1，25(OH)2维生素D3诱导小鼠混合培养细胞白细胞介素1αmRNA的表达
作者：张丁 J. Lorenzo
单位：100081 北京医科大学口腔医学院(张丁)；美国康涅迪格州立大学健康中心(J. Lorenzo)
关键词：破骨细胞；白细胞介素；维生素
中华口腔医学杂志980619 【摘要】 目的 本研究旨在探讨破骨细胞形成过程中1，25(OH)2维生素D3[1，25(OH)2D3]和白细胞介素1α(IL-1α)两种生物因子间的相互作用关系，以期进一步了解正畸牙齿移动过程中牙周组织改建的生物学机理。方法 RT-PCR将IL-1α mRNA表达信号放大后，采用Southern法检测混合培养细胞在1，25(OH)2D3作用下，IL-1α mRNA的表达。结果 发现IL-1α mRNA的表达强度与1，25(OH)2D3浓度呈正相关关系，在时间顺序上IL-α mRNA在第2天表达最强，第4天、第6天相对减弱。结论 证明IL-1参与1，25(OH)2D3对破骨细胞生成的诱导作用。推测前4天促进破骨细胞前体增殖，后2天促进其分化。
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1,25(OH)2 vitamin D3 induces IL-1α mRNA expression from osteoblastic-like and bone marrow co-culture cells
Zhang Ding*, J. Lorenzo.*School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective The purpose of this research is to investigate the relationship between 1,25(OH)2 Vitamin D3 [1,25(OH)2D3] and Interleukin-1 (IL-1) in regulating osteoclast formation. The result may enrich our knowledge about biological mechanisms of periodontal tissue remodeling during orthodontic tooth movement. Methods We found IL-1α mRNA expression in bone marrow and osteoblastic cell co-cultures by semi-quantitative RT-PCR. Results 1,25(OH)2D3 increased IL-1α mRNA expression from this co-culture cells in a dose dependent manner, and the expression reached its peak in day 2 and decreased thereafter. Conclusion These results demonstrate that IL-1α involves in osteoclast formation induced by 1,25 (OH)2D3. And we propose IL-1α may stimulate the proliferation of osteoclast progenitor during the first 4 days of total 6 days culture period.
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【Key words】 Osteoclast Interleukin Vitamin
在正畸牙齿移动过程中，牙槽骨组织的改建对牙齿移动速度以及矫治完成后牙齿的稳定起着重要作用。因此，对牙槽骨代谢的基础研究已成为现代正畸学的一个重要课题。以往的研究表明，1，25(OH)2维生素D3[1，25(OH)2 Vitamin D3, 1，25(OH)2D3]和白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)都有促进破骨细胞生成的作用[1，2]。新生小鼠颅顶骨分离的成骨细胞与小鼠长骨骨髓细胞混合培养系，在1，25(OH)2D3的作用下经6～7天可以形成大量破骨细胞。我们以往的研究发现1，25(OH)2D3可促进此混合细胞培养系中细胞内IL-1蛋白质的产生[3]。在本项实验中，我们应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase clain reaction, RT-PCR)手段观察1，25(OH)2D3处理的混合培养细胞中IL-1α的mRNA表达。以期从分子生物学水平证明，1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的过程中有IL-1的参与。
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材料和方法
1.成骨细胞获取：取新生的CD-1小鼠颅顶骨，用系列酶消化法获得成骨细胞[4]。
2.长骨骨髓细胞：取6～8周龄的雄性CD-1小鼠股骨，锐剥离去除软组织，以无菌PBS液清洗后纵行剖开股骨，刮出骨髓细胞悬浮于改良基础培养基(αMEM)+10%胎牛血清(FCS)，将107长骨骨髓细胞与105成骨细胞混合培养，置于37℃、5% CO2环境下，加入10-10～-8mol/L 1，25(OH)2D3培养6～7天。每2天更换培养液一次，即可获得大量破骨细胞，该细胞抗酒石酸磷酸酶染色阳性(TRACP+)，多核，降钙素受体阳性。
3.剂量梯度实验：在混合培养细胞内加入10-11～10-8mol/L 1，25(OH)2D3，6天后提取RNA，经RT-PCR (25周期)扩增后，以肌动蛋白(actin)的cDNA为内参照，用Southern法观察IL-1α mRNA的表达[5]。
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4.时间序列实验：在混合培养细胞内加入10-8 mol/L 1,25(OH)2D3，于第2、4、6天后分别提取RNA，经RT-PCR (25周期)扩增后，以肌动蛋白(actin)的cDNA为内参照，用Southern法观察IL-1α mRNA的表达[5]。
结果
1.剂量梯度实验结果：如图1所示，10-10～10-8mol/L 1，25(OH)2D3可诱导混合培养细胞IL-1α mRNA的表达，mRNA表达的强度与1，25(OH)2D3浓度呈正相关关系。
2.时间序列实验结果：如图2所示，10-8mol/L 1，25(OH)2D3在实验第2、4、6天均可诱导IL-1α mRNA的表达，以第2天mRNA的表达最强。
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讨论
至目前为止，研究结果表明破骨细胞是来源于造血系统的单核细胞。IL-1，1，25(OH)2D3，甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)，PGE2(prostaglandin E2)等生物因子均有诱导破骨细胞生成的作用，不同生物因子的作用之间又存在交叉[6]。Suda等[7]的研究结果表明，IL-1、PTH、PGE2诱导破骨细胞生成与cAMP的产生无关。在以往的研究中我们发现，1，25(OH)2D3可以使混合培养细胞内IL-1α的蛋白含量明显增高，而IL-1受体拮抗剂可以部分阻断1，25(OH)2D3对破骨细胞生成的诱导。提示我们，IL-1参加1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的过程。本项实验结果显示，1，25(OH)2D3可使混合培养细胞的IL-1α mRNA表达，证明了在破骨细胞生成过程中，cAMP途径与非cAMP途径作用的生物因子彼此间存在相互关系。Yamasaki[8]的研究表明，在正畸牙齿移动过程中，牙周组织中的cAMP含量会发生波动，说明cAMP途径的第二信使传导途径参与正畸牙移动过程中组织改建的调节。本项实验结果提示，除cAMP途径以外，其他第二信使传导途径也参与了正畸牙齿移动中组织改建的调节。
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1 为对照组未加入1，25(OH)2D3的混合培养细胞，2～5分别为VitD10-8、VitD10-9、VitD10-10、VitD10-11，代表1，25(OH)2D3的不同浓度，6为阴性对照，7为阳性对照
图1 剂量梯度实验：1，25(OH)2D3诱导IL-1α mRNA表达
1，25(OH)2 D3的浓度为10-8mol/L, N 为阴性对照，P 为阳性对照
图2 时间顺序实验：1，25(OH)2D3在2，4，6天均可诱导IL-1α mRNA的表达
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另外，从时间序列实验中可以看到，1，25(OH)2D3处理的混合培养细胞IL-1α mRNA的表达在第2天最强，第4天和第6天逐渐减弱。以往的研究证明，IL-1有促进破骨细胞前体增殖及破骨细胞分化的作用，而对于成熟细胞IL-1则有抑制作用[2]。Tanaka等[9]将混合培养系破骨细胞的生成过程分为2个阶段，前4天为破骨细胞前体增殖期，后2天为细胞分化。1，25(OH)2D3、PTH及PGE2仅在最后2天处理混合培养细胞就可诱导破骨细胞生成，因而推测这些骨吸收因子只影响破骨细胞前体的分化而不影响其增殖。而我们的观察发现，1，25(OH)2D3促进IL-1α mRNA表达，IL-1α蛋白质含量增加；IL-1受体拮抗剂只能部分阻断1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的作用[3]。我们推测，1，25(OH)2D3在混合培养细胞的前4天，通过促进IL-1的产生促进破骨细胞前体增殖，而在后2天促进其分化，从两方面起到了诱导破骨细胞生成的作用。 参考文献
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1 Takahashi N, Akatsu T, Udagawa N, et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology, 1988, 123:2600-2602.
2 Gowen M, Mundy GR. Actions of recombinant interleukin 1, interleukin 2 and interferon-r on bone resorption in vitro. J Immunol, 1986, 136:2478-2482.
3 张丁，Lorenzo J. 白细胞介素1参与活性维生素D3对破骨细胞生成的诱导.口腔正畸学杂志，1998，5：7-8.
4 Luben RA, Wong GL, Cohn DV. Biochemical characterization with parathormone and calcitonin of isolated bone cells;provisional identification of osteoclasts and osteoblasts. Endocrinology, 1976, 99:526-534.
, http://www.100md.com
5 Sambrook J, Fritsch EF, Manistis T, 主编.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译.第2版.北京：科学出版社，1992.474-477.
6 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Role of prostaglandins in interleukin-1 -induced bone resorption in mice in vitro. J Bone Miner Res, 1991, 6:183-190.
7 Suda T, Takahashi N, Martin TJ, et al. Modulation of osteoclast differentiation. Endo Rev, 1992, 13:66-80.
8 Yamasaki K. The role of cyclic AMP, calcium, and prostaglandins in the induction of osteoclastic bone resorption associated with experimental tooth movement. J Dent Res, 1983, 62:877-881.
9 Tanaka S, Takahashi N, Udagawa N, et al. Macrophage colony-stimulating factor is indispensable for both proliferation and differentiation of osteoclast progenitors. J Clin Invest, 1993, 91:257-263.
(收稿：1998-02-23 修回：1998-08-10), 百拇医药
单位：100081 北京医科大学口腔医学院(张丁)；美国康涅迪格州立大学健康中心(J. Lorenzo)
关键词：破骨细胞；白细胞介素；维生素
中华口腔医学杂志980619 【摘要】 目的 本研究旨在探讨破骨细胞形成过程中1，25(OH)2维生素D3[1，25(OH)2D3]和白细胞介素1α(IL-1α)两种生物因子间的相互作用关系，以期进一步了解正畸牙齿移动过程中牙周组织改建的生物学机理。方法 RT-PCR将IL-1α mRNA表达信号放大后，采用Southern法检测混合培养细胞在1，25(OH)2D3作用下，IL-1α mRNA的表达。结果 发现IL-1α mRNA的表达强度与1，25(OH)2D3浓度呈正相关关系，在时间顺序上IL-α mRNA在第2天表达最强，第4天、第6天相对减弱。结论 证明IL-1参与1，25(OH)2D3对破骨细胞生成的诱导作用。推测前4天促进破骨细胞前体增殖，后2天促进其分化。
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1,25(OH)2 vitamin D3 induces IL-1α mRNA expression from osteoblastic-like and bone marrow co-culture cells
Zhang Ding*, J. Lorenzo.*School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective The purpose of this research is to investigate the relationship between 1,25(OH)2 Vitamin D3 [1,25(OH)2D3] and Interleukin-1 (IL-1) in regulating osteoclast formation. The result may enrich our knowledge about biological mechanisms of periodontal tissue remodeling during orthodontic tooth movement. Methods We found IL-1α mRNA expression in bone marrow and osteoblastic cell co-cultures by semi-quantitative RT-PCR. Results 1,25(OH)2D3 increased IL-1α mRNA expression from this co-culture cells in a dose dependent manner, and the expression reached its peak in day 2 and decreased thereafter. Conclusion These results demonstrate that IL-1α involves in osteoclast formation induced by 1,25 (OH)2D3. And we propose IL-1α may stimulate the proliferation of osteoclast progenitor during the first 4 days of total 6 days culture period.
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【Key words】 Osteoclast Interleukin Vitamin
在正畸牙齿移动过程中，牙槽骨组织的改建对牙齿移动速度以及矫治完成后牙齿的稳定起着重要作用。因此，对牙槽骨代谢的基础研究已成为现代正畸学的一个重要课题。以往的研究表明，1，25(OH)2维生素D3[1，25(OH)2 Vitamin D3, 1，25(OH)2D3]和白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)都有促进破骨细胞生成的作用[1，2]。新生小鼠颅顶骨分离的成骨细胞与小鼠长骨骨髓细胞混合培养系，在1，25(OH)2D3的作用下经6～7天可以形成大量破骨细胞。我们以往的研究发现1，25(OH)2D3可促进此混合细胞培养系中细胞内IL-1蛋白质的产生[3]。在本项实验中，我们应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase clain reaction, RT-PCR)手段观察1，25(OH)2D3处理的混合培养细胞中IL-1α的mRNA表达。以期从分子生物学水平证明，1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的过程中有IL-1的参与。
, 百拇医药
材料和方法
1.成骨细胞获取：取新生的CD-1小鼠颅顶骨，用系列酶消化法获得成骨细胞[4]。
2.长骨骨髓细胞：取6～8周龄的雄性CD-1小鼠股骨，锐剥离去除软组织，以无菌PBS液清洗后纵行剖开股骨，刮出骨髓细胞悬浮于改良基础培养基(αMEM)+10%胎牛血清(FCS)，将107长骨骨髓细胞与105成骨细胞混合培养，置于37℃、5% CO2环境下，加入10-10～-8mol/L 1，25(OH)2D3培养6～7天。每2天更换培养液一次，即可获得大量破骨细胞，该细胞抗酒石酸磷酸酶染色阳性(TRACP+)，多核，降钙素受体阳性。
3.剂量梯度实验：在混合培养细胞内加入10-11～10-8mol/L 1，25(OH)2D3，6天后提取RNA，经RT-PCR (25周期)扩增后，以肌动蛋白(actin)的cDNA为内参照，用Southern法观察IL-1α mRNA的表达[5]。
, 百拇医药
4.时间序列实验：在混合培养细胞内加入10-8 mol/L 1,25(OH)2D3，于第2、4、6天后分别提取RNA，经RT-PCR (25周期)扩增后，以肌动蛋白(actin)的cDNA为内参照，用Southern法观察IL-1α mRNA的表达[5]。
结果
1.剂量梯度实验结果：如图1所示，10-10～10-8mol/L 1，25(OH)2D3可诱导混合培养细胞IL-1α mRNA的表达，mRNA表达的强度与1，25(OH)2D3浓度呈正相关关系。
2.时间序列实验结果：如图2所示，10-8mol/L 1，25(OH)2D3在实验第2、4、6天均可诱导IL-1α mRNA的表达，以第2天mRNA的表达最强。
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讨论
至目前为止，研究结果表明破骨细胞是来源于造血系统的单核细胞。IL-1，1，25(OH)2D3，甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)，PGE2(prostaglandin E2)等生物因子均有诱导破骨细胞生成的作用，不同生物因子的作用之间又存在交叉[6]。Suda等[7]的研究结果表明，IL-1、PTH、PGE2诱导破骨细胞生成与cAMP的产生无关。在以往的研究中我们发现，1，25(OH)2D3可以使混合培养细胞内IL-1α的蛋白含量明显增高，而IL-1受体拮抗剂可以部分阻断1，25(OH)2D3对破骨细胞生成的诱导。提示我们，IL-1参加1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的过程。本项实验结果显示，1，25(OH)2D3可使混合培养细胞的IL-1α mRNA表达，证明了在破骨细胞生成过程中，cAMP途径与非cAMP途径作用的生物因子彼此间存在相互关系。Yamasaki[8]的研究表明，在正畸牙齿移动过程中，牙周组织中的cAMP含量会发生波动，说明cAMP途径的第二信使传导途径参与正畸牙移动过程中组织改建的调节。本项实验结果提示，除cAMP途径以外，其他第二信使传导途径也参与了正畸牙齿移动中组织改建的调节。
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1 为对照组未加入1，25(OH)2D3的混合培养细胞，2～5分别为VitD10-8、VitD10-9、VitD10-10、VitD10-11，代表1，25(OH)2D3的不同浓度，6为阴性对照，7为阳性对照
图1 剂量梯度实验：1，25(OH)2D3诱导IL-1α mRNA表达
1，25(OH)2 D3的浓度为10-8mol/L, N 为阴性对照，P 为阳性对照
图2 时间顺序实验：1，25(OH)2D3在2，4，6天均可诱导IL-1α mRNA的表达
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另外，从时间序列实验中可以看到，1，25(OH)2D3处理的混合培养细胞IL-1α mRNA的表达在第2天最强，第4天和第6天逐渐减弱。以往的研究证明，IL-1有促进破骨细胞前体增殖及破骨细胞分化的作用，而对于成熟细胞IL-1则有抑制作用[2]。Tanaka等[9]将混合培养系破骨细胞的生成过程分为2个阶段，前4天为破骨细胞前体增殖期，后2天为细胞分化。1，25(OH)2D3、PTH及PGE2仅在最后2天处理混合培养细胞就可诱导破骨细胞生成，因而推测这些骨吸收因子只影响破骨细胞前体的分化而不影响其增殖。而我们的观察发现，1，25(OH)2D3促进IL-1α mRNA表达，IL-1α蛋白质含量增加；IL-1受体拮抗剂只能部分阻断1，25(OH)2D3诱导破骨细胞生成的作用[3]。我们推测，1，25(OH)2D3在混合培养细胞的前4天，通过促进IL-1的产生促进破骨细胞前体增殖，而在后2天促进其分化，从两方面起到了诱导破骨细胞生成的作用。 参考文献
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1 Takahashi N, Akatsu T, Udagawa N, et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology, 1988, 123:2600-2602.
2 Gowen M, Mundy GR. Actions of recombinant interleukin 1, interleukin 2 and interferon-r on bone resorption in vitro. J Immunol, 1986, 136:2478-2482.
3 张丁，Lorenzo J. 白细胞介素1参与活性维生素D3对破骨细胞生成的诱导.口腔正畸学杂志，1998，5：7-8.
4 Luben RA, Wong GL, Cohn DV. Biochemical characterization with parathormone and calcitonin of isolated bone cells;provisional identification of osteoclasts and osteoblasts. Endocrinology, 1976, 99:526-534.
, http://www.100md.com
5 Sambrook J, Fritsch EF, Manistis T, 主编.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译.第2版.北京：科学出版社，1992.474-477.
6 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Role of prostaglandins in interleukin-1 -induced bone resorption in mice in vitro. J Bone Miner Res, 1991, 6:183-190.
7 Suda T, Takahashi N, Martin TJ, et al. Modulation of osteoclast differentiation. Endo Rev, 1992, 13:66-80.
8 Yamasaki K. The role of cyclic AMP, calcium, and prostaglandins in the induction of osteoclastic bone resorption associated with experimental tooth movement. J Dent Res, 1983, 62:877-881.
9 Tanaka S, Takahashi N, Udagawa N, et al. Macrophage colony-stimulating factor is indispensable for both proliferation and differentiation of osteoclast progenitors. J Clin Invest, 1993, 91:257-263.
(收稿：1998-02-23 修回：1998-08-10), 百拇医药