HIV-1抗体阳性血浆中HIV-1病毒基因分型研究
作者：钟 平 刘桂珍 朱 为 段继良 张依磺
单位：卫生部上海生物制品研究所，上海 200052
关键词：人免疫缺陷病毒；逆转录PCR；DNA序列测定；基因亚型
中国病毒学990104 Katrien Fransen Leo Heyndrickx Wouter Jansens Guido van der Groen
(Institute of Tropical Medicine, B-2000 Antwerp, Belgium)
摘 要 为了解HIV抗体阳性血浆中的HIV-1病毒基因亚型的情况，应用逆转录PCR和DNA序列测定技术，对6份获自高危人群的抗HIV-1阳性血浆进行序列分析和基因亚型分型的研究，结果表明均属HIV-1B亚型。V3环氨基酸序列分析指出这些HIV-1B亚型病毒株与泰国HIV-1B亚型病毒株核苷酸和氨基酸序列相似；同时发现HIV-1 cDNA和氨基酸序列均相同，推测这6份标本可能来自同时感染同一株HIV病毒的感染者。本研究对了解高危人群中HIV-1流行的遗传变异和HIV-1亚型病毒株的分子流行病分析具有一定的意义。
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Genotyping of HIV-1 in Anti- HIV-1 Sero-Positive Plasma
Zhong Ping Liu Guizheng Zhu Wei et al.
(Shanghai Institute of Biological Products, Shanghai 200052)
Katrien Fransen Leo Heyndrickx Wouter Jansens Guido van der Groen
(Institute of Tropical Medicine, B-2000 Antwerp, Belgium)
Abstract Six of anti-HIV-1 sero-positive plasma derived from a local high-risk population were investigated by RT-PCR and cDNA sequencing. The results indicated that HIV-1 prevalent in a local high-risk population belonged to HIV-1 subtype B. The sequences of nucleic acids and amino acids in V3 loop of 6 cDNA were completely similar to that of Thailand HIV-1 subtype B strains. Besides, the sequences of cDNA and amino acid from 6 plasma samples were identical. It implied that they might be derived from 6 HIV-1-infected people who were infected with HIV-1 at the same period. This study could provide a better understanding of prevelence of HIV-1 subtype strains in a local high-risk population.
, 百拇医药
Key words HIV-1, cDNA sequencing, Geno-subtype
人免疫缺陷病毒(HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(又称艾滋病，AIDS)的病原体，现在世界上已经有将近3000万HIV感染者。AIDS是危害人类健康的严重的传染病之一。由于HIV-1的遗传变异，目前已经有A至J十种基因亚型[1]，另外，近年来在非洲和欧洲发现了一株HIV-1的新的变异株，被称为O亚型[2]。研究HIV的遗传变异无论对了解HIV-1亚型病毒株与病毒的传染性、致病性、免疫原性等之间的关系，还是对HIV亚型株感染的诊断、广谱疫苗的开发以及分子流行病学调查，都有一定的现实意义。为此，我们对所获得的6份HIV-1阳性血浆进行HIV-1 cDNA序列分析，鉴定其基因亚型。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 6份血浆标本 获自国内某一高危人群组。
1.1.2 HIV抗体检测试剂 为芬兰Labsystems抗HIV-1/2 ELISA和本室建立的抗HIV-1/2ELISA (合成肽gp41和gp36)。抗HIV-1阳性的确证试剂为美国BIORAD公司的WB确证试剂。
1.1.3 PCR试剂和DNA序列测定试剂 Diatom购自Janssen Chimica公司；脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和逆转录酶(MMLV)购自GIBCO公司；随机引物购自Pharmacia公司；Taq DNA酶购自Perkin Elmer公司；引物HIE100、HIE200、HIE101和生物素标记的HIE 201由比利时热带病医学研究所提供；亲和素标记的磁性微珠(Dynabeads M280 Streptavidin)购自Dynal AS公司；测序试剂盒(T7 SequenceTM kit)购自Pharmacia公司。
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1.2 方法
1.2.1 抗HIV-1抗体检测和确证试验 均按照试剂的说明书操作要求进行。
1.2.2 提取RNA 参照Boom等[3]方法提取RNA，简述如下：取血浆100μL，加入900μL溶解缓冲液(120g GuSCN, 100mL 0.1mol/L Tris-HCl, pH6.4, 22mL 0.2mol/L EDTA, pH8.0和2.4mL TritonX-100)和40μL Diatom悬液(10g/50mL蒸留水、500μL 32% HCl)。快速混匀后置室温10min，混匀后用TGL-168型离心机以12000r/min离心15s，弃上清液，用1mL洗涤缓冲液(120g GuSCN, 100mL 0.1mol/L Tris-HCl, pH6.4)洗涤沉淀物两次，在振荡器上将沉淀物完全悬浮后12000r/min离心15s，弃上清液，同样，用1mL70%乙醇洗涤两次，最后用1mL丙酮洗涤一次，沉淀物在室温下干燥20min，加入50μL TE缓冲液(0.1μL RNA保护剂和0.5μL0.1mol/LDTT)混匀，置56℃15min，用上述离心条件离心2min，吸取上清液置-20℃备用。
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1.2.3 逆转录套式PCR[4] 取9μL RNA加到11μL的逆转录反应液中(含1μL随机引物和50u逆转录酶)，37℃ 1h。在50μL PCR反应液中含5μL RNA、外引物HIE100和HIE200[5]引物各
0.4mmol/L、0.2mmol/L dNTPs、2.5mmol/LMgCl2、TaqDNA聚合酶、50mmol/LKCl、10mmol/L Tris-HCl, pH8.0、0.01%明胶。PCR扩增仪为Perkin Elmer 480型。第一轮PCR扩增反应为94℃ 5min；94℃ 1min, 50℃ 1min,72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。第二轮PCR扩增反应的内引物是HIE101和生物素标记的HIE201[5]，取第一轮PCR反应液1μL, PCR扩增反应为94℃ 5min； 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1min, 25个循环；72℃ 7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
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1.2.4 PCR产物直接固相测序和分析[6] 含有生物素的PCR产物经氯仿和乙醚抽提处理后与链霉亲和素标记的磁性微珠混合(2pmol/L DNA结合于0.15mg磁性微珠)，然后加入0.15mol/LNaOH使PCR产物cDNA形成两股单链，吸出上清液用pH7.0的缓冲液中和，使用荧光素标记的测序引物和测序试剂盒(T7 SequenceTM kit)，根据说明书操作对上清液(含正链)和磁性微珠液(含负链)同时进行测序反应。在ALF全自动DNA测序仪上测序。应用系统树分类方法进行HIV-1亚型分型分析[5]。
2 结果
2.1 血清学分析
6份血浆标本用芬兰Labsystems和本室制备的抗HIV-1/2 ELISA试剂检测为抗HIV-1阳性。进一步用美国BIORAD公司的WB试剂确证为抗HIV-1阳性，6份血浆标本都含有HIV-1 p24、p32(除S-139和S-302外)、gp41、p55、p65和gp120/160抗体成分，标本S60、S62、S139和S302还含有p18，见表1。
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表1 抗HIV-1/2酶联免疫测定和免疫印迹法结果
Table 1 The results of ELISA and Western blot for HIV-1/2 标本号*
No. of samples
BIORAD WB
p18
p24
p32
gp41
p55
p65
, http://www.100md.com gp120/160
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*用Labsystems和本室制备的HIV-1/2 ELISA试剂检测，全部为阳性。All of six samples were positive, detected by HIV-1/2 ELISA diagnostic kit made in Labsystems, Finland, and in-house.
2.2 序列测定分析结果
对6份血浆标本进行HIV-1 gp120 C2V3区的cDNA序列分析，发现6份血浆的cDNA序列和所编码的氨基酸序列完全相同，见表2和图1。在与国际HIV-1代表株的亚型同源性序列系统树状图同时分析中，6份血浆标本的cDNA序列属于B亚型，见图2。与欧美和泰国HIV-1病毒株在V3环的氨基酸序列比较，发现在6份血浆标本的gp120 V3环中的第2、14、18、20和25位置上的氨基酸残基与欧美B亚型病毒株的同源序列不同，分别为I、L、Q、W和Q，而欧美代表株MN株在6、8、11、24、25和29位置上分别为Y、K、R、K、N和T。尤其在V3环的顶端，欧美HIV-1 B亚型株为GPGR，而邻近国家泰国HIV-1 B亚型株主要为GPGQ，6份血浆标本在V3环中除了在第二位置上的氨基酸残基不同外，泰国HIV-1为T，整个V3环氨基酸残基序列与泰国HIV-1病毒株相同，见表2。经系统树状图分型分析，6份血浆标本cDNA序列属于泰国HIV-1 B亚型，见图2。
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表2 6份血浆标本与欧美和泰国HIV-1病毒株gp120 V3环氨基酸残基序列比较结果
Table 2 Comparison of gp120 V3 amino acid sequences between six plasma and
European/North-American HIV-1 B subtype and Thailand HIV-1 subtype strains B亚型氨基酸
同源序列
B subtype amino
acid consensuss
C
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Thai B为泰国HIV-1 B基因亚型；MN为欧美HIV-1 B基因亚型。
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Tahi B， Thailand HIV-1 B subtype;MN, European/North-American HIV-1 B subtype.
图1 6份血浆标本HIV-1 gp120 C2V3区cDNA序列(332碱基)和推导的氨基酸序列
Fig.1 cDNA (332bp) and deduced amino acid (AA) consensus sequences of HIV-1 gp120 C2V3 derived from six plasma samples
3 讨论
自从我国1985年发现第一例艾滋病患者以来[7]，到1998年6月底，我国官方媒体报道HIV-1感染者总数达10676例，并估计实际感染人数是报道数字的20～30倍。感染途径也已经从早期的静脉注射毒品到后来的性接触感染、输血感染以及母婴感染方式。据中国预防医学科学院病毒所邵一鸣教授报道[8]，目前HIV-1在国内流行的病毒基因亚型主要为B(欧美B亚型和泰国B亚型)、另外还发现HIV-1 C和E亚型，非洲HIV-1A亚型病毒也已经从个别感染者血液中分离到。HIV-2和HIV-1 O组病毒株的传播至今未见报道，但是值得注意的是邻近国家、印度已经流行HIV-2病毒株[9]。
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本研究对获自某地高危人群的6份HIV-1抗体阳性血浆作进一步血清学确证和HIV-1 cDNA序列测定和系统树分析，我们发现：(1)根据系统树分型分析的结果，这6份血浆中的HIV-1属于HIV-1 B基因亚型；(2)这些血浆标本的cDNA序列与欧美HIV-1病毒株如FR.LAI和US.MN，稍有差别(99%相同)，而与泰国HIV-1病毒株序列完全相同(见图2)，进一步证实了邵一鸣教授关于我国目前的HIV-1病毒株的gp120 V3环顶端由GPGR向GPGQ漂移和欧美HIV-1 B亚型转变为泰国HIV-1 B亚型的报道[10](见图1)，因此可以说这6份感染血浆的HIV-1病毒株属于泰国型的HIV-1 B基因亚型的病毒株；(3)从cDNA序列中我们发现这6份血浆标本的HIV-1 cDNA序列完全相同，推测6份血浆标本获自某种途径同时感染一种HIV-1病毒株的感染者。HIV-1亚型分型分析目前有几种方法，如DNA序列测定分析、V3多肽ELISA分型、异源DNA双链体电泳分析(HMA)、限制性片段长度多形态测定(RFLP)和寡核苷酸探针杂交测定。尽管与其他分型方法相比，DNA序列分析比较昂贵和费时，但是这种方法能够最终判断和分析被检标本的DNA或cDNA序列，在HIV的分子流行病调查和监测HIV的遗传变异方面起到重要的作用。
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图2 6份HIV-1和其他国际HIV-1亚型代表株同源序列系统图
Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of six HIV-1 cDNA sequences with international HIV-1 subtypes consensus sequences
CN(China):中国；UG(Uganda)：乌干达；BE(Belgium)：比利时；GH(Ghana)：加纳；ZR
(Zaire)：扎伊尔；
CM(Cameroon):喀麦隆；GA(Gabon)：加蓬；TH(Thailand)：泰国；FR(France):法国；IN
(India)：印度；
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SA(South Africa):南非；BR(Brazil)：巴西；CY(Cyprus):塞普路斯；US(United States):美国.
参考文献
[1] Heyndickx L, Janssens W, Alary M et al. Genetic variability of HIV type 1 in Benin. AIDS Research and Human Retroviruses, 1996,12:1495～1497
[2] Vanden Haesevelde, Decourt M. J.-L, De Leys R J et al. Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate. J Virology. 1994, 69:6191～6198
, http://www.100md.com
[3] Boom R, Sol C J A, Salimans M M M et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clinical Mircrobiology, 1990,28:495～503
[4] Van Kerkhoven l, Fransen K, De Beenhouwer H et al. Quantification of human immunodeficiency virus in plasma by RNA-PCR: viral culture and p24 antigen detection. J Clinical Microbiology, 1994,32:1669～1673
[5] Janssens W, Heyndrickx L, Van de Peer Y et al. Molecular phylogeny of part of the env gene of HIV-1 strains isolated in Cote d'lvoire. AIDS,1994,8:21～26
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[6] Hultman T, Stahl S, Hornes E et al. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Research, 1989,17:4937～4946
[7] 曾毅，王必常，汤得骥等.血友病患者血清中淋巴腺病病毒/人T细胞Ⅲ型病毒抗体检测.病毒学报.1986，2：97～99
[8] Shao YM, Zhao Q, Guan Y et al. Follow-up studies on molecular epidemiology of HIV-1 strains in Ruili region of southwest China. X Ⅰ International Conference on AIDS, July 7-12,1996,Vancouver, Canada. Abstract Vol 2, We. C. 341
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[9] Pfutzner A, Dietrich U, von Eichel U et al. HIV-1 and HIV-2 infections in a high-risk population in Bombay, India:evidence for the spread of HIV-2 and presence of a divergent HIV-1 subtype. J Acquired immune Deficienccy Syndrome, 1992,5:972～977
[10] 邵一鸣，赵全壁，王斌等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV病毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，10：291～299
收稿日期1997-12-29修回日期：1997-03-09, http://www.100md.com
单位：卫生部上海生物制品研究所，上海 200052
关键词：人免疫缺陷病毒；逆转录PCR；DNA序列测定；基因亚型
中国病毒学990104 Katrien Fransen Leo Heyndrickx Wouter Jansens Guido van der Groen
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摘 要 为了解HIV抗体阳性血浆中的HIV-1病毒基因亚型的情况，应用逆转录PCR和DNA序列测定技术，对6份获自高危人群的抗HIV-1阳性血浆进行序列分析和基因亚型分型的研究，结果表明均属HIV-1B亚型。V3环氨基酸序列分析指出这些HIV-1B亚型病毒株与泰国HIV-1B亚型病毒株核苷酸和氨基酸序列相似；同时发现HIV-1 cDNA和氨基酸序列均相同，推测这6份标本可能来自同时感染同一株HIV病毒的感染者。本研究对了解高危人群中HIV-1流行的遗传变异和HIV-1亚型病毒株的分子流行病分析具有一定的意义。
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Genotyping of HIV-1 in Anti- HIV-1 Sero-Positive Plasma
Zhong Ping Liu Guizheng Zhu Wei et al.
(Shanghai Institute of Biological Products, Shanghai 200052)
Katrien Fransen Leo Heyndrickx Wouter Jansens Guido van der Groen
(Institute of Tropical Medicine, B-2000 Antwerp, Belgium)
Abstract Six of anti-HIV-1 sero-positive plasma derived from a local high-risk population were investigated by RT-PCR and cDNA sequencing. The results indicated that HIV-1 prevalent in a local high-risk population belonged to HIV-1 subtype B. The sequences of nucleic acids and amino acids in V3 loop of 6 cDNA were completely similar to that of Thailand HIV-1 subtype B strains. Besides, the sequences of cDNA and amino acid from 6 plasma samples were identical. It implied that they might be derived from 6 HIV-1-infected people who were infected with HIV-1 at the same period. This study could provide a better understanding of prevelence of HIV-1 subtype strains in a local high-risk population.
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Key words HIV-1, cDNA sequencing, Geno-subtype
人免疫缺陷病毒(HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(又称艾滋病，AIDS)的病原体，现在世界上已经有将近3000万HIV感染者。AIDS是危害人类健康的严重的传染病之一。由于HIV-1的遗传变异，目前已经有A至J十种基因亚型[1]，另外，近年来在非洲和欧洲发现了一株HIV-1的新的变异株，被称为O亚型[2]。研究HIV的遗传变异无论对了解HIV-1亚型病毒株与病毒的传染性、致病性、免疫原性等之间的关系，还是对HIV亚型株感染的诊断、广谱疫苗的开发以及分子流行病学调查，都有一定的现实意义。为此，我们对所获得的6份HIV-1阳性血浆进行HIV-1 cDNA序列分析，鉴定其基因亚型。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 6份血浆标本 获自国内某一高危人群组。
1.1.2 HIV抗体检测试剂 为芬兰Labsystems抗HIV-1/2 ELISA和本室建立的抗HIV-1/2ELISA (合成肽gp41和gp36)。抗HIV-1阳性的确证试剂为美国BIORAD公司的WB确证试剂。
1.1.3 PCR试剂和DNA序列测定试剂 Diatom购自Janssen Chimica公司；脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和逆转录酶(MMLV)购自GIBCO公司；随机引物购自Pharmacia公司；Taq DNA酶购自Perkin Elmer公司；引物HIE100、HIE200、HIE101和生物素标记的HIE 201由比利时热带病医学研究所提供；亲和素标记的磁性微珠(Dynabeads M280 Streptavidin)购自Dynal AS公司；测序试剂盒(T7 SequenceTM kit)购自Pharmacia公司。
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1.2 方法
1.2.1 抗HIV-1抗体检测和确证试验 均按照试剂的说明书操作要求进行。
1.2.2 提取RNA 参照Boom等[3]方法提取RNA，简述如下：取血浆100μL，加入900μL溶解缓冲液(120g GuSCN, 100mL 0.1mol/L Tris-HCl, pH6.4, 22mL 0.2mol/L EDTA, pH8.0和2.4mL TritonX-100)和40μL Diatom悬液(10g/50mL蒸留水、500μL 32% HCl)。快速混匀后置室温10min，混匀后用TGL-168型离心机以12000r/min离心15s，弃上清液，用1mL洗涤缓冲液(120g GuSCN, 100mL 0.1mol/L Tris-HCl, pH6.4)洗涤沉淀物两次，在振荡器上将沉淀物完全悬浮后12000r/min离心15s，弃上清液，同样，用1mL70%乙醇洗涤两次，最后用1mL丙酮洗涤一次，沉淀物在室温下干燥20min，加入50μL TE缓冲液(0.1μL RNA保护剂和0.5μL0.1mol/LDTT)混匀，置56℃15min，用上述离心条件离心2min，吸取上清液置-20℃备用。
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1.2.3 逆转录套式PCR[4] 取9μL RNA加到11μL的逆转录反应液中(含1μL随机引物和50u逆转录酶)，37℃ 1h。在50μL PCR反应液中含5μL RNA、外引物HIE100和HIE200[5]引物各
0.4mmol/L、0.2mmol/L dNTPs、2.5mmol/LMgCl2、TaqDNA聚合酶、50mmol/LKCl、10mmol/L Tris-HCl, pH8.0、0.01%明胶。PCR扩增仪为Perkin Elmer 480型。第一轮PCR扩增反应为94℃ 5min；94℃ 1min, 50℃ 1min,72℃ 1min，35个循环；72℃ 7min。第二轮PCR扩增反应的内引物是HIE101和生物素标记的HIE201[5]，取第一轮PCR反应液1μL, PCR扩增反应为94℃ 5min； 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1min, 25个循环；72℃ 7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
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1.2.4 PCR产物直接固相测序和分析[6] 含有生物素的PCR产物经氯仿和乙醚抽提处理后与链霉亲和素标记的磁性微珠混合(2pmol/L DNA结合于0.15mg磁性微珠)，然后加入0.15mol/LNaOH使PCR产物cDNA形成两股单链，吸出上清液用pH7.0的缓冲液中和，使用荧光素标记的测序引物和测序试剂盒(T7 SequenceTM kit)，根据说明书操作对上清液(含正链)和磁性微珠液(含负链)同时进行测序反应。在ALF全自动DNA测序仪上测序。应用系统树分类方法进行HIV-1亚型分型分析[5]。
2 结果
2.1 血清学分析
6份血浆标本用芬兰Labsystems和本室制备的抗HIV-1/2 ELISA试剂检测为抗HIV-1阳性。进一步用美国BIORAD公司的WB试剂确证为抗HIV-1阳性，6份血浆标本都含有HIV-1 p24、p32(除S-139和S-302外)、gp41、p55、p65和gp120/160抗体成分，标本S60、S62、S139和S302还含有p18，见表1。
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表1 抗HIV-1/2酶联免疫测定和免疫印迹法结果
Table 1 The results of ELISA and Western blot for HIV-1/2 标本号*
No. of samples
BIORAD WB
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*用Labsystems和本室制备的HIV-1/2 ELISA试剂检测，全部为阳性。All of six samples were positive, detected by HIV-1/2 ELISA diagnostic kit made in Labsystems, Finland, and in-house.
2.2 序列测定分析结果
对6份血浆标本进行HIV-1 gp120 C2V3区的cDNA序列分析，发现6份血浆的cDNA序列和所编码的氨基酸序列完全相同，见表2和图1。在与国际HIV-1代表株的亚型同源性序列系统树状图同时分析中，6份血浆标本的cDNA序列属于B亚型，见图2。与欧美和泰国HIV-1病毒株在V3环的氨基酸序列比较，发现在6份血浆标本的gp120 V3环中的第2、14、18、20和25位置上的氨基酸残基与欧美B亚型病毒株的同源序列不同，分别为I、L、Q、W和Q，而欧美代表株MN株在6、8、11、24、25和29位置上分别为Y、K、R、K、N和T。尤其在V3环的顶端，欧美HIV-1 B亚型株为GPGR，而邻近国家泰国HIV-1 B亚型株主要为GPGQ，6份血浆标本在V3环中除了在第二位置上的氨基酸残基不同外，泰国HIV-1为T，整个V3环氨基酸残基序列与泰国HIV-1病毒株相同，见表2。经系统树状图分型分析，6份血浆标本cDNA序列属于泰国HIV-1 B亚型，见图2。
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表2 6份血浆标本与欧美和泰国HIV-1病毒株gp120 V3环氨基酸残基序列比较结果
Table 2 Comparison of gp120 V3 amino acid sequences between six plasma and
European/North-American HIV-1 B subtype and Thailand HIV-1 subtype strains B亚型氨基酸
同源序列
B subtype amino
acid consensuss
C
T
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R
P
N
N
N
T
R
K
S
I
H
I
G
P
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G
R
A
F
Y
T
T
G
E
I
I
G
D
I
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R
Q
A
H
C
S60
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I
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L
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Q
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W
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Q
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S62
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I
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L
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Q
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W
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Q
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S72
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I
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L
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Q
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W
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Q
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S78
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L
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Q
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W
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Q
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L
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Q
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W
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Q
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S302
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I
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L
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Q
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W
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Q
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Thai B
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L
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Q
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W
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Q
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MN
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-
Y
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K
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R
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K
N
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T
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Thai B为泰国HIV-1 B基因亚型；MN为欧美HIV-1 B基因亚型。
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Tahi B， Thailand HIV-1 B subtype;MN, European/North-American HIV-1 B subtype.
图1 6份血浆标本HIV-1 gp120 C2V3区cDNA序列(332碱基)和推导的氨基酸序列
Fig.1 cDNA (332bp) and deduced amino acid (AA) consensus sequences of HIV-1 gp120 C2V3 derived from six plasma samples
3 讨论
自从我国1985年发现第一例艾滋病患者以来[7]，到1998年6月底，我国官方媒体报道HIV-1感染者总数达10676例，并估计实际感染人数是报道数字的20～30倍。感染途径也已经从早期的静脉注射毒品到后来的性接触感染、输血感染以及母婴感染方式。据中国预防医学科学院病毒所邵一鸣教授报道[8]，目前HIV-1在国内流行的病毒基因亚型主要为B(欧美B亚型和泰国B亚型)、另外还发现HIV-1 C和E亚型，非洲HIV-1A亚型病毒也已经从个别感染者血液中分离到。HIV-2和HIV-1 O组病毒株的传播至今未见报道，但是值得注意的是邻近国家、印度已经流行HIV-2病毒株[9]。
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本研究对获自某地高危人群的6份HIV-1抗体阳性血浆作进一步血清学确证和HIV-1 cDNA序列测定和系统树分析，我们发现：(1)根据系统树分型分析的结果，这6份血浆中的HIV-1属于HIV-1 B基因亚型；(2)这些血浆标本的cDNA序列与欧美HIV-1病毒株如FR.LAI和US.MN，稍有差别(99%相同)，而与泰国HIV-1病毒株序列完全相同(见图2)，进一步证实了邵一鸣教授关于我国目前的HIV-1病毒株的gp120 V3环顶端由GPGR向GPGQ漂移和欧美HIV-1 B亚型转变为泰国HIV-1 B亚型的报道[10](见图1)，因此可以说这6份感染血浆的HIV-1病毒株属于泰国型的HIV-1 B基因亚型的病毒株；(3)从cDNA序列中我们发现这6份血浆标本的HIV-1 cDNA序列完全相同，推测6份血浆标本获自某种途径同时感染一种HIV-1病毒株的感染者。HIV-1亚型分型分析目前有几种方法，如DNA序列测定分析、V3多肽ELISA分型、异源DNA双链体电泳分析(HMA)、限制性片段长度多形态测定(RFLP)和寡核苷酸探针杂交测定。尽管与其他分型方法相比，DNA序列分析比较昂贵和费时，但是这种方法能够最终判断和分析被检标本的DNA或cDNA序列，在HIV的分子流行病调查和监测HIV的遗传变异方面起到重要的作用。
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图2 6份HIV-1和其他国际HIV-1亚型代表株同源序列系统图
Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of six HIV-1 cDNA sequences with international HIV-1 subtypes consensus sequences
CN(China):中国；UG(Uganda)：乌干达；BE(Belgium)：比利时；GH(Ghana)：加纳；ZR
(Zaire)：扎伊尔；
CM(Cameroon):喀麦隆；GA(Gabon)：加蓬；TH(Thailand)：泰国；FR(France):法国；IN
(India)：印度；
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SA(South Africa):南非；BR(Brazil)：巴西；CY(Cyprus):塞普路斯；US(United States):美国.
参考文献
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[2] Vanden Haesevelde, Decourt M. J.-L, De Leys R J et al. Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate. J Virology. 1994, 69:6191～6198
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[3] Boom R, Sol C J A, Salimans M M M et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clinical Mircrobiology, 1990,28:495～503
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[5] Janssens W, Heyndrickx L, Van de Peer Y et al. Molecular phylogeny of part of the env gene of HIV-1 strains isolated in Cote d'lvoire. AIDS,1994,8:21～26
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[6] Hultman T, Stahl S, Hornes E et al. Direct solid phase sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support. Nucleic Acids Research, 1989,17:4937～4946
[7] 曾毅，王必常，汤得骥等.血友病患者血清中淋巴腺病病毒/人T细胞Ⅲ型病毒抗体检测.病毒学报.1986，2：97～99
[8] Shao YM, Zhao Q, Guan Y et al. Follow-up studies on molecular epidemiology of HIV-1 strains in Ruili region of southwest China. X Ⅰ International Conference on AIDS, July 7-12,1996,Vancouver, Canada. Abstract Vol 2, We. C. 341
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[9] Pfutzner A, Dietrich U, von Eichel U et al. HIV-1 and HIV-2 infections in a high-risk population in Bombay, India:evidence for the spread of HIV-2 and presence of a divergent HIV-1 subtype. J Acquired immune Deficienccy Syndrome, 1992,5:972～977
[10] 邵一鸣，赵全壁，王斌等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV病毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，10：291～299
收稿日期1997-12-29修回日期：1997-03-09, http://www.100md.com