牙齿发育中程序性细胞死亡的研究
作者：赵书芳 金 岩 赵 皿 杨连甲
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：牙胚；程序性细胞死亡；发育；原位末端标记
牙齿发育中程序性细胞死亡的研究 摘要 目的: 阐明程序性细胞死亡在牙齿发生、发育过程中的意义。方法：采用原位末端标记法(TUNEL法)及HE染色技术，对纯系SD大鼠牙胚发育不同阶段的程序性细胞死亡现象进行观察。结果：在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期均有程序性细胞死亡现象。蕾状期主要出现在上皮细胞增殖内陷形成的蕾状突起的顶端，帽状期、钟状早期集中出现在细胞增殖生长中心(原发性釉结节，颈环)处，钟状晚期及牙体组织形成后成釉器星网层及牙乳头细胞中多见，外釉上皮及已分化的成釉细胞、成牙本质细胞中散在。结论：在牙齿发育形成过程中，程序性细胞死亡参与上皮-间充质相互作用。控制着不同状态下细胞增生的数量，及时清除多余细胞，完成其对牙齿发育的重要塑形作用。
, http://www.100md.com
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0058-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：58]
Role of programmed cell death in the development of tooth
Zhao Shufang, Jin Yan, Zhao Min et al
School of Stomoatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To investigate the role of programmed cells death (PCD) in development of tooth. Methods: PCD was detected by TdT-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) in different stages of tooth development of SD rat. Results: The TUNEL showed that there was consistent PCD present in the bud stage, cap stage and bell stage. The PCD appeared at the top of concave surface of bud stage ,and proliferative growth center (primary enamel knot and dental cervical loop) in the cap stage and earlier bell stage. PCD was also detected in the degenerated stellate reticulum cells of enamel organ and dental papilla, and was also detected scarcely in the differentiated ameloblast and odonfoblast in the late bell stage. Conclusions: PCD was involved in the interaction of epithelial-mesenchymal, and controlled the cell numbers of both proliferation and differentiation, which contributed to the sculpture of the shape of developmental teeth.
, 百拇医药
Key words tooth germ；programmed cell death；development；TUNEL
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):58]
程序性细胞死亡(programmed cell death,简称 PCD)是细胞在基因调控下的一种生理性自然死亡现象，是细胞死亡的一种特殊形式。已证实在胚胎发育、器官形成过程及器官自身平衡的维持中有重要的调控作用[1～3]。关于PCD在骨骼、关节、胸腺、肾脏等的发育中的作用已有许多报道[4]，但在牙齿发育中PCD出现的规律及其意义尚未有明确的认识。为此，本研究拟利用SD大鼠模型，采用原位末端标记法(TUNEL法)较系统的观察和分析SD大鼠牙齿发育过程中的PCD作用。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 动物模型建立
选用纯系雌雄SD大鼠各20只，3月龄，体重220～250g，上海实验动物中心提供。每日随机按4:1雌雄比例同笼，次日早8:00观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0d标记后隔离饲养，记录生长情况。
1.2 标本制备
取妊娠SD雌鼠分别于11,13,15,17,19,21d及生后1,3,5,7d宰杀后剖腹取其胎鼠头部，固定在40g/L多聚甲醛溶液中。
1.3 形态学观察
将固定在40g/L多聚甲醛溶液中的胎鼠头部标本，系列乙醇脱水，石蜡定向包埋，行冠状和矢状面5μm厚切片，HE染色，光镜观察。
1.4 原位末端标记(TUNEL)法
, 百拇医药
切片脱蜡至水，PBS洗涤后用蛋白酶K 20mg/L 37℃消化30min，30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶，加平衡Buffer，然后再加TdT酶，37℃孵育2h，加预热终止buffer , 37℃,30 min，20ml/L正常羊血清 37℃,10 min,封闭非特异性结合位点, 抗地高辛抗体37℃孵育2h，5-溴-4氯-3-吲哚盐+硝基蓝四唑盐(BCIP+NBT)显色，伊红衬染胞浆，脱水，透明，封片。
2 结果
HE及TUNEL 染色结果。
胚胎11d，可见口腔上皮细胞增生内陷呈蕾状突起，胞核圆形、卵圆形，上皮突起中轴区有数个散在星形细胞，细胞轮廓清楚，可见核分裂相。TUNEL染色显示PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状突起头部。邻近间充质细胞增生活跃，偶见PCD阳性细胞(图1)。
, http://www.100md.com
图1 PCD阳性细胞集中在蕾状突起头部(TUNEL法 40×3.7)
胚胎13d，蕾状突起外围上皮细胞增殖呈矮柱状，中轴区星形细胞增多，PCD阳性细胞散在其中，其余部位偶见。
胚胎15d，帽状期，细胞增生活跃，外胚间充质细胞已开始形成牙乳头和牙囊。PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域(原发性釉结节)，及成釉器两端内外釉上皮细胞增殖形成的颈环处，余者散在(图2)。
图2 PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域(原发性釉结节)(TUNEL法 40×6.7)
胚胎17d，钟状早期；成釉器、牙乳头和牙囊已形成，成釉器生长中心处内釉上皮细胞已偏极，分化为前期成釉细胞，相应部位的牙乳头细胞已分化为前期成牙本质细胞， PCD阳性细胞明显增多，主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处,,其余部位散在(图3)。
, http://www.100md.com
图3 PCD阳性细胞集中在成釉器的颈环处(TUNEL法 40×15)
胚胎19d，钟状期,成牙本质细胞已分化，开始分泌牙本质基质, 成釉器的内釉上皮细胞已分化为成釉细胞，在成牙本质细胞及成釉细胞中有散在的PCD阳性细胞，而星网层细胞及牙乳头间充质细胞中多见(图4)。
图4 PCD阳性细胞散在于成牙本质细胞及成釉细胞中(TNUEL法 40×3.7)
生后1d，牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质均已开始形成, 成釉器逐渐萎缩，PCD阳性细胞在星网层细胞多见,间充质细胞少见，其余偶见。
生后3d，牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加, 成釉器不断萎缩, PCD阳性细胞集中在成釉器的星网层细胞及间充质细胞中,其余部位少见。
, http://www.100md.com
生后5d，牙体组织形成期， 牙本质、牙釉质基质进一步钙化形成, 成釉器进一步萎缩, PCD阳性细胞逐渐减少。
生后7d，牙体组织形成期，随着基质钙化形成， 牙胚各部分细胞成分明显减少, PCD阳性细胞也少见。
3 讨论
程序性细胞死亡也称细胞凋亡(apoptosis)。是1972年Kerr及其同事首先为描述一类特殊的生理性细胞死亡的形态学特征而提出的。凋亡细胞的形态特征为:细胞皱缩,核内染色质凝聚,细胞核固缩,细胞膜发泡式外突,细胞解离,最后细胞裂解成多个由膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies),由巨噬细胞及邻近的其它细胞所吞噬。而其生化特征为:核酸内切酶激活,DNA在核小体之间被切断,形成180～200bp的寡核苷酸片段,产生与DNA断点数目相同的3′羟基末端。而PCD主要是强调功能的概念, 用于揭示细胞凋亡的机制，多用于描述在胚胎发育、个体成熟等复杂的生理及病理过程中，在特定的时间、空间所发生的一种主动接受基因调控的程序性细胞死亡。但是，这种凋亡细胞并不都呈现特征性形态改变。因此，导致了普通形态学方法观察的困难，本研究所采用的原位末端标记法，利用末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP特异性标记在3’羟基末端，再用酶标记地高辛抗体显色，将特异显示PCD改变[5]。
, http://www.100md.com
结果表明；PCD是牙齿胚胎发育过程中上皮-间充质相互作用所发生的一系列细胞反应中的重要调控机制。首先当上皮信号分子一出现，上皮细胞增殖、内陷形成蕾状上皮性突起，这时PCD活跃在上皮性生长中心蕾状突起的头部，说明PCD调控着细胞增殖，控制着上皮性成釉器的雏形。当信号向间充质传导，诱导间充质细胞增殖，形成间充质细胞凝集区，牙乳头、牙囊开始形成，此时，PCD又出现在帽状成釉器中以内釉上皮凹面中心为主的生长中心(原发性釉结节)及颈环处，提示PCD在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根部的形成，使牙胚不断发育扩大的同时得以塑形。随着上皮-间充质相互诱导，成釉细胞、成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，钟状期及牙体组织形成期，PCD主要清除已经结束生命周期的衰老的多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消除釉结节及星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCD参与上皮-间充质相互作用，及时调控着细胞的增殖数量，及时清除异常、衰老的细胞及暂时性结构。在牙齿形态形成过程中，发挥重要的塑形作用
参考文献
, 百拇医药
1 Michael D， Weil JM, Raff MC.Programmed cell death in animal development.Cell,1997,88:347
2 Sanders EJ, Wride MA.Programmed cell death in development. Int Rev Cytol,1995,163:105
3 木崎治俊. ァポト-シスと疾患. 医学のあゅみ, 1996,178(10):712
4 Taniguchi K, Sato N , Uchiyama Y. Apoptosis and heterophagy of medial edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol,1995, 58(2):191
6 Kerr JFR, Wyllie AH , Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Brit J Cancer, 1972, 26:239
收稿日期：1998-06-18, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：牙胚；程序性细胞死亡；发育；原位末端标记
牙齿发育中程序性细胞死亡的研究 摘要 目的: 阐明程序性细胞死亡在牙齿发生、发育过程中的意义。方法：采用原位末端标记法(TUNEL法)及HE染色技术，对纯系SD大鼠牙胚发育不同阶段的程序性细胞死亡现象进行观察。结果：在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期均有程序性细胞死亡现象。蕾状期主要出现在上皮细胞增殖内陷形成的蕾状突起的顶端，帽状期、钟状早期集中出现在细胞增殖生长中心(原发性釉结节，颈环)处，钟状晚期及牙体组织形成后成釉器星网层及牙乳头细胞中多见，外釉上皮及已分化的成釉细胞、成牙本质细胞中散在。结论：在牙齿发育形成过程中，程序性细胞死亡参与上皮-间充质相互作用。控制着不同状态下细胞增生的数量，及时清除多余细胞，完成其对牙齿发育的重要塑形作用。
, http://www.100md.com
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0058-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：58]
Role of programmed cell death in the development of tooth
Zhao Shufang, Jin Yan, Zhao Min et al
School of Stomoatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim: To investigate the role of programmed cells death (PCD) in development of tooth. Methods: PCD was detected by TdT-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) in different stages of tooth development of SD rat. Results: The TUNEL showed that there was consistent PCD present in the bud stage, cap stage and bell stage. The PCD appeared at the top of concave surface of bud stage ,and proliferative growth center (primary enamel knot and dental cervical loop) in the cap stage and earlier bell stage. PCD was also detected in the degenerated stellate reticulum cells of enamel organ and dental papilla, and was also detected scarcely in the differentiated ameloblast and odonfoblast in the late bell stage. Conclusions: PCD was involved in the interaction of epithelial-mesenchymal, and controlled the cell numbers of both proliferation and differentiation, which contributed to the sculpture of the shape of developmental teeth.
, 百拇医药
Key words tooth germ；programmed cell death；development；TUNEL
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999;9(1):58]
程序性细胞死亡(programmed cell death,简称 PCD)是细胞在基因调控下的一种生理性自然死亡现象，是细胞死亡的一种特殊形式。已证实在胚胎发育、器官形成过程及器官自身平衡的维持中有重要的调控作用[1～3]。关于PCD在骨骼、关节、胸腺、肾脏等的发育中的作用已有许多报道[4]，但在牙齿发育中PCD出现的规律及其意义尚未有明确的认识。为此，本研究拟利用SD大鼠模型，采用原位末端标记法(TUNEL法)较系统的观察和分析SD大鼠牙齿发育过程中的PCD作用。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 动物模型建立
选用纯系雌雄SD大鼠各20只，3月龄，体重220～250g，上海实验动物中心提供。每日随机按4:1雌雄比例同笼，次日早8:00观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0d标记后隔离饲养，记录生长情况。
1.2 标本制备
取妊娠SD雌鼠分别于11,13,15,17,19,21d及生后1,3,5,7d宰杀后剖腹取其胎鼠头部，固定在40g/L多聚甲醛溶液中。
1.3 形态学观察
将固定在40g/L多聚甲醛溶液中的胎鼠头部标本，系列乙醇脱水，石蜡定向包埋，行冠状和矢状面5μm厚切片，HE染色，光镜观察。
1.4 原位末端标记(TUNEL)法
, 百拇医药
切片脱蜡至水，PBS洗涤后用蛋白酶K 20mg/L 37℃消化30min，30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶，加平衡Buffer，然后再加TdT酶，37℃孵育2h，加预热终止buffer , 37℃,30 min，20ml/L正常羊血清 37℃,10 min,封闭非特异性结合位点, 抗地高辛抗体37℃孵育2h，5-溴-4氯-3-吲哚盐+硝基蓝四唑盐(BCIP+NBT)显色，伊红衬染胞浆，脱水，透明，封片。
2 结果
HE及TUNEL 染色结果。
胚胎11d，可见口腔上皮细胞增生内陷呈蕾状突起，胞核圆形、卵圆形，上皮突起中轴区有数个散在星形细胞，细胞轮廓清楚，可见核分裂相。TUNEL染色显示PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状突起头部。邻近间充质细胞增生活跃，偶见PCD阳性细胞(图1)。
, http://www.100md.com
图1 PCD阳性细胞集中在蕾状突起头部(TUNEL法 40×3.7)
胚胎13d，蕾状突起外围上皮细胞增殖呈矮柱状，中轴区星形细胞增多，PCD阳性细胞散在其中，其余部位偶见。
胚胎15d，帽状期，细胞增生活跃，外胚间充质细胞已开始形成牙乳头和牙囊。PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域(原发性釉结节)，及成釉器两端内外釉上皮细胞增殖形成的颈环处，余者散在(图2)。
图2 PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域(原发性釉结节)(TUNEL法 40×6.7)
胚胎17d，钟状早期；成釉器、牙乳头和牙囊已形成，成釉器生长中心处内釉上皮细胞已偏极，分化为前期成釉细胞，相应部位的牙乳头细胞已分化为前期成牙本质细胞， PCD阳性细胞明显增多，主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处,,其余部位散在(图3)。
, http://www.100md.com
图3 PCD阳性细胞集中在成釉器的颈环处(TUNEL法 40×15)
胚胎19d，钟状期,成牙本质细胞已分化，开始分泌牙本质基质, 成釉器的内釉上皮细胞已分化为成釉细胞，在成牙本质细胞及成釉细胞中有散在的PCD阳性细胞，而星网层细胞及牙乳头间充质细胞中多见(图4)。
图4 PCD阳性细胞散在于成牙本质细胞及成釉细胞中(TNUEL法 40×3.7)
生后1d，牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质均已开始形成, 成釉器逐渐萎缩，PCD阳性细胞在星网层细胞多见,间充质细胞少见，其余偶见。
生后3d，牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加, 成釉器不断萎缩, PCD阳性细胞集中在成釉器的星网层细胞及间充质细胞中,其余部位少见。
, http://www.100md.com
生后5d，牙体组织形成期， 牙本质、牙釉质基质进一步钙化形成, 成釉器进一步萎缩, PCD阳性细胞逐渐减少。
生后7d，牙体组织形成期，随着基质钙化形成， 牙胚各部分细胞成分明显减少, PCD阳性细胞也少见。
3 讨论
程序性细胞死亡也称细胞凋亡(apoptosis)。是1972年Kerr及其同事首先为描述一类特殊的生理性细胞死亡的形态学特征而提出的。凋亡细胞的形态特征为:细胞皱缩,核内染色质凝聚,细胞核固缩,细胞膜发泡式外突,细胞解离,最后细胞裂解成多个由膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies),由巨噬细胞及邻近的其它细胞所吞噬。而其生化特征为:核酸内切酶激活,DNA在核小体之间被切断,形成180～200bp的寡核苷酸片段,产生与DNA断点数目相同的3′羟基末端。而PCD主要是强调功能的概念, 用于揭示细胞凋亡的机制，多用于描述在胚胎发育、个体成熟等复杂的生理及病理过程中，在特定的时间、空间所发生的一种主动接受基因调控的程序性细胞死亡。但是，这种凋亡细胞并不都呈现特征性形态改变。因此，导致了普通形态学方法观察的困难，本研究所采用的原位末端标记法，利用末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP特异性标记在3’羟基末端，再用酶标记地高辛抗体显色，将特异显示PCD改变[5]。
, http://www.100md.com
结果表明；PCD是牙齿胚胎发育过程中上皮-间充质相互作用所发生的一系列细胞反应中的重要调控机制。首先当上皮信号分子一出现，上皮细胞增殖、内陷形成蕾状上皮性突起，这时PCD活跃在上皮性生长中心蕾状突起的头部，说明PCD调控着细胞增殖，控制着上皮性成釉器的雏形。当信号向间充质传导，诱导间充质细胞增殖，形成间充质细胞凝集区，牙乳头、牙囊开始形成，此时，PCD又出现在帽状成釉器中以内釉上皮凹面中心为主的生长中心(原发性釉结节)及颈环处，提示PCD在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根部的形成，使牙胚不断发育扩大的同时得以塑形。随着上皮-间充质相互诱导，成釉细胞、成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，钟状期及牙体组织形成期，PCD主要清除已经结束生命周期的衰老的多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消除釉结节及星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCD参与上皮-间充质相互作用，及时调控着细胞的增殖数量，及时清除异常、衰老的细胞及暂时性结构。在牙齿形态形成过程中，发挥重要的塑形作用
参考文献
, 百拇医药
1 Michael D， Weil JM, Raff MC.Programmed cell death in animal development.Cell,1997,88:347
2 Sanders EJ, Wride MA.Programmed cell death in development. Int Rev Cytol,1995,163:105
3 木崎治俊. ァポト-シスと疾患. 医学のあゅみ, 1996,178(10):712
4 Taniguchi K, Sato N , Uchiyama Y. Apoptosis and heterophagy of medial edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol,1995, 58(2):191
6 Kerr JFR, Wyllie AH , Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Brit J Cancer, 1972, 26:239
收稿日期：1998-06-18, 百拇医药