编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段的核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究*
作者：李珣 缪军 薛采芳 秦恩强 喻启桂
单位：第四军医大学寄生虫学教研室(西安，710032)
关键词：恶性疟原虫；核酸疫苗；裂殖子表面蛋白1
中国人兽共患病杂志990107 摘 要 目的 初步研究编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)的17区片段的核酸疫苗(VR1012/MSP1-17)诱导小鼠的体液免疫反应。方法 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分别经每次每只200μg/100μl和100μg/100μl的VR1012/MSP1-17三闪肌注免疫后，用ELISA间接法检测免疫鼠血清中抗MSP1 17区的抗体。结果 两种小鼠均产生明显的抗MSP1 17区的抗体，BALB/c小鼠较C57BL/6小鼠产生的抗体略高，但总体抗体水平不是很高。结论 该核酸疫苗具有一定的免疫原性，其保护性仍需进一步研究。
HUMORAL IMMUNE RESPONSE TO THE NUCLEIC ACID VACCINE
, http://www.100md.com
OF MEROZOITE SURFACE PROTEIN 1 BLOCK 17 OF THE ENCODED
GENE FRAGMENT OF PLASMODIUM FALCIPARUM
Li Xun Miao Jun Xue Caifang Qin Enqiang Yu Qigui
(Department of Parasitology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
ABSTRACT Aim The humoral immune response of A uncleic acid vaccine(VR1012/MSP1-17)encoded a important P.falciparum candidate antigen for vaccine-block 17 of merozoite surface protein 1(MSP1) was investigated.Methods BALB/c or C57LB/6 mice received three times intramusular immunization with 200μg/100μl or 100μg/100μl of VR1012/MSP1-17 per mouse each time respectively,the immune sera were assayd by indirect ELISA.Results mice raised significantly anti-MSP1-17 antibodies.The immunized BALB/c mice produced more antibodies than C57BL/6 mice,but the levels of anti-MSP1-17 antibodies from all immunized mice were not high.Conclusion This P.falciparum blood stage nucleic acid vaccine is immunogenic,the effectiveness of immunized mouse sera in inhibition of parasite growth will be analyzed in the future.
, 百拇医药
KEY WORDS Plasmodium falciparum Nucleic acid vaccine Merozoite surface protein 1
核酸疫苗是一种新型疫苗。其具有明显的优越性。如操作简单，只需接种质粒即可，其为体内真核表达，不需体外表达、纯化等繁琐工作。近期研制的多个病毒和细菌的DNA疫苗均诱导出明显的保护性免疫〔1〕。因此核酸疫苗的出现被称为是第三次疫苗革命〔2〕。美国Hoffman S.L.等近几年从事的疟疾红外期核酸疫苗取得可喜结果〔3〕，而红内期核酸疫苗尚未见报道。
疟原虫红内期的免疫反应主要是由T细胞参与下的体液免疫反应为主。本室在成功构建了编码恶性疟原虫红内期重要的疫苗候补抗原裂殖子表面蛋白1(MSP1)的羧基端片段(即17区)的核酸疫苗的基础上〔4〕。初步研究了该核酸疫苗在小鼠体内引起的体液免疫反应。
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1 材料与方法
1.1 MSP1 17区基因核酸疫苗 VR1012/MSP1-17。VR1012由美国Hoffman S.L.博士惠赠，为含巨细胞病毒早期启动子和BGH加多聚A尾信号和卡那霉素抗性基因的真核表达质粒。VR1012/MSP1-17的构建见文献〔4〕，MSP1-17指恶性疟原虫FUP株MSP1 17区片段基因。VR1012/MSP1-17及对照质粒VR1012转化新鲜感受态JM109菌后，大量增菌，扩增的质粒经QIAGENtip-500 纯化柱(QIAGEN Inc.Germany)纯化，纯度达OD280∶OD260>1.80。
1.2 动物 由第四军医大学动物中心提供。4～6周龄雌性BALB/c和C57BL/6小鼠分为VR1012/MSP1-17免疫组和VR1012对照组，每组5只。
1.3 免疫方法 将纯化质粒用75%酒精洗泡消毒后，溶于0.01MpH7.4的PBS中，配成终浓度200μg/100μl(用于免疫BALB/c小鼠)和100μg/100μl(用于免疫C57BL/6小鼠)。小鼠在每次免疫前用1%戊巴比妥钠按75mg/kg体重腹腔注射麻醉，待小鼠肌肉松弛后，将质粒注射入小鼠的两侧胫前肌和两侧股四头肌内，每点25μl，每只小鼠每次免疫共注射100μl。小鼠分别在0、3、6周进行3次免疫。
, 百拇医药
1.4 抗体检测 两组小鼠分别于免疫前一周和第三次免疫后两周以玻璃毛细管在尾静脉取血，分离出血清。用间接ELISA法测定抗MSP1-17的抗体，具体参照Chang S.P.〔5〕的方法。用BBS (167mM硼酸，134mM NaCl,pH8.0)将真菌表达MSP1 17区蛋白(编码19kD蛋白，简称YMSP119〔6〕，由美国Kaslow D.C.博士惠赠)稀释成0.2μg/ml，每孔50μl包被ELISA板，室温2h后，用BBS洗板3次，每次1min，再用含1%BSA的BBS封闭1h，用含0.5M NaCl的BBS(HSBBS)洗板3次，加入50μl用1%BSA/BBS1:50稀释的小鼠血清，室温1h后，用HSBBS洗板7次，加入50μl1∶10000稀释度的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，室温1h后，用HSBBS洗板7次后BBS洗板1次，加入100μl TMB底物溶液，用DG3022酶联仪读取波长为450nm的OD值。
1.5 统计学方法 用t检验比较两均数间差异。
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2 结 果
BALB/c小鼠经质粒浓度200μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体结果见表1。可见小鼠经3次VR1012/MSP1-17免疫后，产生了明显的抗YM-SP119的抗体，5只小鼠中，有1只OD值为0.520，2只0.500，1只0.250，1只0.130。同样VR1012免疫对照组在免疫前后无特异性抗体产生。
表1 经200μg/100μl的VR1012/MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的抗YMSP119抗体水平
Table 1 The level of anti-YMSP119antibodies in the sera of BALB/c mice immunized with VR1012/MSP1-17 组 别
, http://www.100md.com
Group
免疫前
Before
immunization
免疫后
After
immunization
P
VR1012/MSP1-17
0.074±0.023
0.380±0.179
<0.01
, http://www.100md.com
VR1012
0.063±0.023
0.058±0.031
>0.05
C57BL/6小鼠经质粒浓度100μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体结果见表2。可见小鼠经3次VR1012/MSP1-17免疫后，产生了明显的抗YMSP119的抗体，但较质粒浓度200μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体为低。5只小鼠中有3只OD值为0.250，2只为0.130。而VR1012对照免疫组在免疫前后无特异性抗体产生。表2 经100μg/100μl的VR1012/MSP1-17三次免疫的C57BL/6小鼠的抗YMSP119抗体水平
Table 2 The level of anti-YMSP119antibodies in the sera of C57BL/6 mice immunized with VR1012/MSP1-17 组 别
, 百拇医药
Group
免疫前
Before
immunization
免疫后
After
immunization
P
VR1012/MSP1-17
0.067±0.020
0.202±0.066
<0.01
, http://www.100md.com
VR1012
0.054±0.028
0.063±0.018
>0.05
3 讨 论
以上结果表明VR1012/MSP1-17可以诱导两种单倍型小鼠产生抗MSP1 17区的抗体，BALB/c小鼠经200μg/100μl的VR1012/MSP1-17 3次免疫后产生的抗YMSP119抗体较C57BL/6小鼠经100μg/100μl的VR1012/MSP1-17 3次免疫后产生的抗体水平高。这可能是由于免疫剂量的原因，也可能是两种小鼠的反应性不同的结果。但总的来看，抗体水平并不很高(最高OD值为0.52)。抗体水平不高是大多数核酸疫苗的普遍现象，当前多采用增加T细胞表位或加入细胞因子基因的方式试图增加核酸疫苗的体液免疫反应。当然检测VR1012/MSP1-17免疫鼠血清抑制疟原虫生长的能力和提高该核酸疫苗的体液免疫反应将作为下一步研究工作。
, 百拇医药
原核表达的约氏疟原虫MSP1 C端17区片段蛋白可诱导小鼠产生完全抵抗鼠疟攻击的保护性免疫〔7〕，真菌表达的与外源T细胞位点融合的恶性疟原虫MSP1 17区片段蛋白可引起猴体明显的保护性免疫〔8〕，可见该区表达蛋白是重要的疫苗候选抗原。将MSP1的17区基因应用于核酸疫苗具有与上述的基因工程疫苗相比明显的优势，除前言中提到的以外，尤为重要的是核酸疫苗真核体内表达的特点可以保证MSP1的17区包含的两个生长因子样结构的准确形成，两个生长因子样结构内有数个双硫键，这些双硫键是形成这一结构的关键，也是该区功能发挥的重要一环〔9〕。Hoffman等疟疾核酸疫苗仅限于红外期的研究，本研究对于研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。*本研究得到联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织热带病研究和培训特别规划署(TDR)的资助IDNo.950385
4 参考文献
1.Waine G,Mcmanus DP.Nucleic acids:vaccines of the future.Parasitology Today,1995,11(3):113.
, http://www.100md.com
2.Dixon B.Third Vaccine Revolution.Bio-Technology,1995,13:420.
3.Doolan DL,Hoffman SL.Muti-gene vaccination against malaria:a multistage,multiimmune response approach.Parasitology Today,1997,13(5):171.
4.缪军等.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因系列核酸疫苗的构建.中国人兽共患病杂志，1997，13(5)：135.
5.Chang SP,George SNH,Kato A,et.al.Generalized immunological recognition of the major merozoite surface antigen(gp195)of Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:6343.
, 百拇医药
6.Kaslow DC,Hui GSH,Kumer S.Expression and antigenicity of Plasmodium falciparum major merozoite surface protein (MSP119)variants secreted from Saccharomyces Cerevisiae.Mol Biochem Parasitol,1994,63:283.
7.Daly TM,Long CA.A recombinant 15-kilodalton carboxyl-terminal fragment of lasmodium yoelii 17 XL merozoite furface proteinl induces a protective immune respones in mice.Infect Immun,1993,61(6):2452.
8.Kumar S.Yadava A, keister DB;et al.Immunogenicity and in ivvo ifficacy of recombinant Plasmodium falciparum. merozoite surface protein-1 in Aotus monkeys.Mol Med,1995,1:325.
9.Blackman MJ,Ling IT,Nicholls SC,et al.Proteolytic processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 produce a membrane-bound fragment containing two epidermal growth factor-like domains.Mol Biochem Parsitol,1991,49:29.
1998年3月16日收稿 1998年8月5日修回, 百拇医药
单位：第四军医大学寄生虫学教研室(西安，710032)
关键词：恶性疟原虫；核酸疫苗；裂殖子表面蛋白1
中国人兽共患病杂志990107 摘 要 目的 初步研究编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)的17区片段的核酸疫苗(VR1012/MSP1-17)诱导小鼠的体液免疫反应。方法 BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠分别经每次每只200μg/100μl和100μg/100μl的VR1012/MSP1-17三闪肌注免疫后，用ELISA间接法检测免疫鼠血清中抗MSP1 17区的抗体。结果 两种小鼠均产生明显的抗MSP1 17区的抗体，BALB/c小鼠较C57BL/6小鼠产生的抗体略高，但总体抗体水平不是很高。结论 该核酸疫苗具有一定的免疫原性，其保护性仍需进一步研究。
HUMORAL IMMUNE RESPONSE TO THE NUCLEIC ACID VACCINE
, http://www.100md.com
OF MEROZOITE SURFACE PROTEIN 1 BLOCK 17 OF THE ENCODED
GENE FRAGMENT OF PLASMODIUM FALCIPARUM
Li Xun Miao Jun Xue Caifang Qin Enqiang Yu Qigui
(Department of Parasitology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
ABSTRACT Aim The humoral immune response of A uncleic acid vaccine(VR1012/MSP1-17)encoded a important P.falciparum candidate antigen for vaccine-block 17 of merozoite surface protein 1(MSP1) was investigated.Methods BALB/c or C57LB/6 mice received three times intramusular immunization with 200μg/100μl or 100μg/100μl of VR1012/MSP1-17 per mouse each time respectively,the immune sera were assayd by indirect ELISA.Results mice raised significantly anti-MSP1-17 antibodies.The immunized BALB/c mice produced more antibodies than C57BL/6 mice,but the levels of anti-MSP1-17 antibodies from all immunized mice were not high.Conclusion This P.falciparum blood stage nucleic acid vaccine is immunogenic,the effectiveness of immunized mouse sera in inhibition of parasite growth will be analyzed in the future.
, 百拇医药
KEY WORDS Plasmodium falciparum Nucleic acid vaccine Merozoite surface protein 1
核酸疫苗是一种新型疫苗。其具有明显的优越性。如操作简单，只需接种质粒即可，其为体内真核表达，不需体外表达、纯化等繁琐工作。近期研制的多个病毒和细菌的DNA疫苗均诱导出明显的保护性免疫〔1〕。因此核酸疫苗的出现被称为是第三次疫苗革命〔2〕。美国Hoffman S.L.等近几年从事的疟疾红外期核酸疫苗取得可喜结果〔3〕，而红内期核酸疫苗尚未见报道。
疟原虫红内期的免疫反应主要是由T细胞参与下的体液免疫反应为主。本室在成功构建了编码恶性疟原虫红内期重要的疫苗候补抗原裂殖子表面蛋白1(MSP1)的羧基端片段(即17区)的核酸疫苗的基础上〔4〕。初步研究了该核酸疫苗在小鼠体内引起的体液免疫反应。
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1 材料与方法
1.1 MSP1 17区基因核酸疫苗 VR1012/MSP1-17。VR1012由美国Hoffman S.L.博士惠赠，为含巨细胞病毒早期启动子和BGH加多聚A尾信号和卡那霉素抗性基因的真核表达质粒。VR1012/MSP1-17的构建见文献〔4〕，MSP1-17指恶性疟原虫FUP株MSP1 17区片段基因。VR1012/MSP1-17及对照质粒VR1012转化新鲜感受态JM109菌后，大量增菌，扩增的质粒经QIAGENtip-500 纯化柱(QIAGEN Inc.Germany)纯化，纯度达OD280∶OD260>1.80。
1.2 动物 由第四军医大学动物中心提供。4～6周龄雌性BALB/c和C57BL/6小鼠分为VR1012/MSP1-17免疫组和VR1012对照组，每组5只。
1.3 免疫方法 将纯化质粒用75%酒精洗泡消毒后，溶于0.01MpH7.4的PBS中，配成终浓度200μg/100μl(用于免疫BALB/c小鼠)和100μg/100μl(用于免疫C57BL/6小鼠)。小鼠在每次免疫前用1%戊巴比妥钠按75mg/kg体重腹腔注射麻醉，待小鼠肌肉松弛后，将质粒注射入小鼠的两侧胫前肌和两侧股四头肌内，每点25μl，每只小鼠每次免疫共注射100μl。小鼠分别在0、3、6周进行3次免疫。
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1.4 抗体检测 两组小鼠分别于免疫前一周和第三次免疫后两周以玻璃毛细管在尾静脉取血，分离出血清。用间接ELISA法测定抗MSP1-17的抗体，具体参照Chang S.P.〔5〕的方法。用BBS (167mM硼酸，134mM NaCl,pH8.0)将真菌表达MSP1 17区蛋白(编码19kD蛋白，简称YMSP119〔6〕，由美国Kaslow D.C.博士惠赠)稀释成0.2μg/ml，每孔50μl包被ELISA板，室温2h后，用BBS洗板3次，每次1min，再用含1%BSA的BBS封闭1h，用含0.5M NaCl的BBS(HSBBS)洗板3次，加入50μl用1%BSA/BBS1:50稀释的小鼠血清，室温1h后，用HSBBS洗板7次，加入50μl1∶10000稀释度的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，室温1h后，用HSBBS洗板7次后BBS洗板1次，加入100μl TMB底物溶液，用DG3022酶联仪读取波长为450nm的OD值。
1.5 统计学方法 用t检验比较两均数间差异。
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2 结 果
BALB/c小鼠经质粒浓度200μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体结果见表1。可见小鼠经3次VR1012/MSP1-17免疫后，产生了明显的抗YM-SP119的抗体，5只小鼠中，有1只OD值为0.520，2只0.500，1只0.250，1只0.130。同样VR1012免疫对照组在免疫前后无特异性抗体产生。
表1 经200μg/100μl的VR1012/MSP1-17三次免疫的BALB/c小鼠的抗YMSP119抗体水平
Table 1 The level of anti-YMSP119antibodies in the sera of BALB/c mice immunized with VR1012/MSP1-17 组 别
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Group
免疫前
Before
immunization
免疫后
After
immunization
P
VR1012/MSP1-17
0.074±0.023
0.380±0.179
<0.01
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VR1012
0.063±0.023
0.058±0.031
>0.05
C57BL/6小鼠经质粒浓度100μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体结果见表2。可见小鼠经3次VR1012/MSP1-17免疫后，产生了明显的抗YMSP119的抗体，但较质粒浓度200μg/100μl免疫后抗YMSP119的抗体为低。5只小鼠中有3只OD值为0.250，2只为0.130。而VR1012对照免疫组在免疫前后无特异性抗体产生。表2 经100μg/100μl的VR1012/MSP1-17三次免疫的C57BL/6小鼠的抗YMSP119抗体水平
Table 2 The level of anti-YMSP119antibodies in the sera of C57BL/6 mice immunized with VR1012/MSP1-17 组 别
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Group
免疫前
Before
immunization
免疫后
After
immunization
P
VR1012/MSP1-17
0.067±0.020
0.202±0.066
<0.01
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VR1012
0.054±0.028
0.063±0.018
>0.05
3 讨 论
以上结果表明VR1012/MSP1-17可以诱导两种单倍型小鼠产生抗MSP1 17区的抗体，BALB/c小鼠经200μg/100μl的VR1012/MSP1-17 3次免疫后产生的抗YMSP119抗体较C57BL/6小鼠经100μg/100μl的VR1012/MSP1-17 3次免疫后产生的抗体水平高。这可能是由于免疫剂量的原因，也可能是两种小鼠的反应性不同的结果。但总的来看，抗体水平并不很高(最高OD值为0.52)。抗体水平不高是大多数核酸疫苗的普遍现象，当前多采用增加T细胞表位或加入细胞因子基因的方式试图增加核酸疫苗的体液免疫反应。当然检测VR1012/MSP1-17免疫鼠血清抑制疟原虫生长的能力和提高该核酸疫苗的体液免疫反应将作为下一步研究工作。
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原核表达的约氏疟原虫MSP1 C端17区片段蛋白可诱导小鼠产生完全抵抗鼠疟攻击的保护性免疫〔7〕，真菌表达的与外源T细胞位点融合的恶性疟原虫MSP1 17区片段蛋白可引起猴体明显的保护性免疫〔8〕，可见该区表达蛋白是重要的疫苗候选抗原。将MSP1的17区基因应用于核酸疫苗具有与上述的基因工程疫苗相比明显的优势，除前言中提到的以外，尤为重要的是核酸疫苗真核体内表达的特点可以保证MSP1的17区包含的两个生长因子样结构的准确形成，两个生长因子样结构内有数个双硫键，这些双硫键是形成这一结构的关键，也是该区功能发挥的重要一环〔9〕。Hoffman等疟疾核酸疫苗仅限于红外期的研究，本研究对于研制有效的恶性疟原虫红内期核酸疫苗是一个有益的尝试。*本研究得到联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织热带病研究和培训特别规划署(TDR)的资助IDNo.950385
4 参考文献
1.Waine G,Mcmanus DP.Nucleic acids:vaccines of the future.Parasitology Today,1995,11(3):113.
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2.Dixon B.Third Vaccine Revolution.Bio-Technology,1995,13:420.
3.Doolan DL,Hoffman SL.Muti-gene vaccination against malaria:a multistage,multiimmune response approach.Parasitology Today,1997,13(5):171.
4.缪军等.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因系列核酸疫苗的构建.中国人兽共患病杂志，1997，13(5)：135.
5.Chang SP,George SNH,Kato A,et.al.Generalized immunological recognition of the major merozoite surface antigen(gp195)of Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:6343.
, 百拇医药
6.Kaslow DC,Hui GSH,Kumer S.Expression and antigenicity of Plasmodium falciparum major merozoite surface protein (MSP119)variants secreted from Saccharomyces Cerevisiae.Mol Biochem Parasitol,1994,63:283.
7.Daly TM,Long CA.A recombinant 15-kilodalton carboxyl-terminal fragment of lasmodium yoelii 17 XL merozoite furface proteinl induces a protective immune respones in mice.Infect Immun,1993,61(6):2452.
8.Kumar S.Yadava A, keister DB;et al.Immunogenicity and in ivvo ifficacy of recombinant Plasmodium falciparum. merozoite surface protein-1 in Aotus monkeys.Mol Med,1995,1:325.
9.Blackman MJ,Ling IT,Nicholls SC,et al.Proteolytic processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 produce a membrane-bound fragment containing two epidermal growth factor-like domains.Mol Biochem Parsitol,1991,49:29.
1998年3月16日收稿 1998年8月5日修回, 百拇医药