间接免疫识别在器官移植免疫中的作用
作者：刘玉杉 董 刚*
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心 上海，200003
关键词：间接免疫识别；排斥反应；免疫耐受
肾脏病与透析肾移植杂志990125 刘玉杉 董 刚* 综述 闵志廉 审校
同种反应性T细胞识别种间MHC差异是引发排斥反应的关键。对于免疫识别的认识，Lechler和Batchelor[1]早在80年代初期就已提出两种完全不同的同种识别途径：直接识别(direct allorecognition)和间接识别(indirect allorecognition)。人们不仅认识到同种反应性T细胞识别由供者抗原呈递细胞(APCs)呈递完整的同种MHC分子(直接识别)导致排斥反应的发生，但也认识到移植建立后，供者过路白细胞经直接识别被宿主体内清除后，可产生一定程度的耐受，但进行性的移植物功能丧失仍在持续[2]；临床观察到：排斥发生时，移植器官内供体APCs被受体APCs所替换(turn over)的现象[3]，这些证据表明受体APCs介导的间接识别可能作为一种重要的免疫驱动力，可介导慢性排斥反应，影响移植的长期结果。近来研究表明，间接识别在慢性排斥反应，抗体介导的排斥反应方面可能具有决定性作用[3，4]。
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1 间接识别的概念与特点
间接识别是指宿主自身APCs加工和呈递供者特异性抗原肽，结合于宿主细胞表面MHC分子的抗原结合槽内，供T细胞识别。
综述近年来关于间接识别不同模型的实验与临床研究结果，我们认为间接识别有以下几个方面的特点。
1.1 供体MHC抗原肽的特点 受体APCs所呈递供体MHC抗原肽含有宿主和供体MHC分子差异的一个和数个主要MHC分子表位。宿主APCs表面MHCⅠ类、Ⅱ类分子抗原结合槽内结合的供体抗原肽的长度一般有15个氨基酸左右，且具有免疫决定簇基序(motif)，是MHC基因多态区不相容位点编码的。人们可依据大鼠、小鼠和人的MHC分子氨基酸序列人工合成这些肽。Catherine等[5]人工合成了对应于小鼠MHCⅠ类分子Aa的α1、α2链的α-螺旋区肽链的P1和P2肽，二肽包括了不同小鼠MHC类Aa分子氨基酸序列的大多数的差异，总长度为21～24个氨基酸，包括N未端酪氨酸位点。把P1、P2肽免疫PVG(RTu1)小鼠(对MHC Ⅰ类Aa分子有高反应性)，小鼠对有Aa分子差异的PVG.R8移植鼠心产生了快速排斥。Waaga[3]等利用人工合成的对应于RT1小鼠Duβ链20～33和31～44序列的抗原肽免疫同种小鼠，体外、体内实验均证实可产生针对抗原肽的不同的CD+4Th细胞克隆的增殖反应，且可传递体内延迟型超敏反应(Delayed-type Hypersensitive Reaction，DTH)。在皮肤移植模型中，发现不同细胞毒性淋巴细胞(CTL)谱系可识别供受体次要组织相容性抗原(minor histocompatibitity antigen mHA)抗原肽的差异，差异性抗原肽的数目>40个[6]。在Hb2相合的C57BL/6(Hc2)受者和BALB.B供者(Hb2)组合，发现Kb分子呈递的CTT-2及CTT-5肽可被所有细胞毒性淋巴细胞(CTL)谱系所识别。由于mHA具有重要的临床意义，CTL谱系仅识别特定的次要组织相容抗原MHA抗原肽基序可能是一个有意义的发现。
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1.2 专职宿主抗原呈递细胞加工和呈递同种抗原肽 间接识别的同种抗原肽的加工和呈递是由受体抗原呈递细胞完成的，一般认为同种抗原肽呈递于MHCⅡ类分子的抗原结合槽(groove)内供CD4+T细胞识别，是间接识别的主要方式，但有些证据表明MHC-Ⅰ类分子呈递的抗原肽也可能参与间接识别，引起特异性CD8+T细胞活化。MHCⅠ类和Ⅱ类分子代表不同抗原呈递方式：即内源肽和外源肽加工方式。
1.2.1 MHCⅠ类分子呈递方式[7] 此方式的抗原肽多为内源性抗原。抗原首先在胞质内须经Ⅰ型蛋白水解后分解成抗原肽，被抗原呈递复合物(transporter associated with antigen processing，TAP)运输至粗面内质网(ER)。TAP分为TAP1和TAP2两个亚型，抗原肽的大小一般为8～12个氨基酸时运输效率最高。抗原肽在粗面内质网(ER)内与MHCⅠ类分子结合。mHCⅠ类分子X线衍射分析表明：α1、α2的抗原结合区可形成A～F六个抗原结合口袋(peptide bind pockets)，A区对应抗原肽的N末端，F区对应抗原肽的C’末端，B、C、D、E四区参与识别，池序列(pool sequeacing)特异性与抗原肽基序(motif)的电荷、极性决定的亲和性和解离率有关。特异性的正确装配(assembly)决定CD8+和CTL特异性识别。在运输至细胞表面时，需水解保护剂对抗原肽基序加以锁定。
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1.2.2 MHCⅡ类分子呈递方式 MHCⅡ类分子呈递方式加工和呈递的多为外源性抗原，通过内吞和吞噬作用分别处理可溶性抗原及蛋白结合颗粒，与MHCⅠ类分子方式有不同的胞质内过程。在许多粘附分子协同下完成对CD4+T细胞的呈递。间接识别主要以此方式呈递抗原肽，详细机制尚待阐明。
近时期来，主要的抗原呈递细胞—树突状细胞(dendritic cell)的抗原呈递作用，尤其是间接识别方面，引起人们的关注。Sternman等[8]发现，移植物内存留的供者树突状细胞(DC)和加工游离供者抗原参与间接识别的宿主树突状细胞前体(DC processor)均须迁移至围移植物的T细胞，细胞因子丰富的层粘蛋白(LN)区才能成为专职的APC，树突状细胞前体(DCp)需围移植物的LN微环境存留的T细胞和NK细胞分泌的细胞因子以支持成熟。
1.2.3 间接识别具有MHC限制性 受体同种反应性T细胞识别自身抗原呈递细胞呈递的抗原肽首先须识别APC自身MHC。
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1.2.4 参与间接识别的同种反应性T细胞的限制性 来源于免疫动物和排斥动物的同种抗原肽特异性CD4+T细胞克隆，表达限定的TCRVβ家族分子，识别差异性抗原肽单个或多个表位。Liu[9]和Chun[10]等利用RT1Duβ20～44同种抗原肽致敏lewis大鼠，产生表达TCR Vβ9，TCRVβ13.2的Th1克隆。对表达TCRVβ9和Vβ13.2的T细胞克隆输给幼稚Lewis大鼠可引发其对RT1Duβ20～44和同族WF大鼠(RTIu)脾细胞的延迟型超敏反应(DTH)。体外实验证实：RT1Duβ21～31肽，β(21～44)肽及β(31～44)肽可分别诱生表达TCRVβ9，4，13.2Th细胞克隆。而排斥动物模型中，针对该肽的T细胞克隆包含所有上述的表达限定于TCRVβ分子的特异性T细胞克隆，说明在排斥状况下，APCs对移植物同种抗原的特异性抗原基序加工和呈递的自然过程。T细胞活化是由TCR表达密度，TCR和配体亲和力及肽：MHC复合物的浓度决定的表达亲和性所决定的。MHC：肽复合物与TCR结合构成三分子复合物，CD8分子作为TCR的协同受体(co receptor)或内在受体(intrinsic receptor)构成稳定的复合物，对CD8+CTL抗原识别的特异性影响很大[11]。
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1.2.5 间接识别途径引起的免疫效应的强度(Avidity)一般较直接识别为低 Liu等在实验中发现，直接识别产生同种反应性T细胞占T细胞总数的1%～10%，而间接识别仅占0.1%左右。经间接识别HLA-DR抗原的活化T细胞数目较直接识别低100倍[12]。间接识别引发的抗体介导的排斥反应强度为中等强度[13]，仍足以破坏移植物。
2 间接识别与排斥
一般认为间接识别引起排斥的相关变量涉及：①移植类型；②受者的致敏状态；③MHC分子差异的性质(不相容位点及数目)；④具有直接和间接同种特异性T细胞对外源免疫抑制因素的相对敏感性。证据表明间接识别在慢性排斥反应及抗原介导的排斥反应中可能具有决定性作用[3，5，6]。在慢性排斥的心脏移植患者，Hornick等对直接识别供者抗原的特异性同种反应性T细胞(HTL)和毒性T细胞(CTL)在供者特异性耐受方面的作用进行半定量化分析，用有限解释法对CTL和HTL进行半定量分析，发现移植患者体内直接抗供者特异性的低反应。50个患者体内外周血HTL计数和CTL计数(HTLf和CTLf)均<1：105，与对照组差异显著(P<0.001)。说明渐进性移植心功能丧失，并非由直接识别引起，间接识别是主要原因。一些实验提示，间接识别对一些急性排斥反应起部分作用。有人[14]用50例心脏移植的患者外周血与供者APC和人工合成的供受者HLA-DR不相容位点抗原肽的反应进行了观察：以CD69作为T细胞活性标记，有限稀释法测定对同种肽的反应性，发现直接识别和间接识别均参与了初次急性排斥反应，但以直接识别为主，伴随间接识别其中一个决定同种肽；在再发排斥中，存在T细胞表位分子间传递现象。一般认为，间接识别刺激CD4+T细胞活化增殖，进而诱发DTH反应，细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应及T细胞辅助B细胞产生特异的同种抗体，是间接识别诱发排斥的效应机制[3]。
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2.1 延迟性超敏反应(DTH) DTH反应是一种预先对同种抗原致敏的回忆反应，晚期病理变化与急性排斥反应相似，但发病机制不同，DTH反应可在远离移植物的抗原沉积位点引发。反应早期，一定量的致敏同种反应性T细胞经与自身APCs的MHC性分子呈递的同种抗原肽接触激活，产生Th1反应，释放IL-2、IFN-γ，进一步活化T细胞和巨噬细胞，释放细胞因子，炎性介质和其它因子引起组织损伤[13]。Dalloul等[15]发现CD4+T细胞对MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类差异性靶细胞无细胞毒性，但经间接识别MHCⅠ类同种靶分子目标，活化产生Th1细胞因子(无IL-4)。Hd2CD8-/-小鼠可排斥缺乏Ⅰ和Ⅱ类抗原的Hb2同种移植皮肤。从CD8-/-小鼠提取CD4+T细胞输入已接受皮肤移植的裸鼠，可排斥mHC Ⅱ和Ⅰ类分子存在差异移植皮肤，说明CD4+T细胞单纯通过产生DTH反应引起排斥，且可传递。Waaga等利用lewis大鼠(RT1)产生针对MHC不相容的Wistar Furth大鼠移植肾的急性排斥，可从Lewis大鼠脾和肾脏提出针对RT1Duβ20～44特定肽的特异性CD4Th克隆，并表达TCRVβ9、TCRVβ13、2。在以完整的RT1Duβ20～44MHCⅡ类分子刺激时，可引起针对该分子的DTH反应。而表达TCRVβ4的T细胞克隆则无反应。这种Th1细胞克隆经识别RT1Duβ20～44、β31～44肽上的单个氨基酸表型差异。
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2.2 CTL反应 体外研究说明毒性T淋细胞的产生有两个途径：CD4+依赖性途径和CD8+T细胞对MHCⅠ类抗原直接识别途径[16]。Lee等[17]利用小鼠体内应用抗CD8单抗去除CD8+T细胞后，接受缺乏MHCⅡ类分子的同种皮肤移植，产生了快速排斥反应。移植前用流式细胞仪证明受者体内CD8+T细胞已基本消除，但移植后仍然产生对供者MHCⅠ类分子敏感的CD8+CTL，提示CD4+Th细胞间接识别自身抗原呈递细胞表面MHCⅡ类抗原呈递的同种抗原肽致敏后，辅助同种肽特异性CD8+CTL产生。Manning等[18]对间接途径体内生成CD8+CTL反应的最低条件进行了探讨。利用2C-TCR基因转染小鼠RAG(-/-)(只存在CD8+特异性CTL)。体内注射MHC段肽可导致2C-TCR/RAG(-/-)小鼠T细胞活性升至很高水平，发现阻断B7协同刺激信号，小鼠仍排斥携带适宜抗原肽/MHC配体P2C/Ld肿瘤，提示：同种排斥可在无B7介导协同刺激和无CD4+T细胞存在的情况下发生。在排斥时，肿瘤位点分离的CTLs表达激活标志CD25，且可介导体外溶解带有适宜抗原的肿瘤细胞。说明大量CTL前体可在无B7-CD28协同刺激和无CD4+T细胞帮助下发育成CD8+。特异性CTL细胞直接识别次要组织相容性抗原(mHA)在慢性排斥反应具有重要作用，已证实H2杂交受者经间接途经有效致敏产生mHA特异性CTL反应。Nevala等[6]对杂交受者mHA的交叉致敏(cross priming)即间接识别的特异性，与直接识别作了对比研究，利用Theralyte免疫分离装置将(B57BL/6×B6C-H12)F1的T细胞和BALB、B、BALB/C脾细胞放入0.4 μm分离孔，受者效应性细胞经此装置交叉致敏，产生针对BAIB、B、BALB，C特异性CTLs。利用C×B重组近交株表达不同排列BALB/C mHA抗原分子靶标，对BALB、B小鼠的Kb和Db分子呈递分数的高生成性液相染色分析证明：抗BALB.B大鼠CTLs特异性针对已知抗原肽CTT-2，CTT-5。改变效应细胞和刺激细胞，结果相同，类似加速性皮肤移植排斥模型中CTL对同种肽的识别状况，因此说明，CTL间接识别特异性mHA肽段与CTL直接识别mHA的肽段(如CTL-2，CTL-5)是相同的。
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2.3 抗体介导的排斥反应 CD4+T细胞依赖性同种反应性抗体单独可引起移植物的破坏，当供受者存MHCⅡ类分子的差异时，CD4T细胞经同族(Cognate)T-B细胞协同，辅助B细胞产生同种抗体IgG。大鼠体内应用Ⅰ类Aa衍生肽人工合成肽P1、P2经受者APC呈递后供CD4+T细胞间接识别，当再遇完整Ⅰ类差异性Aa分子可有效辅助B细胞功能和强化同种抗体效应。合成P1、P2肽分别对应于PVG RTu1大鼠Aaα螺旋区57-80、143-163氨基酸座位。RT1大鼠经P1P2肽接种后，可产生对Aa差异性PVG1.R8大鼠移植心强烈的排斥反应及增强的抗Aa特异性抗体反应，每个肽P1和P2至少包含一个或多个主要T-B协同的决定的决定簇基序或表位。Benham等[19]观察了2例未产生Ⅰ类分子抗体的长期存活心脏移植大鼠(>100天)和1例用人工合成的对应DAⅠ类分子一个区域的肽(已知此肽可被CD4+Th细胞所间接识别)接种的长期存活者。这三个长期存活者，均无排斥反应，接种致敏者也未产生抗供者Ⅰ类MHC抗原肽的抗体，B细胞(具有潜在针对完整供者MHCⅡ类分子抗原肽产生抗体的能力)保持静态。原因可能由于可逆性T细胞抑制和无能，不能对B细胞产生辅助；另一种原因可能是B细胞对致敏MHCⅠ分子无反应性(无能或耐受)。
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3 间接识别与耐受
在一些间接识别的模型中已成功诱导了一定程度的耐受。了解间接识别的机制与过程，可建立有效阻断同种免疫应答的方法，诱导耐受，因而具有潜在的应用价值。
3.1 干扰专职抗原呈递细胞成熟 据报告[20～22]以Aa衍生的同种抗原肽为靶目标，由缺乏协同刺激信号(Costimulator)活性的APC呈递给CD4+T细胞，可诱导T细胞无反应(nonreactive)和不能给B细胞以有效帮助。作为主要抗原呈递细胞的树突状细胞的成熟对间接抗原呈递是关键因素。在新生动物移植耐受模型(neonatal tolerance)中，发现反应性T细胞数目较低和未成熟的树突状细胞为主的APCs之间有一精致的平衡，需要适宜的无危险间质(undanger milieu)(可传递抗原信号使T细胞增殖但无协同刺激)，可诱导稳定的耐受。树突状细胞前体(DCp)奉命一般为数天至数周左右，在此时间内抑制前炎症细胞因子(proinflammatory cytokine)可导致树突状细胞前体数目呈不可逆的下降。在环孢素时代的移植早期，去除炎症前细胞因子可中止DCp的成熟从而不能呈递细胞抗原，在T细胞重建新群体之前一段时间内(几周)，可能诱导类似新生动物耐受模型中T细胞无反应性。
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3.2 人工合成MHC抗原肽段的封闭作用 已证实受体APCs所呈递的供体MHC肽段较为单一，同种反应性T细胞间接识别少数几个主要的MHC分子表位，受体的同种抗原特异性T细胞克隆表达限定的TCRVβ家族分子识别有限的抗原肽基序，人们利用人工合成的同种抗原肽抗体，封闭某些MHC分子某些特定肽段产生耐受(high zone tolerance)，也可以封闭受体同种反应性T细胞TCR达到阻断排斥反应的目的[3，5]。
3.3 阻断T-B细胞协同 CD4+Th细胞可辅助B细胞产生同种抗体介导排斥，T-B细胞协同调节机制可能依赖于B细胞活化状态，已证实小静息B细胞在不能提供T细胞活性的适宜协同刺激信号情况下，可诱导T细胞无反应性(耐受)，而活化的B细胞可呈递目标抗原肽，诱导T细胞活化并向Th2细胞分化。Catherine等通过人工合成Aa衍生抗原肽P1、P2，与抗ΙgD单抗(Fab)及OX60联结注入受者，发现经IgD Fab(一价)-OX60-P1/P2肽连结预处理患者后，IgG2b和IgG1抗体亚型的产生均大大降低，说明受鼠体内，由IgD(+)幼稚B细胞呈递给CD4+T细胞导致CD4+T细胞无反应，不能辅助抗MHCⅠ类分子抗体的产生，导致耐受。
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*锦州市第205医院泌尿科
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收稿日期：1998-12-03, 百拇医药(作者：刘玉杉 董 刚*)
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心 上海，200003
关键词：间接免疫识别；排斥反应；免疫耐受
肾脏病与透析肾移植杂志990125 刘玉杉 董 刚* 综述 闵志廉 审校
同种反应性T细胞识别种间MHC差异是引发排斥反应的关键。对于免疫识别的认识，Lechler和Batchelor[1]早在80年代初期就已提出两种完全不同的同种识别途径：直接识别(direct allorecognition)和间接识别(indirect allorecognition)。人们不仅认识到同种反应性T细胞识别由供者抗原呈递细胞(APCs)呈递完整的同种MHC分子(直接识别)导致排斥反应的发生，但也认识到移植建立后，供者过路白细胞经直接识别被宿主体内清除后，可产生一定程度的耐受，但进行性的移植物功能丧失仍在持续[2]；临床观察到：排斥发生时，移植器官内供体APCs被受体APCs所替换(turn over)的现象[3]，这些证据表明受体APCs介导的间接识别可能作为一种重要的免疫驱动力，可介导慢性排斥反应，影响移植的长期结果。近来研究表明，间接识别在慢性排斥反应，抗体介导的排斥反应方面可能具有决定性作用[3，4]。
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1 间接识别的概念与特点
间接识别是指宿主自身APCs加工和呈递供者特异性抗原肽，结合于宿主细胞表面MHC分子的抗原结合槽内，供T细胞识别。
综述近年来关于间接识别不同模型的实验与临床研究结果，我们认为间接识别有以下几个方面的特点。
1.1 供体MHC抗原肽的特点 受体APCs所呈递供体MHC抗原肽含有宿主和供体MHC分子差异的一个和数个主要MHC分子表位。宿主APCs表面MHCⅠ类、Ⅱ类分子抗原结合槽内结合的供体抗原肽的长度一般有15个氨基酸左右，且具有免疫决定簇基序(motif)，是MHC基因多态区不相容位点编码的。人们可依据大鼠、小鼠和人的MHC分子氨基酸序列人工合成这些肽。Catherine等[5]人工合成了对应于小鼠MHCⅠ类分子Aa的α1、α2链的α-螺旋区肽链的P1和P2肽，二肽包括了不同小鼠MHC类Aa分子氨基酸序列的大多数的差异，总长度为21～24个氨基酸，包括N未端酪氨酸位点。把P1、P2肽免疫PVG(RTu1)小鼠(对MHC Ⅰ类Aa分子有高反应性)，小鼠对有Aa分子差异的PVG.R8移植鼠心产生了快速排斥。Waaga[3]等利用人工合成的对应于RT1小鼠Duβ链20～33和31～44序列的抗原肽免疫同种小鼠，体外、体内实验均证实可产生针对抗原肽的不同的CD+4Th细胞克隆的增殖反应，且可传递体内延迟型超敏反应(Delayed-type Hypersensitive Reaction，DTH)。在皮肤移植模型中，发现不同细胞毒性淋巴细胞(CTL)谱系可识别供受体次要组织相容性抗原(minor histocompatibitity antigen mHA)抗原肽的差异，差异性抗原肽的数目>40个[6]。在Hb2相合的C57BL/6(Hc2)受者和BALB.B供者(Hb2)组合，发现Kb分子呈递的CTT-2及CTT-5肽可被所有细胞毒性淋巴细胞(CTL)谱系所识别。由于mHA具有重要的临床意义，CTL谱系仅识别特定的次要组织相容抗原MHA抗原肽基序可能是一个有意义的发现。
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1.2 专职宿主抗原呈递细胞加工和呈递同种抗原肽 间接识别的同种抗原肽的加工和呈递是由受体抗原呈递细胞完成的，一般认为同种抗原肽呈递于MHCⅡ类分子的抗原结合槽(groove)内供CD4+T细胞识别，是间接识别的主要方式，但有些证据表明MHC-Ⅰ类分子呈递的抗原肽也可能参与间接识别，引起特异性CD8+T细胞活化。MHCⅠ类和Ⅱ类分子代表不同抗原呈递方式：即内源肽和外源肽加工方式。
1.2.1 MHCⅠ类分子呈递方式[7] 此方式的抗原肽多为内源性抗原。抗原首先在胞质内须经Ⅰ型蛋白水解后分解成抗原肽，被抗原呈递复合物(transporter associated with antigen processing，TAP)运输至粗面内质网(ER)。TAP分为TAP1和TAP2两个亚型，抗原肽的大小一般为8～12个氨基酸时运输效率最高。抗原肽在粗面内质网(ER)内与MHCⅠ类分子结合。mHCⅠ类分子X线衍射分析表明：α1、α2的抗原结合区可形成A～F六个抗原结合口袋(peptide bind pockets)，A区对应抗原肽的N末端，F区对应抗原肽的C’末端，B、C、D、E四区参与识别，池序列(pool sequeacing)特异性与抗原肽基序(motif)的电荷、极性决定的亲和性和解离率有关。特异性的正确装配(assembly)决定CD8+和CTL特异性识别。在运输至细胞表面时，需水解保护剂对抗原肽基序加以锁定。
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1.2.2 MHCⅡ类分子呈递方式 MHCⅡ类分子呈递方式加工和呈递的多为外源性抗原，通过内吞和吞噬作用分别处理可溶性抗原及蛋白结合颗粒，与MHCⅠ类分子方式有不同的胞质内过程。在许多粘附分子协同下完成对CD4+T细胞的呈递。间接识别主要以此方式呈递抗原肽，详细机制尚待阐明。
近时期来，主要的抗原呈递细胞—树突状细胞(dendritic cell)的抗原呈递作用，尤其是间接识别方面，引起人们的关注。Sternman等[8]发现，移植物内存留的供者树突状细胞(DC)和加工游离供者抗原参与间接识别的宿主树突状细胞前体(DC processor)均须迁移至围移植物的T细胞，细胞因子丰富的层粘蛋白(LN)区才能成为专职的APC，树突状细胞前体(DCp)需围移植物的LN微环境存留的T细胞和NK细胞分泌的细胞因子以支持成熟。
1.2.3 间接识别具有MHC限制性 受体同种反应性T细胞识别自身抗原呈递细胞呈递的抗原肽首先须识别APC自身MHC。
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1.2.4 参与间接识别的同种反应性T细胞的限制性 来源于免疫动物和排斥动物的同种抗原肽特异性CD4+T细胞克隆，表达限定的TCRVβ家族分子，识别差异性抗原肽单个或多个表位。Liu[9]和Chun[10]等利用RT1Duβ20～44同种抗原肽致敏lewis大鼠，产生表达TCR Vβ9，TCRVβ13.2的Th1克隆。对表达TCRVβ9和Vβ13.2的T细胞克隆输给幼稚Lewis大鼠可引发其对RT1Duβ20～44和同族WF大鼠(RTIu)脾细胞的延迟型超敏反应(DTH)。体外实验证实：RT1Duβ21～31肽，β(21～44)肽及β(31～44)肽可分别诱生表达TCRVβ9，4，13.2Th细胞克隆。而排斥动物模型中，针对该肽的T细胞克隆包含所有上述的表达限定于TCRVβ分子的特异性T细胞克隆，说明在排斥状况下，APCs对移植物同种抗原的特异性抗原基序加工和呈递的自然过程。T细胞活化是由TCR表达密度，TCR和配体亲和力及肽：MHC复合物的浓度决定的表达亲和性所决定的。MHC：肽复合物与TCR结合构成三分子复合物，CD8分子作为TCR的协同受体(co receptor)或内在受体(intrinsic receptor)构成稳定的复合物，对CD8+CTL抗原识别的特异性影响很大[11]。
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1.2.5 间接识别途径引起的免疫效应的强度(Avidity)一般较直接识别为低 Liu等在实验中发现，直接识别产生同种反应性T细胞占T细胞总数的1%～10%，而间接识别仅占0.1%左右。经间接识别HLA-DR抗原的活化T细胞数目较直接识别低100倍[12]。间接识别引发的抗体介导的排斥反应强度为中等强度[13]，仍足以破坏移植物。
2 间接识别与排斥
一般认为间接识别引起排斥的相关变量涉及：①移植类型；②受者的致敏状态；③MHC分子差异的性质(不相容位点及数目)；④具有直接和间接同种特异性T细胞对外源免疫抑制因素的相对敏感性。证据表明间接识别在慢性排斥反应及抗原介导的排斥反应中可能具有决定性作用[3，5，6]。在慢性排斥的心脏移植患者，Hornick等对直接识别供者抗原的特异性同种反应性T细胞(HTL)和毒性T细胞(CTL)在供者特异性耐受方面的作用进行半定量化分析，用有限解释法对CTL和HTL进行半定量分析，发现移植患者体内直接抗供者特异性的低反应。50个患者体内外周血HTL计数和CTL计数(HTLf和CTLf)均<1：105，与对照组差异显著(P<0.001)。说明渐进性移植心功能丧失，并非由直接识别引起，间接识别是主要原因。一些实验提示，间接识别对一些急性排斥反应起部分作用。有人[14]用50例心脏移植的患者外周血与供者APC和人工合成的供受者HLA-DR不相容位点抗原肽的反应进行了观察：以CD69作为T细胞活性标记，有限稀释法测定对同种肽的反应性，发现直接识别和间接识别均参与了初次急性排斥反应，但以直接识别为主，伴随间接识别其中一个决定同种肽；在再发排斥中，存在T细胞表位分子间传递现象。一般认为，间接识别刺激CD4+T细胞活化增殖，进而诱发DTH反应，细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应及T细胞辅助B细胞产生特异的同种抗体，是间接识别诱发排斥的效应机制[3]。
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2.1 延迟性超敏反应(DTH) DTH反应是一种预先对同种抗原致敏的回忆反应，晚期病理变化与急性排斥反应相似，但发病机制不同，DTH反应可在远离移植物的抗原沉积位点引发。反应早期，一定量的致敏同种反应性T细胞经与自身APCs的MHC性分子呈递的同种抗原肽接触激活，产生Th1反应，释放IL-2、IFN-γ，进一步活化T细胞和巨噬细胞，释放细胞因子，炎性介质和其它因子引起组织损伤[13]。Dalloul等[15]发现CD4+T细胞对MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类差异性靶细胞无细胞毒性，但经间接识别MHCⅠ类同种靶分子目标，活化产生Th1细胞因子(无IL-4)。Hd2CD8-/-小鼠可排斥缺乏Ⅰ和Ⅱ类抗原的Hb2同种移植皮肤。从CD8-/-小鼠提取CD4+T细胞输入已接受皮肤移植的裸鼠，可排斥mHC Ⅱ和Ⅰ类分子存在差异移植皮肤，说明CD4+T细胞单纯通过产生DTH反应引起排斥，且可传递。Waaga等利用lewis大鼠(RT1)产生针对MHC不相容的Wistar Furth大鼠移植肾的急性排斥，可从Lewis大鼠脾和肾脏提出针对RT1Duβ20～44特定肽的特异性CD4Th克隆，并表达TCRVβ9、TCRVβ13、2。在以完整的RT1Duβ20～44MHCⅡ类分子刺激时，可引起针对该分子的DTH反应。而表达TCRVβ4的T细胞克隆则无反应。这种Th1细胞克隆经识别RT1Duβ20～44、β31～44肽上的单个氨基酸表型差异。
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2.2 CTL反应 体外研究说明毒性T淋细胞的产生有两个途径：CD4+依赖性途径和CD8+T细胞对MHCⅠ类抗原直接识别途径[16]。Lee等[17]利用小鼠体内应用抗CD8单抗去除CD8+T细胞后，接受缺乏MHCⅡ类分子的同种皮肤移植，产生了快速排斥反应。移植前用流式细胞仪证明受者体内CD8+T细胞已基本消除，但移植后仍然产生对供者MHCⅠ类分子敏感的CD8+CTL，提示CD4+Th细胞间接识别自身抗原呈递细胞表面MHCⅡ类抗原呈递的同种抗原肽致敏后，辅助同种肽特异性CD8+CTL产生。Manning等[18]对间接途径体内生成CD8+CTL反应的最低条件进行了探讨。利用2C-TCR基因转染小鼠RAG(-/-)(只存在CD8+特异性CTL)。体内注射MHC段肽可导致2C-TCR/RAG(-/-)小鼠T细胞活性升至很高水平，发现阻断B7协同刺激信号，小鼠仍排斥携带适宜抗原肽/MHC配体P2C/Ld肿瘤，提示：同种排斥可在无B7介导协同刺激和无CD4+T细胞存在的情况下发生。在排斥时，肿瘤位点分离的CTLs表达激活标志CD25，且可介导体外溶解带有适宜抗原的肿瘤细胞。说明大量CTL前体可在无B7-CD28协同刺激和无CD4+T细胞帮助下发育成CD8+。特异性CTL细胞直接识别次要组织相容性抗原(mHA)在慢性排斥反应具有重要作用，已证实H2杂交受者经间接途经有效致敏产生mHA特异性CTL反应。Nevala等[6]对杂交受者mHA的交叉致敏(cross priming)即间接识别的特异性，与直接识别作了对比研究，利用Theralyte免疫分离装置将(B57BL/6×B6C-H12)F1的T细胞和BALB、B、BALB/C脾细胞放入0.4 μm分离孔，受者效应性细胞经此装置交叉致敏，产生针对BAIB、B、BALB，C特异性CTLs。利用C×B重组近交株表达不同排列BALB/C mHA抗原分子靶标，对BALB、B小鼠的Kb和Db分子呈递分数的高生成性液相染色分析证明：抗BALB.B大鼠CTLs特异性针对已知抗原肽CTT-2，CTT-5。改变效应细胞和刺激细胞，结果相同，类似加速性皮肤移植排斥模型中CTL对同种肽的识别状况，因此说明，CTL间接识别特异性mHA肽段与CTL直接识别mHA的肽段(如CTL-2，CTL-5)是相同的。
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2.3 抗体介导的排斥反应 CD4+T细胞依赖性同种反应性抗体单独可引起移植物的破坏，当供受者存MHCⅡ类分子的差异时，CD4T细胞经同族(Cognate)T-B细胞协同，辅助B细胞产生同种抗体IgG。大鼠体内应用Ⅰ类Aa衍生肽人工合成肽P1、P2经受者APC呈递后供CD4+T细胞间接识别，当再遇完整Ⅰ类差异性Aa分子可有效辅助B细胞功能和强化同种抗体效应。合成P1、P2肽分别对应于PVG RTu1大鼠Aaα螺旋区57-80、143-163氨基酸座位。RT1大鼠经P1P2肽接种后，可产生对Aa差异性PVG1.R8大鼠移植心强烈的排斥反应及增强的抗Aa特异性抗体反应，每个肽P1和P2至少包含一个或多个主要T-B协同的决定的决定簇基序或表位。Benham等[19]观察了2例未产生Ⅰ类分子抗体的长期存活心脏移植大鼠(>100天)和1例用人工合成的对应DAⅠ类分子一个区域的肽(已知此肽可被CD4+Th细胞所间接识别)接种的长期存活者。这三个长期存活者，均无排斥反应，接种致敏者也未产生抗供者Ⅰ类MHC抗原肽的抗体，B细胞(具有潜在针对完整供者MHCⅡ类分子抗原肽产生抗体的能力)保持静态。原因可能由于可逆性T细胞抑制和无能，不能对B细胞产生辅助；另一种原因可能是B细胞对致敏MHCⅠ分子无反应性(无能或耐受)。
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3 间接识别与耐受
在一些间接识别的模型中已成功诱导了一定程度的耐受。了解间接识别的机制与过程，可建立有效阻断同种免疫应答的方法，诱导耐受，因而具有潜在的应用价值。
3.1 干扰专职抗原呈递细胞成熟 据报告[20～22]以Aa衍生的同种抗原肽为靶目标，由缺乏协同刺激信号(Costimulator)活性的APC呈递给CD4+T细胞，可诱导T细胞无反应(nonreactive)和不能给B细胞以有效帮助。作为主要抗原呈递细胞的树突状细胞的成熟对间接抗原呈递是关键因素。在新生动物移植耐受模型(neonatal tolerance)中，发现反应性T细胞数目较低和未成熟的树突状细胞为主的APCs之间有一精致的平衡，需要适宜的无危险间质(undanger milieu)(可传递抗原信号使T细胞增殖但无协同刺激)，可诱导稳定的耐受。树突状细胞前体(DCp)奉命一般为数天至数周左右，在此时间内抑制前炎症细胞因子(proinflammatory cytokine)可导致树突状细胞前体数目呈不可逆的下降。在环孢素时代的移植早期，去除炎症前细胞因子可中止DCp的成熟从而不能呈递细胞抗原，在T细胞重建新群体之前一段时间内(几周)，可能诱导类似新生动物耐受模型中T细胞无反应性。
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3.2 人工合成MHC抗原肽段的封闭作用 已证实受体APCs所呈递的供体MHC肽段较为单一，同种反应性T细胞间接识别少数几个主要的MHC分子表位，受体的同种抗原特异性T细胞克隆表达限定的TCRVβ家族分子识别有限的抗原肽基序，人们利用人工合成的同种抗原肽抗体，封闭某些MHC分子某些特定肽段产生耐受(high zone tolerance)，也可以封闭受体同种反应性T细胞TCR达到阻断排斥反应的目的[3，5]。
3.3 阻断T-B细胞协同 CD4+Th细胞可辅助B细胞产生同种抗体介导排斥，T-B细胞协同调节机制可能依赖于B细胞活化状态，已证实小静息B细胞在不能提供T细胞活性的适宜协同刺激信号情况下，可诱导T细胞无反应性(耐受)，而活化的B细胞可呈递目标抗原肽，诱导T细胞活化并向Th2细胞分化。Catherine等通过人工合成Aa衍生抗原肽P1、P2，与抗ΙgD单抗(Fab)及OX60联结注入受者，发现经IgD Fab(一价)-OX60-P1/P2肽连结预处理患者后，IgG2b和IgG1抗体亚型的产生均大大降低，说明受鼠体内，由IgD(+)幼稚B细胞呈递给CD4+T细胞导致CD4+T细胞无反应，不能辅助抗MHCⅠ类分子抗体的产生，导致耐受。
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*锦州市第205医院泌尿科
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收稿日期：1998-12-03, 百拇医药(作者：刘玉杉 董 刚*)