谷氨酰胺对猪急性重症胰腺炎后肠源性细菌/内毒素易位的影响
作者：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国 邵海枫 肖光夏 黎 鳌
单位：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国 邵海枫 南京军区南京总医院(南京，210002)；肖光夏 黎 鳌 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所
关键词：急性胰腺炎；细菌/内毒素易位；谷氨酰胺
肠外与肠内营养990110 摘要 目的：观察静脉内滴注谷氨酰胺(Gln)对急性重症胰腺炎(ASP)后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用。 方法：选健康长白种猪21头，体重16～22 kg，雌雄不限，随机分为四组。Ⅰ组：假手术对照组(n=5);Ⅱ组：ASP对照组(n=5)；Ⅲ组：ASP+甘氨酸(Gly)组(n=5)；Ⅳ组：ASP+Gln组(n=6)。在麻醉状态下，进腹向胰管内注入 5%牛磺胆酸钠混合液1 ml/kg(内含8 000～10 000 BAEE单位胰蛋白酶/ml，pH 7.6)诱导ASP。以0.9%NaCl磷酸盐缓冲液取代5%牛磺胆酸钠混合液即为假手术对照组。采集腔静脉血作内毒素测定(鲎试剂法)。ASP后72 h，采集门、腔静脉血作细菌定量培养和细菌鉴定。然后静脉推注10%氯化钾20 ml处死后，立即进胸腹取大小肠系膜淋巴结、肺组织、肺门淋巴结、胰腺组织，称重后研磨成组织匀浆，并作细菌定量培养和细菌鉴定。 结果：静脉内输注Gln后可使血浆中Gln浓度较Ⅰ组、Ⅱ组明显升高(P均<0.01)。静脉内Gln支持可明显降低血浆内毒素水平，且使血液和组织器官中易位的细菌数量均出现非常显著的下降。 结论：静脉内Gln支持可显著地升高血浆Gln水平，可显著地减轻ASP后肠源性细菌/内毒素易位。
, 百拇医药
中图法分类号 R576
Influence of glutamine on gut bacteria/endotoxin translocation
in acute severe pancreatitis
Tu Weifeng,Li Jiesou,Zhu Weiming et al
Research Institute of General Surgery,Nanjing General Hospital of PLA(Nanjing,210002)
Abstract Objectives:To observe the protection of intravenous glutamine(Gln) on gut-originated bacteria/endotoxin translocation following acute severe pancreatitis(ASP) induced by sodium taurocholate. Methods:There were 21 pigs weighing 16～22 kg,which were divided into four groups.Group Ⅰ(n=5):sham-control;Group Ⅱ(n=5):ASP-control;Group Ⅲ(n=5):ASP+glycine(Gly);Group Ⅳ(n=6):ASP+Gln;Anesthesized pigs were subjected ASP induced by injecting 1 ml/kg of combined solution of 5% sodium taurocholate and 8 000～10 000 BAEE units trypsin/ml into pancreas via pancreatic duct.Plasma glutamine were measured by the high performance liquid-phase technique(the product of Waters,U.S.A.).Systemic plasma endotoxin levels was quantified by the chromogenic limulus amebocyte lysate(LAL) technique.Both portal and systemic blood samples were obtained before and 72 h following ASP and cultured for aerobic as well as anaerobic bacterial growth.Subsequently,all pigs were sacrificed by injecting 20 ml of 10% KCl intravenously.Specimens of tissue from mesenteriolum and mesocolon lymph nodes,lung,pulmonary portal lymph nodes and pancreas were removed,weighed and homogenized in grinding tubes.Aliquots of the homogenate were cultured as blood mentioned above.Positive specimens were subcultured and identified by standard procedure. Results:Intravenous glutamine could effectively prevent the decrease of plasma glutamine levels following acute severe pancreatitis.Intravenous admission of glutamine reduced significantly the levels of systemic plasma endotoxin and the magnitude of bacteria translocation to the portal and blood and the distant organs. Conclusions:Intravenous admission of glutamine can enhance plasma glutamine concentrations.Intravenous admission of glutamine can effectively decrease gutoriginated bacteria/endotoxin translocation.
, 百拇医药
Key words Acute pancreatitis Bacteria/endotoxin translocation Glutamine
肠道细菌和内毒素易位是导致急性重症胰腺炎(ASP)并发感染、脓毒症和死亡的重要原因之一〔1～3〕。大量动物实验、临床研究证实，肠道内或肠道外给予谷氨酰胺(Gln)具有增强粘膜屏障功能和降低肠道内细菌/内毒素易位的作用，从而明显降低和减轻大面积烧伤后、重症胰腺炎、重症监护病人继发感染的发生率和严重程度〔4～7〕。但由于Gln的极不稳定性，遇热易降解并释放出聚谷氨酸等毒性物质，故难以常规配制在TPN制剂中供临床使用。本研究使用高纯度Gln粉(99.0%)，观察Gln对ASP后肠源性细菌/内毒素易位的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 选健康长白种猪21头(由南京军区动物实验中心提供)，体重16～22 kg，雌雄不限，随机分为四组：
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Ⅰ组：假手术对照组(n=5)
Ⅱ组：胰腺炎组(n=5)
Ⅲ组：胰腺炎+甘氨酸(Gly)组(n=5)
Ⅳ组：胰腺炎+Gln组(n=6)
1.2 Gln粉剂的制备、鉴定和投给方法 日本进口的高纯度Gln粉(99.0%)，在无菌条件下分装成0.5 g、1 g、2 g、2.5 g，经60Co辐照后备用。随机取5份60Co辐照后的Gln经系列真菌、细菌培养和致热原试验证实均为阴性，可供静脉内使用(此项工作由我院药剂制剂科和微生物科协助完成)。Gln用量按总氮量(0.56 g/kg.d-1)的25%提供，即0.74 g/(kg.d)。Gln或Gly在成功诱导ASP后6 h开始使用。Gln在临用前15 min以0.9%NaCl溶解并配成2%浓度，经上腔静脉均匀输入(约需1 h左右，1次/8 h)。以等氮量Gly作为Gln对照组。
, 百拇医药
1.3 急性重症胰腺炎的诱导 无菌条件下，正中腹直肌切口进腹，暴露胰十二指肠，在胰管开口对侧切一纵行小切口(约1.5～2.5 cm)。仔细暴露胰管开口处，并置入直径为1 mm的聚氯乙烯导管，深约3～5 cm，并暂时结扎胰管，逆行在30 mmHg压力下缓慢地注入5%牛磺胆酸钠混合液1 ml/kg(内含8 000～10 000 BAEE单位胰蛋白酶/ml,pH 7.6,牛磺胆酸钠和胰蛋白酶均为Sigma产品)。10 min后拔除胰管内导管。以0.9%缓冲等渗盐水(pH 7.6)取代5%牛磺胆酸钠混合液即为对照组，然后依次缝合十二指肠和腹壁。液体在手术期间及手术后8 h以内按250 ml/kg输入，以后按(125±25) ml/kg，交替使用10%葡萄糖注射液和复方乳酸林格液。
1.3 观察指标和方法
1.3.1 一般观察 每天注意猪的全身情况，包括血压、脉搏、呼吸、体温、动静脉血气分析、白细胞计数，以及厌食、嗜睡或烦躁和留置导尿记录24 h尿量等。
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1.3.2 样本采集和处理 分别于ASP诱导前30 min(T0)、ASP诱导后6 h(T1)、24 h(T2)、48 h(T3)、72 h(T4)采集腔静脉血样本，以测定血浆内毒素(采用上海医化所内毒素定量测定试剂盒)和Gln水平(采用美国Wasters公司生产的高效液相色谱仪测定)。72 h时点同时采集门静脉血作细菌定量培养，并按常规作细菌学鉴定。ASP后72 h，存活的猪用10%KCl处死(0.1～0.2 g/kg)，在无菌条件下剖胸腹取肺组织、肺门淋巴结、大小肠的肠系膜淋巴结、胰腺组织作细菌学定量培养和常规细菌学鉴定。在上述采样过程中所涉及到的任何器具，均经去热原处理和高压灭菌消毒。
2 结果
2.1 血浆Gln的变化 Ⅱ组和Ⅲ组血浆Gln在诱导ASP后均出现较明显的下降，ASP后24 h、48 h和72 h各个时点血浆Gln与正常对照组比较，均有非常显著的统计学差异(P均<0.01)。静脉内给予Gln支持后，在ASP后24 h、48 h和72 h各个时点血浆Gln均较Ⅱ组和Ⅲ组有非常显著的上升(表1)。
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表1 血浆谷氨酰胺的变化 (μmol/L)
Tab. 1 Change in plasma Gln (μmol/L) 组别
T0
T2
T3
T4
Ⅰ组
395.5±57.9
285.8±45.5
316.2±45.4
, 百拇医药 303.4±51.6
Ⅱ组
363.0±101.0
180.7±73.3**
204.6±52.5**
182.8±20.5**
Ⅲ组
378.1±98.9
179.3±60.5**
188.3±48.4**
, 百拇医药
176.4±23.5**
Ⅳ组
363.6±64.5
337.3±76.5
377.9±96.4
322.8±85.0
与Ⅰ组比较：*P<0.05,**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
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2.2 血浆内毒素的变化 Ⅲ组血浆内毒素的变化与Ⅱ组基本一致，两组间比较无明显统计学差异。静脉内给予Gln支持可使血浆内毒素水平大幅度降低，T2、T3和T4 3个时点的血浆内毒素水平与Ⅱ组和Ⅲ组比较均有非常显著的统计学差异(P均<0.01)(表2)。表2 血浆内毒素的变化 (EU/L)
Tab. 2 Change in plasma endotoxin (EU/L) 组别
T0
T1
T2
T3
T4
, 百拇医药
Ⅱ组
0.48±0.12
1.88±0.74**
2.69±0.91**
3.91±1.21**
2.61±0.25**
Ⅲ组
0.54±0.12
1.80±0.86**
2.52±0.65**
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3.47±0.31**
2.48±0.19**
Ⅳ组
0.51±0.10
1.99±0.82**
1.63±0.38
2.15±0.69
2.18±0.51
, 百拇医药
与T0比较：**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
2.3 血和组织细菌培养结果 ASP诱导后72 h，在小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结均可培养出致病菌，绝大部分为肠道常驻菌，以革兰阴性杆菌为主。静脉内给予Gln支持可大幅度减少小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结等部位易位细菌的数量(表3)。
表3 血和组织细菌培养结果 (105CFU/ml或g)
Tab. 3 Bacterial cultrue results of blood and tissues (×105 CFU/ml or g) 组别
静脉血
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肺组织
肺门淋巴结
胰腺
门脉血
小肠淋巴结
大肠淋巴结
Ⅰ组
0
0
0
0
0
0
0
, 百拇医药
Ⅱ组
11.37±6.31**
45.06±20.40**
31.68±37.49**
66.00±12.43**
14.94±4.25**
48.67±10.78**
36.34±22.37**
Ⅲ组
10.51±7.54**
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25.50±20.20**
29.33±25.77**
58.36±34.19**
14.09±2.65**
49.72±8.73**
34.67±21.19**
Ⅳ组
0.01±0.01
2.01±3.09
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0.30±0.38
25.03±26.70
0.41±0.30
0.57±0.89
0.05±0.03
与Ⅰ组比较：*P<0.05,**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
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3 讨论
近年来，大量临床和动物实验研究显示，胰腺炎性浸润、出血、坏死可释放大量胰酶、溶酶体酶、脂酶、磷脂酶至邻近组织或入血循环造成胰腺本身和胰腺以外远距离脏器的消化性损伤，由此引发的补体、中性粒细胞、氧自由基、蛋白水解酶(如弹性蛋白酶)、游离脂肪酸、细胞因子(如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、PAF)和缺血-再灌注损伤介导造成的胰腺本身及胰腺以外远距离脏器损伤。胰腺炎后肠道功能受损、肠道屏障功能下降、肠道内微生态环境和正常菌群失调(可以是内源性如上述因素，也可以外源性如消化道的禁食、TPN、滥用抗生素)，引起肠道内细菌和内毒素向邻近组织和肠道外组织易位，导致肠源性菌血症和内毒素血症甚至脓毒症，是造成重症胰腺炎死亡率和后期并发症(如SIRS、ARDS、MODS)发生率居高不下的另一个重要原因〔8～10〕。Runkel等〔1〕在急性胰腺炎(AP)性脓毒症鼠中系统进行了肠源性细菌易位的观察和机制探讨，结果显示诱导AP后48 h和96 h肠系膜淋巴结细菌易位发生率均为100%，提示诱导AP 48 h之内早有肠源性细菌易位的发生。本实验结果也证实ASP可诱发肠源性细菌的易位，且ASP后72 h易位至肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺和肺门淋巴结的细菌数量均很大。已有资料表明，Gln支持(无论是肠道内还是肠道外)在肠粘膜屏障功能、改善肠道内微生态环境和预防肠源性细菌和内毒素易位起着非常重要的作用〔6，7，10，11〕。
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本实验结果显示，ASP可引起血浆Gln水平明显下降，Ⅱ组和Ⅲ组猪血浆Gln水平在ASP后3天均明显低于ASP诱导前或假手术对照组同时点Gln水平，约为ASP诱导前的45%～55%左右。而Gln不仅是快速生长和分化的肠粘膜上皮细胞的重要氧化燃料和能量合成底物，也是维持肠粘膜结构、粘膜屏障功能、肠道免疫功能和微生态环境的重要调节因子。如果体内Gln缺乏，则可引起肠粘膜萎缩、屏障功能减弱、sIgA分泌减少、肠道内菌群失调，导致肠道内细菌/内毒素易位。我们推测ASP后早期就出现细菌/内毒素易位，不仅与ASP后中性粒细胞、炎性介质、细胞因子、蛋白水解酶(如弹性蛋白酶、磷脂酶A2)、缺血/再灌注损伤等介导肠粘膜结构和屏障功能损伤有关，而且还可能与ASP后血浆Gln水平低下密切相关。本实验结果发现，静脉内输注Gln不仅可显著提高血浆Gln水平，而且使血浆内毒素水平明显下降、易位至门静脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量显著降低，证实ASP后血浆Gln水平下降是ASP后细菌/内毒素易位的重要原因之一。我们将Gln粉剂成功地应用于小肠移植病人，也取得了较为满意的疗效〔12〕。结果提示Gln在减轻胰腺炎后的肠道粘膜损伤、维持胰腺炎后的肠道内正常菌群、降低胰腺炎后的肠道内细菌和内毒素易位、减少ASP期间肠源性菌血症、内毒素血症、脓毒症、甚至ARDS和MODS发生率均可能起着积极的作用。
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参考文献
1 Runkel NF,Moody FG,Smith GS et al.The role of the gut in the development of sepsis in acute pancreatitis.J Surg Res,1991,51(1):18
2 Tarpila E,Nystrom PO,Franzen L et al.Bacterial translocation during pancreatitis in rats.Eur J Surg,1993,159:109
3 Medich DS,Lee TK,Melhem MF et al.Pathogenesis of pancreatic sepsis.Am J Surg,1993,165(1):46
4 Chen K,Okuma T,Okammura K et al.Glutamine-supplemented parenteral nutrition improves gut mucosa integrity and function in endotoxemic rats.JPEN,1994,18(2):167
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5 Ardawi MSM.Glutamine and alanine metabolism in lungs of septic rats.Clin Sci,1991,81:603
6 Gianotti L,Alexander JW,Gennari R et al.Oral glutamine decrease bacterial translocation and improves survival in experimental gut-origin sepsis.JPEN,1995,19(1):6974
7 Zhang W,Frankel WL,Bain A et al.Glutamine reduce bacterial translocation after small bowel transplantation in cyclosporine-treated rats.J Surg Res,1995,58:159
, 百拇医药
8 Isenmann R,Bochler MW.Infection and acute pancreatitis.Br J Surg,1994,81:1707
9 Foitzik T,Castillo CF,Ferraro MJ et al.Pathogensis and prevention of early pancreatic infection in experimental acute necrotizing pancreatitis.Ann Surg,1995,222(1):57
10 Wusteman M,Tate H,Weaver L et al.The effect of enteral glutamine deprivation and supplementation on the structure of rat small-intestine mucosa during a systemic injury rsponse.JPEN,1995,19(1):22
11 Hartmann F,Plauth M.Intestinal glutamine metabolism.Metabolism,1989,38(8):18
12 李幼生，黎介寿，李 宁等.谷氨酰胺与谷氨酰胺双肽在小肠移植病人中的临床应用.肠外与肠内营养，1996；3(4)：203
(1998-03-04收稿), http://www.100md.com
单位：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国 邵海枫 南京军区南京总医院(南京，210002)；肖光夏 黎 鳌 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所
关键词：急性胰腺炎；细菌/内毒素易位；谷氨酰胺
肠外与肠内营养990110 摘要 目的：观察静脉内滴注谷氨酰胺(Gln)对急性重症胰腺炎(ASP)后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用。 方法：选健康长白种猪21头，体重16～22 kg，雌雄不限，随机分为四组。Ⅰ组：假手术对照组(n=5);Ⅱ组：ASP对照组(n=5)；Ⅲ组：ASP+甘氨酸(Gly)组(n=5)；Ⅳ组：ASP+Gln组(n=6)。在麻醉状态下，进腹向胰管内注入 5%牛磺胆酸钠混合液1 ml/kg(内含8 000～10 000 BAEE单位胰蛋白酶/ml，pH 7.6)诱导ASP。以0.9%NaCl磷酸盐缓冲液取代5%牛磺胆酸钠混合液即为假手术对照组。采集腔静脉血作内毒素测定(鲎试剂法)。ASP后72 h，采集门、腔静脉血作细菌定量培养和细菌鉴定。然后静脉推注10%氯化钾20 ml处死后，立即进胸腹取大小肠系膜淋巴结、肺组织、肺门淋巴结、胰腺组织，称重后研磨成组织匀浆，并作细菌定量培养和细菌鉴定。 结果：静脉内输注Gln后可使血浆中Gln浓度较Ⅰ组、Ⅱ组明显升高(P均<0.01)。静脉内Gln支持可明显降低血浆内毒素水平，且使血液和组织器官中易位的细菌数量均出现非常显著的下降。 结论：静脉内Gln支持可显著地升高血浆Gln水平，可显著地减轻ASP后肠源性细菌/内毒素易位。
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中图法分类号 R576
Influence of glutamine on gut bacteria/endotoxin translocation
in acute severe pancreatitis
Tu Weifeng,Li Jiesou,Zhu Weiming et al
Research Institute of General Surgery,Nanjing General Hospital of PLA(Nanjing,210002)
Abstract Objectives:To observe the protection of intravenous glutamine(Gln) on gut-originated bacteria/endotoxin translocation following acute severe pancreatitis(ASP) induced by sodium taurocholate. Methods:There were 21 pigs weighing 16～22 kg,which were divided into four groups.Group Ⅰ(n=5):sham-control;Group Ⅱ(n=5):ASP-control;Group Ⅲ(n=5):ASP+glycine(Gly);Group Ⅳ(n=6):ASP+Gln;Anesthesized pigs were subjected ASP induced by injecting 1 ml/kg of combined solution of 5% sodium taurocholate and 8 000～10 000 BAEE units trypsin/ml into pancreas via pancreatic duct.Plasma glutamine were measured by the high performance liquid-phase technique(the product of Waters,U.S.A.).Systemic plasma endotoxin levels was quantified by the chromogenic limulus amebocyte lysate(LAL) technique.Both portal and systemic blood samples were obtained before and 72 h following ASP and cultured for aerobic as well as anaerobic bacterial growth.Subsequently,all pigs were sacrificed by injecting 20 ml of 10% KCl intravenously.Specimens of tissue from mesenteriolum and mesocolon lymph nodes,lung,pulmonary portal lymph nodes and pancreas were removed,weighed and homogenized in grinding tubes.Aliquots of the homogenate were cultured as blood mentioned above.Positive specimens were subcultured and identified by standard procedure. Results:Intravenous glutamine could effectively prevent the decrease of plasma glutamine levels following acute severe pancreatitis.Intravenous admission of glutamine reduced significantly the levels of systemic plasma endotoxin and the magnitude of bacteria translocation to the portal and blood and the distant organs. Conclusions:Intravenous admission of glutamine can enhance plasma glutamine concentrations.Intravenous admission of glutamine can effectively decrease gutoriginated bacteria/endotoxin translocation.
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Key words Acute pancreatitis Bacteria/endotoxin translocation Glutamine
肠道细菌和内毒素易位是导致急性重症胰腺炎(ASP)并发感染、脓毒症和死亡的重要原因之一〔1～3〕。大量动物实验、临床研究证实，肠道内或肠道外给予谷氨酰胺(Gln)具有增强粘膜屏障功能和降低肠道内细菌/内毒素易位的作用，从而明显降低和减轻大面积烧伤后、重症胰腺炎、重症监护病人继发感染的发生率和严重程度〔4～7〕。但由于Gln的极不稳定性，遇热易降解并释放出聚谷氨酸等毒性物质，故难以常规配制在TPN制剂中供临床使用。本研究使用高纯度Gln粉(99.0%)，观察Gln对ASP后肠源性细菌/内毒素易位的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 选健康长白种猪21头(由南京军区动物实验中心提供)，体重16～22 kg，雌雄不限，随机分为四组：
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Ⅰ组：假手术对照组(n=5)
Ⅱ组：胰腺炎组(n=5)
Ⅲ组：胰腺炎+甘氨酸(Gly)组(n=5)
Ⅳ组：胰腺炎+Gln组(n=6)
1.2 Gln粉剂的制备、鉴定和投给方法 日本进口的高纯度Gln粉(99.0%)，在无菌条件下分装成0.5 g、1 g、2 g、2.5 g，经60Co辐照后备用。随机取5份60Co辐照后的Gln经系列真菌、细菌培养和致热原试验证实均为阴性，可供静脉内使用(此项工作由我院药剂制剂科和微生物科协助完成)。Gln用量按总氮量(0.56 g/kg.d-1)的25%提供，即0.74 g/(kg.d)。Gln或Gly在成功诱导ASP后6 h开始使用。Gln在临用前15 min以0.9%NaCl溶解并配成2%浓度，经上腔静脉均匀输入(约需1 h左右，1次/8 h)。以等氮量Gly作为Gln对照组。
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1.3 急性重症胰腺炎的诱导 无菌条件下，正中腹直肌切口进腹，暴露胰十二指肠，在胰管开口对侧切一纵行小切口(约1.5～2.5 cm)。仔细暴露胰管开口处，并置入直径为1 mm的聚氯乙烯导管，深约3～5 cm，并暂时结扎胰管，逆行在30 mmHg压力下缓慢地注入5%牛磺胆酸钠混合液1 ml/kg(内含8 000～10 000 BAEE单位胰蛋白酶/ml,pH 7.6,牛磺胆酸钠和胰蛋白酶均为Sigma产品)。10 min后拔除胰管内导管。以0.9%缓冲等渗盐水(pH 7.6)取代5%牛磺胆酸钠混合液即为对照组，然后依次缝合十二指肠和腹壁。液体在手术期间及手术后8 h以内按250 ml/kg输入，以后按(125±25) ml/kg，交替使用10%葡萄糖注射液和复方乳酸林格液。
1.3 观察指标和方法
1.3.1 一般观察 每天注意猪的全身情况，包括血压、脉搏、呼吸、体温、动静脉血气分析、白细胞计数，以及厌食、嗜睡或烦躁和留置导尿记录24 h尿量等。
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1.3.2 样本采集和处理 分别于ASP诱导前30 min(T0)、ASP诱导后6 h(T1)、24 h(T2)、48 h(T3)、72 h(T4)采集腔静脉血样本，以测定血浆内毒素(采用上海医化所内毒素定量测定试剂盒)和Gln水平(采用美国Wasters公司生产的高效液相色谱仪测定)。72 h时点同时采集门静脉血作细菌定量培养，并按常规作细菌学鉴定。ASP后72 h，存活的猪用10%KCl处死(0.1～0.2 g/kg)，在无菌条件下剖胸腹取肺组织、肺门淋巴结、大小肠的肠系膜淋巴结、胰腺组织作细菌学定量培养和常规细菌学鉴定。在上述采样过程中所涉及到的任何器具，均经去热原处理和高压灭菌消毒。
2 结果
2.1 血浆Gln的变化 Ⅱ组和Ⅲ组血浆Gln在诱导ASP后均出现较明显的下降，ASP后24 h、48 h和72 h各个时点血浆Gln与正常对照组比较，均有非常显著的统计学差异(P均<0.01)。静脉内给予Gln支持后，在ASP后24 h、48 h和72 h各个时点血浆Gln均较Ⅱ组和Ⅲ组有非常显著的上升(表1)。
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表1 血浆谷氨酰胺的变化 (μmol/L)
Tab. 1 Change in plasma Gln (μmol/L) 组别
T0
T2
T3
T4
Ⅰ组
395.5±57.9
285.8±45.5
316.2±45.4
, 百拇医药 303.4±51.6
Ⅱ组
363.0±101.0
180.7±73.3**
204.6±52.5**
182.8±20.5**
Ⅲ组
378.1±98.9
179.3±60.5**
188.3±48.4**
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176.4±23.5**
Ⅳ组
363.6±64.5
337.3±76.5
377.9±96.4
322.8±85.0
与Ⅰ组比较：*P<0.05,**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
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2.2 血浆内毒素的变化 Ⅲ组血浆内毒素的变化与Ⅱ组基本一致，两组间比较无明显统计学差异。静脉内给予Gln支持可使血浆内毒素水平大幅度降低，T2、T3和T4 3个时点的血浆内毒素水平与Ⅱ组和Ⅲ组比较均有非常显著的统计学差异(P均<0.01)(表2)。表2 血浆内毒素的变化 (EU/L)
Tab. 2 Change in plasma endotoxin (EU/L) 组别
T0
T1
T2
T3
T4
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Ⅱ组
0.48±0.12
1.88±0.74**
2.69±0.91**
3.91±1.21**
2.61±0.25**
Ⅲ组
0.54±0.12
1.80±0.86**
2.52±0.65**
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3.47±0.31**
2.48±0.19**
Ⅳ组
0.51±0.10
1.99±0.82**
1.63±0.38
2.15±0.69
2.18±0.51
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与T0比较：**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
2.3 血和组织细菌培养结果 ASP诱导后72 h，在小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结均可培养出致病菌，绝大部分为肠道常驻菌，以革兰阴性杆菌为主。静脉内给予Gln支持可大幅度减少小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结等部位易位细菌的数量(表3)。
表3 血和组织细菌培养结果 (105CFU/ml或g)
Tab. 3 Bacterial cultrue results of blood and tissues (×105 CFU/ml or g) 组别
静脉血
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肺组织
肺门淋巴结
胰腺
门脉血
小肠淋巴结
大肠淋巴结
Ⅰ组
0
0
0
0
0
0
0
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Ⅱ组
11.37±6.31**
45.06±20.40**
31.68±37.49**
66.00±12.43**
14.94±4.25**
48.67±10.78**
36.34±22.37**
Ⅲ组
10.51±7.54**
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25.50±20.20**
29.33±25.77**
58.36±34.19**
14.09±2.65**
49.72±8.73**
34.67±21.19**
Ⅳ组
0.01±0.01
2.01±3.09
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0.30±0.38
25.03±26.70
0.41±0.30
0.57±0.89
0.05±0.03
与Ⅰ组比较：*P<0.05,**P<0.01;与Ⅱ组比较：☆☆P<0.01;与Ⅲ组比较：★★P<0.01
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3 讨论
近年来，大量临床和动物实验研究显示，胰腺炎性浸润、出血、坏死可释放大量胰酶、溶酶体酶、脂酶、磷脂酶至邻近组织或入血循环造成胰腺本身和胰腺以外远距离脏器的消化性损伤，由此引发的补体、中性粒细胞、氧自由基、蛋白水解酶(如弹性蛋白酶)、游离脂肪酸、细胞因子(如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、PAF)和缺血-再灌注损伤介导造成的胰腺本身及胰腺以外远距离脏器损伤。胰腺炎后肠道功能受损、肠道屏障功能下降、肠道内微生态环境和正常菌群失调(可以是内源性如上述因素，也可以外源性如消化道的禁食、TPN、滥用抗生素)，引起肠道内细菌和内毒素向邻近组织和肠道外组织易位，导致肠源性菌血症和内毒素血症甚至脓毒症，是造成重症胰腺炎死亡率和后期并发症(如SIRS、ARDS、MODS)发生率居高不下的另一个重要原因〔8～10〕。Runkel等〔1〕在急性胰腺炎(AP)性脓毒症鼠中系统进行了肠源性细菌易位的观察和机制探讨，结果显示诱导AP后48 h和96 h肠系膜淋巴结细菌易位发生率均为100%，提示诱导AP 48 h之内早有肠源性细菌易位的发生。本实验结果也证实ASP可诱发肠源性细菌的易位，且ASP后72 h易位至肠系膜淋巴结、门静脉血、腔静脉血、肺和肺门淋巴结的细菌数量均很大。已有资料表明，Gln支持(无论是肠道内还是肠道外)在肠粘膜屏障功能、改善肠道内微生态环境和预防肠源性细菌和内毒素易位起着非常重要的作用〔6，7，10，11〕。
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本实验结果显示，ASP可引起血浆Gln水平明显下降，Ⅱ组和Ⅲ组猪血浆Gln水平在ASP后3天均明显低于ASP诱导前或假手术对照组同时点Gln水平，约为ASP诱导前的45%～55%左右。而Gln不仅是快速生长和分化的肠粘膜上皮细胞的重要氧化燃料和能量合成底物，也是维持肠粘膜结构、粘膜屏障功能、肠道免疫功能和微生态环境的重要调节因子。如果体内Gln缺乏，则可引起肠粘膜萎缩、屏障功能减弱、sIgA分泌减少、肠道内菌群失调，导致肠道内细菌/内毒素易位。我们推测ASP后早期就出现细菌/内毒素易位，不仅与ASP后中性粒细胞、炎性介质、细胞因子、蛋白水解酶(如弹性蛋白酶、磷脂酶A2)、缺血/再灌注损伤等介导肠粘膜结构和屏障功能损伤有关，而且还可能与ASP后血浆Gln水平低下密切相关。本实验结果发现，静脉内输注Gln不仅可显著提高血浆Gln水平，而且使血浆内毒素水平明显下降、易位至门静脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量显著降低，证实ASP后血浆Gln水平下降是ASP后细菌/内毒素易位的重要原因之一。我们将Gln粉剂成功地应用于小肠移植病人，也取得了较为满意的疗效〔12〕。结果提示Gln在减轻胰腺炎后的肠道粘膜损伤、维持胰腺炎后的肠道内正常菌群、降低胰腺炎后的肠道内细菌和内毒素易位、减少ASP期间肠源性菌血症、内毒素血症、脓毒症、甚至ARDS和MODS发生率均可能起着积极的作用。
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参考文献
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4 Chen K,Okuma T,Okammura K et al.Glutamine-supplemented parenteral nutrition improves gut mucosa integrity and function in endotoxemic rats.JPEN,1994,18(2):167
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7 Zhang W,Frankel WL,Bain A et al.Glutamine reduce bacterial translocation after small bowel transplantation in cyclosporine-treated rats.J Surg Res,1995,58:159
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8 Isenmann R,Bochler MW.Infection and acute pancreatitis.Br J Surg,1994,81:1707
9 Foitzik T,Castillo CF,Ferraro MJ et al.Pathogensis and prevention of early pancreatic infection in experimental acute necrotizing pancreatitis.Ann Surg,1995,222(1):57
10 Wusteman M,Tate H,Weaver L et al.The effect of enteral glutamine deprivation and supplementation on the structure of rat small-intestine mucosa during a systemic injury rsponse.JPEN,1995,19(1):22
11 Hartmann F,Plauth M.Intestinal glutamine metabolism.Metabolism,1989,38(8):18
12 李幼生，黎介寿，李 宁等.谷氨酰胺与谷氨酰胺双肽在小肠移植病人中的临床应用.肠外与肠内营养，1996；3(4)：203
(1998-03-04收稿), http://www.100md.com