青蒿琥酯对Ⅰ～Ⅳ型变态反应的影响
作者：张汝芝 高玉祥
单位：233004 安徽蚌埠医学院附属医院皮肤科
关键词：超敏反应；青蒿琥酯
中华皮肤科杂志980609 【摘要】 目的 研究青蒿琥酯对过敏反应的作用。方法 分别建立Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型过敏反应的动物模型。腹腔注射青蒿琥酯100～125mg·kg-1·d-1，连续6天，观察实验动物的反应。设立体外溶血反应体系，加入一定浓度的青蒿琥酯，测定其抑制作用。结果 青蒿琥酯125mg·kg-1·d-1腹腔注射，抑制Wistar大鼠的被动皮肤过敏反应(P< 0.01)及Arthus反应(P< 0.05)，100mg·kg-1·d-1腹腔注射，减轻小鼠迟发型过敏反应中足肿胀及炎性细胞浸润，试管内浓度3.20×10-5mol/L时抑制体外溶血(P< 0.05)。结论 青蒿琥酯明显抑制Ⅰ～Ⅳ型过敏反应。
, 百拇医药
Effect of Artesunate on Ⅰ～Ⅳ Types of Hypersensitivity Zhang Ruzhi, Gao Yuxiang. Department of Dermatology. Bengbu Medical College, Anhui 233004
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Artesunate on allergic reaction. Methods Following reactions were used for the study: (1)passive cutaneous anaphylaxis in rats; (2)systems of hemolysis in vitro with complement; (3) Arthus phenomenon in rats; (4)delayed palmoplantar swelling induced by SRBC in mice. Results (1)a marked suppressive effect of Artesunate on PCA, the inhibition rate was 33.3%; (2)Artesunate at the concentration of 1.30×10-5mol/L depressed hemolysis in vitro; (3)at dose of 125mg·kg-1·d-1, Artesunate inhibited Arthus phenomenon in rats (compared with control group P< 0.01); (4)the palmoplantar swelling and pathologic changes of DTH in mice was decreased by Artesunate ip100mg·kg-1·d-1. Conclusion Artesunate markedly inhibits Ⅰ～Ⅳ types of allergic reaction, and may offer a novel treatment for allergic diseases and immunemediated disorders.
, 百拇医药
【Key words】 Hypersensitivity Artesunate
青蒿琥酯(Artesunate，简称Art)是二氢青蒿素的半琥珀酸酯，不仅是一种高效低毒的抗疟药物，而且具有免疫调节作用[1]，主要表现为免疫抑制。我们通过建立Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型过敏反应的动物模型及Ⅱ型变态反应的体外溶血反应体系，观察Art的免疫抑制作用，为Art的临床应用提供实验依据。
材料和方法
一、材料
(1)豚鼠、Wistar大鼠、昆明种小鼠由本院动物科提供。(2)青蒿琥酯由广西桂林第二制药厂生产，用5%的碳酸氢钠溶液溶解，再用生理盐水稀释到所需浓度。(3)依文思蓝，Fluka进口分装；绵羊红细胞悬液及溶血素，由本院微生物教研室提供。
二、方法
, 百拇医药
1.Art对48小时同系大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)的影响：参考文献[2]制备IgE抗血清，用前生理盐水1∶7稀释。另取同种Wistar大鼠12只，随机分为两组，分别腹腔注射Art 125mg·kg-1·d-1及同体积生理盐水，每天一次，连续6天(d0～d5)。于第3天(d3)鼠背部剪毛，3点皮内注射稀释后的抗血清，每点0.1ml，48小时后(d5)阴茎背静脉注射含5mg卵蛋白的0.5%伊文思蓝溶液1ml，30分钟后处死大鼠，将蓝斑剪下置试管内，加1ml 1mol/L KOH 37℃ 15小时消化，然后加3.75ml 0.2mol/L H3PO4与丙酮(1∶2.75)混和液振荡提取后，2500r/min，离心10分钟，取上清液，721分光光度仪640nm处测A值(曾称OD值)。
2.Art对体外溶血的作用：参考文献[2],略有改动。取18只消毒试管，分别加2%绵羊红细胞悬液0.2ml,兔抗羊抗血清(溶血素)1∶100稀释后取0.2ml加入各管，然后分为3组。Ⅰ组：加0.2ml生理盐水，Ⅱ组：加Art 20μg/0.2ml，Ⅲ组：加Art 40μg/0.2ml，将各组试管置于37℃恒温水箱中温浴30分钟，各管加入1∶10稀释的新鲜豚鼠血清，摇匀，继续温浴30分钟后，721分光光度仪540nm处读取A值。
, 百拇医药
3.Art抑制大鼠Arthus反应：按文献[3]方法，造成大鼠Arthus反应模型，随机分为三组。末次免疫后第三天，实验组：Art 125mg·kg-1·d-1，空白对照组：生理盐水1.0ml/只，阳性对照组：氢化可的松15mg·kg-1·d-1，各组均每日腹腔注射1次共6次。末次免疫后第9天，鼠背部剪毛，第10天，每鼠3点皮内注射1%卵蛋白溶液，每点0.1ml，抗原攻击后2、5、7、24小时，精确测量并计算每点炎性水肿面积，参照Benacerraf标准进行分级。
4.Art对绵羊红细胞(SRBC)诱导的小鼠迟发型过敏反应(DTH)的影响：参考文献[4]，将40只昆明种小鼠随机分为4组，每组两后足垫皮下注射10% SRBC 0.05ml致敏。Ⅰ：Art 100mg·kg-1·d-1，Ⅱ：Art 200mg·kg-1·d-1，Ⅲ：氢化可的松30mg·kg-1·d-1，Ⅳ：生理盐水1ml，各组均每日腹腔注射1次共6次。致敏后第5天，右后足垫皮下注射0.05ml生理盐水，左后足垫皮下注射0.05ml SRBC，各组均在攻击后24小时，精确测量并计算两后足肿胀差值。随后离颈处死小鼠，齐膝关节剪下后足，用电光分析天平称重，足垫取材作病理。
, 百拇医药
结 果
1.在PCA反应中，青蒿琥酯组蓝斑的A值为0.081±0.007，对照组为0.054±0.002，采用两均数比较的t检验，t=9.085(P< 0.01)，即局部染料渗出减少。青蒿琥酯对大鼠PCA呈抑制作用。
2.体外溶血反应中，Ⅰ组：540nm处A值为0.085±0.007；Ⅱ 组为0.095±0.003，与Ⅰ 组相比，t=3.216，P< 0.01；Ⅲ组A值为0.103±0.007，与Ⅰ组比较，t=4.54，P< 0.01。因此，Art最终试管内浓度25μg/ml时即对补体参与的体外溶血反应抑制，浓度加大，抑制增强。
3.抗原攻击前腹腔注射Art抑制大鼠Arthus反应，表现为局部炎性水肿面积减少，详见表10。
表1 青蒿琥酯对大鼠Arthus反应模型的影响(
) 药物
, http://www.100md.com
剂量
(mg·kg-1·d-1)
抗原攻击后局部皮肤炎性水肿面积(mm2)
Benacerraf
分级
2h
5h
7h
24h
生理盐水
-
, 百拇医药 11.56±4.5
36.35±8.7
30.26±7.8
10.12±3.9
青蒿琥酯
125
8.26±3.8
(1.772)*
16.78±4.8
(6.228)**
, 百拇医药 15.38±5.1
(5.049)**
5.86±2.2
(3.008)**
氢化可的松
15
6.12±2.1
(3.464)**
12.34±4.5
(7.752)**
, http://www.100md.com
13.98±4.9
(5.589)**
3.30±2.9
(4.437)**
+
注：括号内数值为与生理盐水组比较t值，* P<0.05，** P<0.01
4.Art 100mg·kg-1·d-1共6天即可抑制小鼠DTH反应，剂量加大，抑制作用增强，详见表2。
表2 青蒿琥酯对小鼠足肿差值及小鼠足垫病理的影响() 药物
, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
动物数
(只)
肿胀差值
(mm)
重量差值
(mg)
真皮浸润细胞
(连续10个视野)
表皮水肿细胞
(连续10个视野)
生理盐水
, http://www.100md.com
-
10
0.806±0.089
30.27±2.1
81.26±8.49
18.7±3.83
青蒿琥酯
100
10
0.525±0.095
(6.826)
19.59±2.0
, 百拇医药
(11.645)
66.53±8.57
(3.861)
12.32±2.65
(3.623)
青蒿琥酯
200
10
0.455±0.076
(12.426)
16.49±1.9
(15.387)
, http://www.100md.com
49.72±4.65
(10.304)
9.01±2.33
(4.82)
氢化可的松
30
10
0.352±0.096
(10.967)
12.29±1.8
(20.557)
46.50±6.12
, 百拇医药
(9.529)
6.23±1.34
(8.786)
注：括号内数值为与生理盐水组比较t值，P均<0.01
讨 论
正常大鼠皮内注射同种异体抗血清，当有相应抗原攻击时，可产生Ⅰ 型变态反应，介导24～72小时PCA的抗体为IgE。本实验用光学方法，对染料渗出进行量的检测，以量的变化显示Art对Ⅰ 型变态反应的抑制作用。可能与Art增强Ts功能，Ts又抑制IL-4的产生、IgE的表达有关[5]。
曾有报道[6]青蒿素在一定浓度时，抑制细胞流动性，抑制分裂旺盛细胞DNA合成，本实验中Art试管内浓度25μg/ml时即可抑制有补体参加的体外溶血反应，可能与Art稳定细胞膜、抑制补体激活有关。
, http://www.100md.com
Arthus现象是典型的Ⅲ型变态反应，抗原抗体复合物沉积于毛细血管基底膜或其间隙，通过激活补体，产生炎症反应，致使沉积部位损伤坏死，凝血因子释放，小血栓形成而引起局部缺血或出血，即Arthus反应。研究发现[7]Art可抑制CIC形成，减轻SLE的肾损害，缘于这一理论基础，本实验在大鼠Arthus模型上应用青蒿琥酯，设置对照，进一步证实了Art可抑制Ⅲ型变态反应。
Art减弱Ⅳ型变态反应——ACD小鼠模型已有报道[8]，本实验采用SRBC诱导小鼠模型，精密测量同一只鼠左右后足肿胀差值、重量差值及足垫病理改变结果三方面均显示Art的抑制作用。效果与应用氢化可的松相似。
参考文献
1 陈华, 高玉祥. 青蒿琥酯免疫作用机制探讨. 中华皮肤科杂志，1990,23∶250-252.
2 沈玉清, 高德华. 免疫学与免疫检验学. 北京: 中国医药科技出版社, 1989.296-297.
, 百拇医药
3 周汉良, 卞如濂. 兔与大鼠Arthus反应的研究. 浙江医科大学学报,1988,17∶112-114.
4 黄守雄, 陈治, 罗斌，等. 测定迟发型超敏反应的一种简单有效的方法. 中国实验临床免疫学杂志, 1993,5∶8-9.
5 Seder RA, Germain RN, Lisley PS, et al. CD28-mediated costimulation of interluekin 2 production plays a critical role in T cell priming for IL-4 and interferon γ production. J Exp Med, 1994,179∶299-304.
6 宋千里, 林性玉, 张人德, 等. 青蒿素丁二酸酯钠对小鼠脾细胞3H尿核苷掺入及细胞膜的作用. 中国药理学报, 1987,8∶72-75.
7 高春芳, 高玉祥. 青蒿琥酯对系统性红斑狼疮样小鼠模型的影响.中华皮肤科杂志, 1995,28∶17-19.
8 王俐, 高玉祥. 青蒿琥酯对小鼠变应性接触性皮炎及白细胞介素1的影响. 中华皮肤科杂志, 1992,25∶165-167.
(收稿：1997-09-26 修回：1998-04-20), http://www.100md.com
单位：233004 安徽蚌埠医学院附属医院皮肤科
关键词：超敏反应；青蒿琥酯
中华皮肤科杂志980609 【摘要】 目的 研究青蒿琥酯对过敏反应的作用。方法 分别建立Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型过敏反应的动物模型。腹腔注射青蒿琥酯100～125mg·kg-1·d-1，连续6天，观察实验动物的反应。设立体外溶血反应体系，加入一定浓度的青蒿琥酯，测定其抑制作用。结果 青蒿琥酯125mg·kg-1·d-1腹腔注射，抑制Wistar大鼠的被动皮肤过敏反应(P< 0.01)及Arthus反应(P< 0.05)，100mg·kg-1·d-1腹腔注射，减轻小鼠迟发型过敏反应中足肿胀及炎性细胞浸润，试管内浓度3.20×10-5mol/L时抑制体外溶血(P< 0.05)。结论 青蒿琥酯明显抑制Ⅰ～Ⅳ型过敏反应。
, 百拇医药
Effect of Artesunate on Ⅰ～Ⅳ Types of Hypersensitivity Zhang Ruzhi, Gao Yuxiang. Department of Dermatology. Bengbu Medical College, Anhui 233004
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Artesunate on allergic reaction. Methods Following reactions were used for the study: (1)passive cutaneous anaphylaxis in rats; (2)systems of hemolysis in vitro with complement; (3) Arthus phenomenon in rats; (4)delayed palmoplantar swelling induced by SRBC in mice. Results (1)a marked suppressive effect of Artesunate on PCA, the inhibition rate was 33.3%; (2)Artesunate at the concentration of 1.30×10-5mol/L depressed hemolysis in vitro; (3)at dose of 125mg·kg-1·d-1, Artesunate inhibited Arthus phenomenon in rats (compared with control group P< 0.01); (4)the palmoplantar swelling and pathologic changes of DTH in mice was decreased by Artesunate ip100mg·kg-1·d-1. Conclusion Artesunate markedly inhibits Ⅰ～Ⅳ types of allergic reaction, and may offer a novel treatment for allergic diseases and immunemediated disorders.
, 百拇医药
【Key words】 Hypersensitivity Artesunate
青蒿琥酯(Artesunate，简称Art)是二氢青蒿素的半琥珀酸酯，不仅是一种高效低毒的抗疟药物，而且具有免疫调节作用[1]，主要表现为免疫抑制。我们通过建立Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型过敏反应的动物模型及Ⅱ型变态反应的体外溶血反应体系，观察Art的免疫抑制作用，为Art的临床应用提供实验依据。
材料和方法
一、材料
(1)豚鼠、Wistar大鼠、昆明种小鼠由本院动物科提供。(2)青蒿琥酯由广西桂林第二制药厂生产，用5%的碳酸氢钠溶液溶解，再用生理盐水稀释到所需浓度。(3)依文思蓝，Fluka进口分装；绵羊红细胞悬液及溶血素，由本院微生物教研室提供。
二、方法
, 百拇医药
1.Art对48小时同系大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)的影响：参考文献[2]制备IgE抗血清，用前生理盐水1∶7稀释。另取同种Wistar大鼠12只，随机分为两组，分别腹腔注射Art 125mg·kg-1·d-1及同体积生理盐水，每天一次，连续6天(d0～d5)。于第3天(d3)鼠背部剪毛，3点皮内注射稀释后的抗血清，每点0.1ml，48小时后(d5)阴茎背静脉注射含5mg卵蛋白的0.5%伊文思蓝溶液1ml，30分钟后处死大鼠，将蓝斑剪下置试管内，加1ml 1mol/L KOH 37℃ 15小时消化，然后加3.75ml 0.2mol/L H3PO4与丙酮(1∶2.75)混和液振荡提取后，2500r/min，离心10分钟，取上清液，721分光光度仪640nm处测A值(曾称OD值)。
2.Art对体外溶血的作用：参考文献[2],略有改动。取18只消毒试管，分别加2%绵羊红细胞悬液0.2ml,兔抗羊抗血清(溶血素)1∶100稀释后取0.2ml加入各管，然后分为3组。Ⅰ组：加0.2ml生理盐水，Ⅱ组：加Art 20μg/0.2ml，Ⅲ组：加Art 40μg/0.2ml，将各组试管置于37℃恒温水箱中温浴30分钟，各管加入1∶10稀释的新鲜豚鼠血清，摇匀，继续温浴30分钟后，721分光光度仪540nm处读取A值。
, 百拇医药
3.Art抑制大鼠Arthus反应：按文献[3]方法，造成大鼠Arthus反应模型，随机分为三组。末次免疫后第三天，实验组：Art 125mg·kg-1·d-1，空白对照组：生理盐水1.0ml/只，阳性对照组：氢化可的松15mg·kg-1·d-1，各组均每日腹腔注射1次共6次。末次免疫后第9天，鼠背部剪毛，第10天，每鼠3点皮内注射1%卵蛋白溶液，每点0.1ml，抗原攻击后2、5、7、24小时，精确测量并计算每点炎性水肿面积，参照Benacerraf标准进行分级。
4.Art对绵羊红细胞(SRBC)诱导的小鼠迟发型过敏反应(DTH)的影响：参考文献[4]，将40只昆明种小鼠随机分为4组，每组两后足垫皮下注射10% SRBC 0.05ml致敏。Ⅰ：Art 100mg·kg-1·d-1，Ⅱ：Art 200mg·kg-1·d-1，Ⅲ：氢化可的松30mg·kg-1·d-1，Ⅳ：生理盐水1ml，各组均每日腹腔注射1次共6次。致敏后第5天，右后足垫皮下注射0.05ml生理盐水，左后足垫皮下注射0.05ml SRBC，各组均在攻击后24小时，精确测量并计算两后足肿胀差值。随后离颈处死小鼠，齐膝关节剪下后足，用电光分析天平称重，足垫取材作病理。
, 百拇医药
结 果
1.在PCA反应中，青蒿琥酯组蓝斑的A值为0.081±0.007，对照组为0.054±0.002，采用两均数比较的t检验，t=9.085(P< 0.01)，即局部染料渗出减少。青蒿琥酯对大鼠PCA呈抑制作用。
2.体外溶血反应中，Ⅰ组：540nm处A值为0.085±0.007；Ⅱ 组为0.095±0.003，与Ⅰ 组相比，t=3.216，P< 0.01；Ⅲ组A值为0.103±0.007，与Ⅰ组比较，t=4.54，P< 0.01。因此，Art最终试管内浓度25μg/ml时即对补体参与的体外溶血反应抑制，浓度加大，抑制增强。
3.抗原攻击前腹腔注射Art抑制大鼠Arthus反应，表现为局部炎性水肿面积减少，详见表10。
表1 青蒿琥酯对大鼠Arthus反应模型的影响(
) 药物, http://www.100md.com
剂量
(mg·kg-1·d-1)
抗原攻击后局部皮肤炎性水肿面积(mm2)
Benacerraf
分级
2h
5h
7h
24h
生理盐水
-
, 百拇医药 11.56±4.5
36.35±8.7
30.26±7.8
10.12±3.9
青蒿琥酯
125
8.26±3.8
(1.772)*
16.78±4.8
(6.228)**
, 百拇医药 15.38±5.1
(5.049)**
5.86±2.2
(3.008)**
氢化可的松
15
6.12±2.1
(3.464)**
12.34±4.5
(7.752)**
, http://www.100md.com
13.98±4.9
(5.589)**
3.30±2.9
(4.437)**
+
注：括号内数值为与生理盐水组比较t值，* P<0.05，** P<0.01
4.Art 100mg·kg-1·d-1共6天即可抑制小鼠DTH反应，剂量加大，抑制作用增强，详见表2。
表2 青蒿琥酯对小鼠足肿差值及小鼠足垫病理的影响(
) 药物, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
动物数
(只)
肿胀差值
(mm)
重量差值
(mg)
真皮浸润细胞
(连续10个视野)
表皮水肿细胞
(连续10个视野)
生理盐水
, http://www.100md.com
-
10
0.806±0.089
30.27±2.1
81.26±8.49
18.7±3.83
青蒿琥酯
100
10
0.525±0.095
(6.826)
19.59±2.0
, 百拇医药
(11.645)
66.53±8.57
(3.861)
12.32±2.65
(3.623)
青蒿琥酯
200
10
0.455±0.076
(12.426)
16.49±1.9
(15.387)
, http://www.100md.com
49.72±4.65
(10.304)
9.01±2.33
(4.82)
氢化可的松
30
10
0.352±0.096
(10.967)
12.29±1.8
(20.557)
46.50±6.12
, 百拇医药
(9.529)
6.23±1.34
(8.786)
注：括号内数值为与生理盐水组比较t值，P均<0.01
讨 论
正常大鼠皮内注射同种异体抗血清，当有相应抗原攻击时，可产生Ⅰ 型变态反应，介导24～72小时PCA的抗体为IgE。本实验用光学方法，对染料渗出进行量的检测，以量的变化显示Art对Ⅰ 型变态反应的抑制作用。可能与Art增强Ts功能，Ts又抑制IL-4的产生、IgE的表达有关[5]。
曾有报道[6]青蒿素在一定浓度时，抑制细胞流动性，抑制分裂旺盛细胞DNA合成，本实验中Art试管内浓度25μg/ml时即可抑制有补体参加的体外溶血反应，可能与Art稳定细胞膜、抑制补体激活有关。
, http://www.100md.com
Arthus现象是典型的Ⅲ型变态反应，抗原抗体复合物沉积于毛细血管基底膜或其间隙，通过激活补体，产生炎症反应，致使沉积部位损伤坏死，凝血因子释放，小血栓形成而引起局部缺血或出血，即Arthus反应。研究发现[7]Art可抑制CIC形成，减轻SLE的肾损害，缘于这一理论基础，本实验在大鼠Arthus模型上应用青蒿琥酯，设置对照，进一步证实了Art可抑制Ⅲ型变态反应。
Art减弱Ⅳ型变态反应——ACD小鼠模型已有报道[8]，本实验采用SRBC诱导小鼠模型，精密测量同一只鼠左右后足肿胀差值、重量差值及足垫病理改变结果三方面均显示Art的抑制作用。效果与应用氢化可的松相似。
参考文献
1 陈华, 高玉祥. 青蒿琥酯免疫作用机制探讨. 中华皮肤科杂志，1990,23∶250-252.
2 沈玉清, 高德华. 免疫学与免疫检验学. 北京: 中国医药科技出版社, 1989.296-297.
, 百拇医药
3 周汉良, 卞如濂. 兔与大鼠Arthus反应的研究. 浙江医科大学学报,1988,17∶112-114.
4 黄守雄, 陈治, 罗斌，等. 测定迟发型超敏反应的一种简单有效的方法. 中国实验临床免疫学杂志, 1993,5∶8-9.
5 Seder RA, Germain RN, Lisley PS, et al. CD28-mediated costimulation of interluekin 2 production plays a critical role in T cell priming for IL-4 and interferon γ production. J Exp Med, 1994,179∶299-304.
6 宋千里, 林性玉, 张人德, 等. 青蒿素丁二酸酯钠对小鼠脾细胞3H尿核苷掺入及细胞膜的作用. 中国药理学报, 1987,8∶72-75.
7 高春芳, 高玉祥. 青蒿琥酯对系统性红斑狼疮样小鼠模型的影响.中华皮肤科杂志, 1995,28∶17-19.
8 王俐, 高玉祥. 青蒿琥酯对小鼠变应性接触性皮炎及白细胞介素1的影响. 中华皮肤科杂志, 1992,25∶165-167.
(收稿：1997-09-26 修回：1998-04-20), http://www.100md.com