白血病患者染色体制备方法的改进
作者：彭 亮 徐 方 陈银涛 礼丰午
单位：彭 亮 徐 方 陈银涛 宁夏医学院生物学教研室 750004; 礼丰午 宁夏科学院附属医院血液科 750004
关键词：
宁夏医学院学报990141 染色体检查是细胞遗传学的重要技术手段，它对白血病的诊断、分型、治疗方法的选择和预后判断有着重要参考价值，对进一步探讨白血病的病因、发生机理等有着实际意义。但由于白血病患者细胞培养物粘性大，各类型白血病细胞周期也不同，所以染色体制备方法一直是国内外学者的目标[1，2]。近两年来，我们结合自己的实践对白血病染色体制备方法进行了改进，取得良好效果，报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 对每一患者分别抽取1～1.5ml外周血及0.5～1.0ml骨髓(均肝素抗凝)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 直接法 将抗凝的材料直接加入到5ml RPMI 1640培养液中吹打均匀，再加秋水仙素(最终浓度0.2μg/ml)处理30min，收集细胞，0.075M氯化钾低渗50min，收集，3∶1甲醇冰乙酸固定3次，常规制片。
1.2.2 培养法 将抗凝材料加入到5ml矹养液中(可分3种时间24、48、72h进行培养)，收获前1～1.5h加秋水仙素(最终浓度为0.2μg/ml)处理，收集细胞同上。
1.2.3 同步化法 将抗凝材料加入到5ml培养液中培养(可进行同上3种时间的培养)，之后再加氨甲喋呤(MTX)(最终浓度为0.1μmol/L)继续培养17h，再用含10μmol/L胸腺嘧啶核苷(Tdr)的培养基换三次液，再继续在此培养基中培养6～8h，秋水仙素处理同方法1。
2 结果
, 百拇医药
2.1 材料比较 对50例患者均采用同一患者的两种不同材料，进行同一方法制备染色体，外周血制备染色体可供分析率为1%～2%，而骨髓细胞制备染色体可供分析率为10%～20%，两者相比，骨髓细胞染色体制备成功率明显优于外周血。
2.2 方法比较 从分裂相数目及染色体形态分散度等方面综合比较认为。
2.2.1 培养法与同步法明显优于直接法
2.2.2 培养法中以48h培养为佳，各种同步法中以MTX/Budr效果好；直接法对不同亚型白血病效果差别大，用于ALL中较其它类型效果好。
3 讨论
白血病患者免疫功能低下，淋转率低，分裂相少，另外相本上常常布有许多类似“膜状”的杂质等，为解决上述问题，作者从选材、接种量、秋水仙素量及作用时间、培养时间、低渗时间等方面控制调节，可优化实验效果。
, 百拇医药
3.1 选材 白血病是骨髓中产生大量异常细胞并由此引起骨髓正常造血功能抑制衰竭，继而进入循环血液[3]，所以以骨髓为材料可直接反映出异常，国内许多学者也曾用骨髓作为材料[4，5]。另外实践中我们感到用骨髓制片成功率优于外周血，而且用量微小，甚至可利用血液科抽骨髓做其它实验之后剩下的空针筒，无菌条件下，以培养液荡洗之后培养即可，对于白细胞数很高，临床病情较重的患者，骨髓成功率也高于外周血。
3.2 培养用量及时间 由于白血病细胞增殖迅速，所以接种量可仅用正常人材料的1/2。培养时间对于各种亚型白血病虽有一定差异，但多数情况下以48h为佳，(直接法对大多数亚型白血病效果不好，而培养法中72h也不好，24h较次于48h)。对于临床上分型不肯定的白血病尤以培养48h较为保险。对于临床上分型已肯定者，急性白血病可缩短培养时间或直接法制备，慢性白血病则要48h或延长到72h。同步法可改善白血病通常染色体短小情况，但也存在培养及收获时给药量及处理时间的控制等条件掌握，虽然效果好，但较繁琐。
, http://www.100md.com
3.3 培养及收获时药量的掌握
3.3.1 PHA(植物血凝集素)在培养法及同步法中加PHA效果优于不加PHA。
3.3.2 秋水仙素 浓度及处理时间控制好，一般浓度可与正常人染色体制备量差不多，但处理时间要缩短1/3为好。
3.3.3 低渗 所用低渗液0.075M氯化钾，处理时要在37℃下50min(比正常人制片时间要长)，这样可以克服分散不好现象。
3.3.4 固定 同正常人制片，也可多一次，但一定要静置过夜后再滴片。
由此我们认为对于白血病患者染色体制备以取微量骨髓进行48h培养更为适宜，有条件者可同时选用同步化法[6]，直接法不宜单独应用。
总之，白血病患者染色体的检查，对于正确诊断，评估白血病有实际意义，因此，根据各实验室实际操作情况，结合其它学者实验不断总结完善一套切实可行的方法是极为重要的。
, 百拇医药
参考文献
1 薛志科，薛永权，林宝爵.骨髓直接法、短期培养法和同步法在白血液染色体分析中的比较.中华医学遗传学杂志，1993.10(2)：102
2 王云英，周 伟，吴哓平.应用外周血制备白血病细胞染色体的几点体会，中国优生与遗传杂志，1995，3(1)：56
3 郁知非，沈 迪.现代血液病学.杭州：浙江科学技术出版社，1992.92
4 王世明，应大明.同步化法技术在白血病骨髓细胞染色体研究中的应用.上海医学，1989，12(2)：384
5 薛永权，陈悦书.急性非淋巴细胞白血病20例的染色体研究，中华内科杂志，1984，23(3)：167
6 陈 涛，高锦声.应用FudR同步化法进行急性原始淋巴细胞白血病细胞遗传学研究.国外医学(遗传分册)，1992，15(4)：225.
收稿日期：1998-03-95，任义芳编辑, http://www.100md.com
单位：彭 亮 徐 方 陈银涛 宁夏医学院生物学教研室 750004; 礼丰午 宁夏科学院附属医院血液科 750004
关键词：
宁夏医学院学报990141 染色体检查是细胞遗传学的重要技术手段，它对白血病的诊断、分型、治疗方法的选择和预后判断有着重要参考价值，对进一步探讨白血病的病因、发生机理等有着实际意义。但由于白血病患者细胞培养物粘性大，各类型白血病细胞周期也不同，所以染色体制备方法一直是国内外学者的目标[1，2]。近两年来，我们结合自己的实践对白血病染色体制备方法进行了改进，取得良好效果，报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 对每一患者分别抽取1～1.5ml外周血及0.5～1.0ml骨髓(均肝素抗凝)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 直接法 将抗凝的材料直接加入到5ml RPMI 1640培养液中吹打均匀，再加秋水仙素(最终浓度0.2μg/ml)处理30min，收集细胞，0.075M氯化钾低渗50min，收集，3∶1甲醇冰乙酸固定3次，常规制片。
1.2.2 培养法 将抗凝材料加入到5ml矹养液中(可分3种时间24、48、72h进行培养)，收获前1～1.5h加秋水仙素(最终浓度为0.2μg/ml)处理，收集细胞同上。
1.2.3 同步化法 将抗凝材料加入到5ml培养液中培养(可进行同上3种时间的培养)，之后再加氨甲喋呤(MTX)(最终浓度为0.1μmol/L)继续培养17h，再用含10μmol/L胸腺嘧啶核苷(Tdr)的培养基换三次液，再继续在此培养基中培养6～8h，秋水仙素处理同方法1。
2 结果
, 百拇医药
2.1 材料比较 对50例患者均采用同一患者的两种不同材料，进行同一方法制备染色体，外周血制备染色体可供分析率为1%～2%，而骨髓细胞制备染色体可供分析率为10%～20%，两者相比，骨髓细胞染色体制备成功率明显优于外周血。
2.2 方法比较 从分裂相数目及染色体形态分散度等方面综合比较认为。
2.2.1 培养法与同步法明显优于直接法
2.2.2 培养法中以48h培养为佳，各种同步法中以MTX/Budr效果好；直接法对不同亚型白血病效果差别大，用于ALL中较其它类型效果好。
3 讨论
白血病患者免疫功能低下，淋转率低，分裂相少，另外相本上常常布有许多类似“膜状”的杂质等，为解决上述问题，作者从选材、接种量、秋水仙素量及作用时间、培养时间、低渗时间等方面控制调节，可优化实验效果。
, 百拇医药
3.1 选材 白血病是骨髓中产生大量异常细胞并由此引起骨髓正常造血功能抑制衰竭，继而进入循环血液[3]，所以以骨髓为材料可直接反映出异常，国内许多学者也曾用骨髓作为材料[4，5]。另外实践中我们感到用骨髓制片成功率优于外周血，而且用量微小，甚至可利用血液科抽骨髓做其它实验之后剩下的空针筒，无菌条件下，以培养液荡洗之后培养即可，对于白细胞数很高，临床病情较重的患者，骨髓成功率也高于外周血。
3.2 培养用量及时间 由于白血病细胞增殖迅速，所以接种量可仅用正常人材料的1/2。培养时间对于各种亚型白血病虽有一定差异，但多数情况下以48h为佳，(直接法对大多数亚型白血病效果不好，而培养法中72h也不好，24h较次于48h)。对于临床上分型不肯定的白血病尤以培养48h较为保险。对于临床上分型已肯定者，急性白血病可缩短培养时间或直接法制备，慢性白血病则要48h或延长到72h。同步法可改善白血病通常染色体短小情况，但也存在培养及收获时给药量及处理时间的控制等条件掌握，虽然效果好，但较繁琐。
, http://www.100md.com
3.3 培养及收获时药量的掌握
3.3.1 PHA(植物血凝集素)在培养法及同步法中加PHA效果优于不加PHA。
3.3.2 秋水仙素 浓度及处理时间控制好，一般浓度可与正常人染色体制备量差不多，但处理时间要缩短1/3为好。
3.3.3 低渗 所用低渗液0.075M氯化钾，处理时要在37℃下50min(比正常人制片时间要长)，这样可以克服分散不好现象。
3.3.4 固定 同正常人制片，也可多一次，但一定要静置过夜后再滴片。
由此我们认为对于白血病患者染色体制备以取微量骨髓进行48h培养更为适宜，有条件者可同时选用同步化法[6]，直接法不宜单独应用。
总之，白血病患者染色体的检查，对于正确诊断，评估白血病有实际意义，因此，根据各实验室实际操作情况，结合其它学者实验不断总结完善一套切实可行的方法是极为重要的。
, 百拇医药
参考文献
1 薛志科，薛永权，林宝爵.骨髓直接法、短期培养法和同步法在白血液染色体分析中的比较.中华医学遗传学杂志，1993.10(2)：102
2 王云英，周 伟，吴哓平.应用外周血制备白血病细胞染色体的几点体会，中国优生与遗传杂志，1995，3(1)：56
3 郁知非，沈 迪.现代血液病学.杭州：浙江科学技术出版社，1992.92
4 王世明，应大明.同步化法技术在白血病骨髓细胞染色体研究中的应用.上海医学，1989，12(2)：384
5 薛永权，陈悦书.急性非淋巴细胞白血病20例的染色体研究，中华内科杂志，1984，23(3)：167
6 陈 涛，高锦声.应用FudR同步化法进行急性原始淋巴细胞白血病细胞遗传学研究.国外医学(遗传分册)，1992，15(4)：225.
收稿日期：1998-03-95，任义芳编辑, http://www.100md.com