本。所有病例均经组织病理证实，材料均选自存档蜡块。
(二)方法：
试剂：第一抗体bcl-2(N-19)和抗bax(N-20)原癌基因产物为多克隆抗体。均为美国Santa Crutz公司产品，购自北京中山生物技术公司。
免疫组化染色：组织切片厚4μm，脱蜡后放入枸橼酸缓冲液(10mmol/L，pH6.0)95℃，10分钟。正常羊血清封闭15分钟。分别加入抗bcl-2抗体(1∶100)及抗bax抗体(1∶100)，在室温孵育4小时，采用S-P染色。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
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阳性结果判断：bcl-2和bax阳性染色均为细胞浆或细胞膜棕黄色颗粒着色，根据着染细胞数目及染色深浅判断，分级如下：着色细胞数超过肿瘤细胞总数的50%以上为强阳性()，25%～50%为中度阳性()，5%～24%为弱阳性(+)，< 5%为阴性(-)。
二、结果
(一)组织病理：EMPD的PC呈单个或巢状分布，细胞大而圆，胞浆淡染透亮，少数为嗜酸性改变(3/10例)，核圆形、卵圆形或稍不规则形，位于中央，染色质淡。3例切片可见部分PC核偏位或印戒状细胞，核分裂相易见。除累及表皮外，伴毛囊受累2例(2/10例)。真皮浸润且呈多灶性3例(3/10例)。
(二)免疫组化染色：bcl-2基因表达产物阳性颗粒位于细胞浆，也见于细胞膜及核膜。10例EMPD中7例PC不同程度表达bcl-2蛋白，其中2例()、2例()、3例(+)。在EMPD皮损周围，正常角朊细胞bcl-2蛋白表达阴性。2例毛根鞘细胞bcl-2表达阳性，5例汗腺上皮细胞表达bcl-2。正常人对照切片，基底层细胞可见bcl-2表达，其上方表皮角朊细胞不表达bcl-2。bax基因产物阳性颗粒位于细胞浆。10例EMPD中6例PC不同强度表达bax，其中2例()、2例()、2例(+)。皮损周围角朊细胞不表达bax。3例毛根鞘细胞表达阳性，8例汗腺上皮细胞表达bax。正常皮肤角朊细胞bax表达阴性。
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三、讨论
对10例EMPD皮损bcl-2表达研究发现，7例PC有不同程度的bcl-2表达。表达阴性的3例EMPD，1例肛周Paget病伴有直肠腺癌，1例肛旁Paget病就诊时已出现腹股沟淋巴结转移，另1例皮损面积较大。该3例EMPD组织病理均可见皮损累及真皮，部分PC胞浆嗜酸性，PC核偏位呈印戒状，核分裂像多见，呈不规则巢状排列，而bcl-2表达阳性的病例，均未见印戒状PC。许红民等[2]对EMPD进行病理形态观察分析，认为Paget病PC分化程度有高低之别，印戒细胞为分化低的表现，易发生侵袭和转移。本文结果提示bcl-2蛋白的表达与EMPD的PC生物学行为及病情严重性之间可能存在着相关性，不表达bcl-2的PC分化较差，转移或侵袭生长能力较强。但由于本研究样本较小，bcl-2是否作为一独立的EMPD预后指标尚有待积累更多的病例进行分析。
bax(bcl-2-associated x protein)是bcl-2基因家族成员，其作用与bcl-2正好相反，是凋亡诱导基因[3]，bax可能通过与bcl-2形成bcl-2-bax异二聚体或与其它bcl-2作用靶竞争而引起诱导细胞凋亡的作用。本文10例EMPD 中6例PC有不同程度的bax基因蛋白表达，bax与bcl-2表达相符率比较，bcl-2表达阳性的7例EMPD中4例bax表达亦阳性，即2例()、1例()、1例(+)，而bcl-2表达阴性的3例EMPD，bax表达1例()、1例(+)、1例(-)。提示两种癌基因的表达无明显的相关性，bax与PC的生物学行为及侵袭性亦无明显的相关性，bax在皮肤肿瘤发生中的确切机理有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Lipponen P, Pietilainen T, Kosma VM, et al. Apoptosis suppression protein bcl-2 is expressed in well-differentiated breast carcinomas with favorable prognosis. J Pathol, 1995,177∶49-55.
2 许红民, 李宁, 李维华, 等. 乳房外Paget病的印戒状Paget细胞发生侵袭和转移的观察. 中华病理学杂志, 1996,25∶294-295.
3 黄晓明综述. bcl-2及其相关蛋白与细胞凋亡的调节. 国外医学分子生物学分册, 1997,19∶16-18.
(收稿：1997-10-15 修回：1998-04-28), 百拇医药