蝌蚪提取液诱导HL60细胞分化和凋亡的实验研究
作者：杨红梅 白经修 丁明杰 张小莉 张 娓 牛富文
单位：杨红梅(河南职工医学院病理生理学教研室，郑州450003)； 张小莉(河南医科大学组织学胚胎学教研室，科研处，450052)；白经修 丁明杰 张 娓 牛富文(河南医科大学组织学胚胎学教研室)
关键词：蝌蚪提取液；HL60细胞；分化；凋亡
解剖学报990120
【摘要】 目的 为了寻找新的肿瘤细胞分化诱导剂，探讨蝌蚪醚提取液(T8712)的抗肿瘤作用。 方法 将HL60细胞培养于T8712和RPMI1640按1:200(v/v)混合的培养基中。 结果 T8712能诱导HL60细胞向单核/巨噬细胞方向分化，表现为生长抑制，NBT还原能力提高，酸性非特异性酯酶(ANAE)活性增加，形态学观察类似单核/巨噬细胞。
, 百拇医药
当T8712与RPMI1640培养基按1:100(v/v)混合则可诱导HL60细胞凋亡，如出现凋亡的形态学特征(凋亡小体出现等)；DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的阶梯型带；流式细胞式分析证明凋亡细胞数增加，但Bcl-2蛋白未有明显改变。 结论 T8712能抑制HL60细胞增殖，在不同浓度条件下可诱导HL60细胞向单核/巨噬样细胞分化或发生凋亡，其凋亡过程可能与Bcl-2无明显相关性。
THE INDUCTION OF DIFFERENTIATION AND APOPTOSIS IN
HL60 CELLS BY TADPOLE EXTRACT
Yang Hongmei, Bai Jingxiu△,Ding Mingjie, Zhang Xiaoli*, Zheng Wei, Niu Fuwen
, 百拇医药
(Department of Pathophysiology, Henan Medical Staffs College, Zhengzhou; Department of Histology and Embryology,*Department of Science Research of Henan Medical University, Zhengzhou)
【Abstract】 Objective In order to search for new tumor cell differentiation inducer, the antitumor effects of the tadpole ether extract (T8712) were studied. Methods T8712 and RPMI1640 medium were mixed in the ratio of 1:200(v/v). The HL60 cells were cultured in this mixed medium. Results T8712 might induce HL60 cell differentiation to monocyte-macrophage, as shown by growth inhibition; enhancing of NBT reducing ability; increasing of ANAE activity, similar shape to monocyte-macrophage.
, 百拇医药
When the ratio of T8712 and RPMI1640 medium is raised to 1:100(v/v), HL60 cells were induced to apoptosis, as evidenced by (1) characteristic morphology of apoptosis (i.e, formation of apoptotic bodies, etc). (2) DNA agarose gel electrophoresis showed a characteristic “ladder” pattern. (3) The flow cytometry analysis showed the number of apoptotic HL60 cells increased, but Bcl-2 proteins did not change. Conclusion T8712 might inhibite HL60 cell proliferation. Under distinct circumstances T8712 might induce HL60 cell differentiation to monocyte-macrophage or apoptosis, but the apoptotive course was not strikingly related to Bcl-2 protein.
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【Key Words】 Extract of tadpole: HL60 cell; Differentiation; Apoptosis
白血病是增殖分化异常性疾病。HL60细胞是目前体外研究白血病细胞分化的良好的模型，已知蝌蚪提取液(T871)能诱导小鼠红白血病细胞向良性方向转化[1]，为进一步了解T-871的抗肿瘤作用，本研究观察了T8712诱导HL60细胞发生分化和凋亡的作用。
材料和方法
1.材料
1.1 人早幼粒白血病细胞(HL60)引自河南医科大学微生物学和免疫学教研室。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养(内含青霉素105IU/L，链霉素105IU/L，谷氨酰胺2mol/L)。临用前用8%NaHCO3调pH值至7.0～7.2，37℃，饱和湿度，5%CO2条件下悬浮培养。
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1.2 蝌蚪提取液的制备：取池塘黑色有尾无腿的活蝌蚪(经鉴定为河蛙蝌蚪)，洗净、晾干、称重，蒸馏水浸泡48h后，用醚提取法[2]制成蝌蚪提取液(以下简称T8712)。其浓度为1ml相当于1g干重蝌蚪。-25℃保存备用。
1.3 Bcl-2多抗：美国Santa Cruz
2.实验方法
2.1 取对数生长期HL60细胞，以每毫升5×104个细胞接种于24孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱孵育。实验组分2组，用T8712与RPMI1640培养基按1∶100和1∶200(v/v)分别混合后的培养基培养，对照组用RPMI1640培养基培养。于接种细胞后第1、3、5、7d分别取每组细胞各3孔，分别计数，取其均值，绘制生长曲线；并分别涂片，作Wright染色，每张涂片计数200个细胞，依形态学改变计算其中单核/巨噬样细胞或凋亡细胞数，取3孔的均数、即代表此时的分化率或凋亡发生率。
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2.2 NBT还原试验[3]取培养24h后的细胞，PBS洗3次，调细胞浓度为106/ml，取细胞悬液0.1ml加入0.1ml 0.1%NBT-100mg/LTPA-PBS反应液，37℃温育15～30min，PBS洗，涂片，光镜下观察，阳性结果为胞浆内有蓝紫色沉淀，每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.3 酸性非特异性酯酶(ANAE)活性检测[4]：取培养24h后的各孔细胞，涂片，于冰冷的10%福尔马林液中固定10min，水洗，置酶孵育液(10mg α-醋酸萘酯溶于20ml 1/15mol/L磷酸缓冲液)中，37℃，1.5h，水洗，镜下见阳性细胞胞浆中有棕红色沉淀。每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.4 凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳[5]：取培养细胞，PBS洗3次，加入0.5～1ml细胞裂解液(1g/L蛋白酶K，10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, 0.4%SDS) 37℃ 24h, 加入等体积酚/氯仿各抽提2次，取上清加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5体积的无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心沉淀DNA，70%乙醇洗，溶入TE缓冲液100μl，加入RNA酶，37℃，30min，而后加入半量的上样缓冲液。制备1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5mg/L溴化乙锭)。每孔30μl点样，电压2V/cm，6h，紫外灯下观察并摄片记录。
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2.5 流式细胞仪对凋亡细胞数的分析[6]：分别取培养细胞，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，染色前PBS洗，后加入50mg/L碘化丙啶，4℃，避光30min，上机测定(流式细胞仪，美国FACS-420型)，所得数据经Sigle Histogram Statistics软件处理，计算出凋亡细胞百分比。
2.6 Bcl-2蛋白的免疫荧光流式细胞仪测定[7]：分别取培养细胞、PBS洗，70%冷乙醇固定，计数各取1×106单细胞悬液，PBS洗，离心，弃上清，加入1∶100稀释的Bcl-2多抗，37℃，水浴30min，PBS洗2次，加入1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG(中国军事医学科学院微生物研究所)100μl，37℃，温育30min，PBS洗以去除未结合的多余荧光抗体，检测前加入1.0ml PBS液经400目筛网过滤后上机(流式细胞仪，美国FACS-420型，输出功率300mW，激发波长488nm)，测量数据用Sigle Histogram Statistics软件处理。
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结 果
1.T8712对HL60细胞生长的影响
经蝌蚪提取液处理后不同时间HL60细胞生长情况见图1。经统计学t检验处理，第3、5、7d细胞计数3组间皆有显著性差异(P<0.01)。——对照培养基(contral medinm)---1∶200(v/v)T8712 培养基
1∶200(v/v)T8712 medium
-.-.-1∶100(v/v)T8712 培养基
1∶100(v/v)T8712 medium
图1 T8712对HL60细胞生长的影响
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Fig.1 The influence of T8712 on HL60 cell growth.
2.对利用T8712与RPMI1640培养基按1：200(v/v)混合后培养的HL60细胞的检测
2.1倒置显微镜观察培养第2d的HL60细胞，可见有少量贴壁，摇动后脱落。随培养时间延长，细胞变小，有细胞碎片形成。而对照组则细胞生长旺盛，不贴壁。培养细胞涂片Wright染色，镜下可见实验组细胞核浆比例减小；核形态不规则，有的呈肾形、马蹄铁状；染色质浓缩，呈向单核/巨噬细胞方向分化之特征(图2，3)。计数单核/巨噬细胞的百分率见表1。
表1 1:200(v/v)T8712培养HL60细胞中单核/巨噬细胞的百分率*
, http://www.100md.com Table 1 Percentage of monocyte-macrophage-like cells in
1:200(v/v)T8712 mediated HL60 cells
1d
3d
5d
7d
对照组
control group
10.7±1.9
9.0±3.0
10.8±2.0
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9.2±1.6
T8712 培养组
T8712 group
51.3±3.0
38.8±2.4
28.8±2.8
24.3±1.8
*经1、3、5、7d培养的HL60细胞中单核/巨噬样细胞的百分率，实验组与对照组相比较，皆有显著性差异(P<0.01)
*Significant difference in mean percentages of monocyte-macrophage-like cells were found between two groups. P<0.01
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2.2 NBT还原试验：镜下检查可见经T8712作用24h后，胞浆中有蓝紫色沉淀的阳性细胞占(41.7±3.4)%，而对照组为(8.6±1.5)%，有显著性差异(P<0.01)。
2.3 ANAE染色:镜下可见胞浆中有棕红色颗粒的阳性细胞，实验组为(57.1±1.9)%，对照组为(19.5±6.8)%，两者间有显著性差异(P<0.01)。
3.对利用T8712与RPMI1640培养基按1∶100(v/v)混合后培养的HL60细胞的检测
3.1 观察连续培养72h的HL60细胞，可见细胞渐变小皱缩，细胞碎片增多，至第5d已大部分死亡。细胞涂片Wright染色观察可见胞浆内有空泡出现，核固缩，核内染色质聚集、断裂、部分核膜崩解后断裂的染色质形成粗细不匀的颗粒弥散于胞浆中，凋亡小体明显(图4，5)。随着时间的延长，发生凋亡的细胞数逐渐增多(表2)。
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3.2 提取T8712作用24h后的HL60细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳示DNA呈阶梯型条带，而对照组未见此种改变(图6)。
3.3 利用流式细胞仪测定T8712处理HL60细胞bcl-2蛋白之变化见表2。统计学处理变化无显著性差异(P>0.05)。
表2 T8712培养HL60细胞中凋亡细胞数与Bcl-2蛋白的变化
Table 2 Number of apoptotic cells and change of Bcl-2 protein in T8712 mediated HL60 cells
T8712实验组(experimental group)
对照组(contral group)
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1d
2d
3d
1d
2d
3d
凋亡细胞百分比
percentage of apoptotic cells
6.8±2.1
14.5±3.4
19.8±2.4
2.8±1.4
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4.3±1.2
3.2±0.7
Bcl-2蛋白表达率*
expressional rate of bcl-2 protein
36.6±2.3
36.5±6.0
39.7±0.9
30.5±3.3
27.2±1.6
32.8±4.8
*bcl-2蛋白表达率在不同培养时间实验组与对照组比较皆无差异(P>0.05)
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*Significant difference in bcl-2 protein expression averages was not found between two groups. P>0.05
讨 论
细胞分化的主要标志是合成特异性功能蛋白，出现组织或细胞类型功能特征性改变，停止或失去分裂增殖活性，同时进行该细胞表现型的形态结构分化。HL60是体外研究白血病细胞分化的常用细胞系，在不同药物作用下，可向不同方向分化，如TPA、维生素D3等可诱导其向单核/巨噬细胞方向分化，而DMSO却诱导其向成熟粒细胞分化。本研究利用蝌蚪的醚提取液培养HL60细胞，根据生长曲线和形态学观察证明T8712有诱导HL60细胞分化的作用，根据表1可以观察到诱导分化效果最佳时间是在培养的24h后，故我们选用经T8712处理24h后的HL60细胞进行检测，结果表现分化的HL60细胞中ANAE活性明显增强，NBT还原能力增强。而ANAE是单核/巨噬细胞的标志酶[8]，NBT还原能力是判定细胞成熟的重要标志[3]，再结合细胞形态学之改变，证明T8712有诱导HL60细胞向单核/巨噬细胞方向分化的作用。
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当T8712增加至1：100(v/v)时，对培养的HL60细胞表现出诱导其发生凋亡的作用。即经T8712作用后HL60细胞核固缩，染色体断裂、凋亡小体形成等发生一系列凋亡细胞的形态学改变，提取经T8712作用后的HL60细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳可见明显的阶梯型带。总之，从本实验可知，T8712和其他许多抗肿瘤药物一样，当其在低浓度时有诱导瘤细胞分化之作用，而在高浓度时有诱导凋亡、杀伤瘤细胞之作用。已知凋亡是由特定基因编码的细胞自杀过程，凋亡可以发生在分化的任意一个阶段，示凋亡对分化起筛选作用。在T8712和TPA诱导HL60细胞向单核/巨噬样细胞分化过程中可观察到凋亡细胞。在RA诱导HL60细胞向粒细胞分化时较成熟的细胞通过凋亡而死亡，故认为凋亡是终末分化的HL60细胞正常死亡形式，阻滞终末分化也伴有细胞凋亡和生长停滞。但凋亡不是诱导分化的唯一结果。Solary等[9]证明HL60受TPA诱导分化为单核/巨噬细胞后，又能抑制喜树碱等多种药物对其诱导的凋亡作用，而全反式维甲酸诱导HL60向粒细胞分化后仍可被上述药物诱导凋亡，而且全反式维甲酸诱导分化过程中就伴有凋亡之发生。总之，凋亡和分化由不同途径调节，但两者间也存在必然联系，因此两者的关系是需要进一步探索的问题。
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许多基因参与肿瘤细胞凋亡过程。Bcl-2是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，当肿瘤细胞发生凋亡时其表达降低。但本实验中未观察到凋亡前后bcl-2蛋白改变，这可能是由于细胞凋亡有着不同的途径，不同药物诱导细胞凋亡激活了不同的凋亡因子所致。Ling等[10]曾证明小鼠急性淋巴细胞白血病细胞可被阿霉素诱导凋亡，此凋亡可被放线菌素D或放线菌酮部分抑制，从而推测凋亡需要某些RNA和大分子蛋白质的合成作为调控因子。但在人淋巴细胞白血病的研究结果与此相反，放线菌素D和放线菌酮不但不能抑制凋亡的发生，而且还可能增强化疗药物诱导白血病细胞凋亡的作用，而单用放线菌素D或放线菌酮也能诱导HL60等细胞之凋亡，这就提示凋亡的生化途径不止一种。有人认为人类细胞凋亡与蛋白质的磷酸化/去磷酸化有重要关系，而与蛋白质合成无关，因此发生凋亡的机制还需进一步探讨。
总之，经过本实验初步证实T8712对HL60细胞有抑制其生长，诱导其分化和凋亡的作用，但有关其作用的机理，还有待更深入地研究，使其成为临床可用的抗肿瘤制剂。
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图版说明
图2 RPMI1640培养的HL60细胞.Wright染色(下同)×400
图3 T8712诱导的向单核/巨噬细胞分化的HL60细胞×400
图4 T8712诱导HL60细胞凋亡×250
图5 凋亡的HL60细胞×1 000
图6 HL60细胞DNA琼脂糖凝胶电泳 a.HL60对照 b.T8712作用1d的HL60细胞 c.T8712作用2d的HL60细胞 d.T8712作用3d的HL60细胞
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Explanation of figures
Fig.2 mediated by RPMI1640 HL60 cells Wright stain. ×400
Fig.3 mediated by T8712 HL60 cells showed differentation to monocyte/macrophage-like cells. Wright stain. ×400
Fig.4 induced by T8712 apoptotic HL60 cells. Wright stain. ×250
Fig.5 apoptotic HL60 cell. Wright stain. ×1 000
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Fig.6 agarose gel electrophoresis of DNA from HL60 cells a.control b.mediated by T8712 HL60 cells for 1d c.mediated by T8712 HL60 cells for 2d d.mediated by T8712 HL60 cells for 3d.
△ Department of Histology and Embryology, He′nan Medical University, Zhengzhou 450052, China
参考文献
[1]白经修，于静，丁蔚等.蝌蚪提取液对小鼠红白血病细胞分化的诱导作用.解剖学报，1995，26(4)：403.
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[2] 北京市卫生局.中草药制剂技术.北京：化学工业出版社，1978：140
[3] Yoshida M, Eguchi T, Ikekawa N, et al.Inhibition of vitamin D3 induced cell differentiation by interferon-gamma in HL60 cells determined by a nitro blue tetra-zolium reduction test. J Interferon Cytokine Res, 1995, 15(11):965
[4] Yam LT. Cytochemial identification of monocytes and granulocyte. Am J Clin Path, 1971, 55(3):283
[5] Ohta H, Sweeney EA, Masamune A, et al. Induction of apoptosis by sphingosine in human leukemic HL60 cells: A possible endogenouse modulator of apoptotic DNA fragmentation occuring during phorbol ester-induced differentiation. Cancer Res, 1995,55(1):691
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[6] Gorczyca W, Tuziak TA, Kram MR, et al. Detection of apoptosis-associated DNA strand breaks in fine-needle aspiration biopsies by in situ end labeling of fragmented DNA. Cytometry 1994, 15(2):169
[7] 左连富，周道安，齐风英等.定量分析乳腺癌细胞p53基因产物的表达.中华物理医学杂志，1994，16(2)：78
[8] Hirofumi T, Etsuko A, Chisato M, et al. 1 α 25-Dihydroxyvitamin D3 induces differentiation of human promyelocytic leukemia cells (HL60) into monocytic-macrophages, but not into granulocytes. Biochem Biophis Res Comn, 1983, 117(1):86
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[9] Solary E, Bertrand R, Kohn KW, et al. Differential induction of apoptosis in undifferentiated and differentiated HL60 cells by DNA topoisomerase-1 and topoisomerase-Ⅱ inhibitors. Blood 1993, 81(5):1359
[10] Ling YH, Pricbe W, Perezsoler R. Apoptosis induced by anthracycline antibiotics in P388 parent and multidrug-resistant cells. Cancer Res, 1993, 53(8):1845
收稿 1997-09 修回 1998-01, http://www.100md.com
单位：杨红梅(河南职工医学院病理生理学教研室，郑州450003)； 张小莉(河南医科大学组织学胚胎学教研室，科研处，450052)；白经修 丁明杰 张 娓 牛富文(河南医科大学组织学胚胎学教研室)
关键词：蝌蚪提取液；HL60细胞；分化；凋亡
解剖学报990120
【摘要】 目的 为了寻找新的肿瘤细胞分化诱导剂，探讨蝌蚪醚提取液(T8712)的抗肿瘤作用。 方法 将HL60细胞培养于T8712和RPMI1640按1:200(v/v)混合的培养基中。 结果 T8712能诱导HL60细胞向单核/巨噬细胞方向分化，表现为生长抑制，NBT还原能力提高，酸性非特异性酯酶(ANAE)活性增加，形态学观察类似单核/巨噬细胞。
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当T8712与RPMI1640培养基按1:100(v/v)混合则可诱导HL60细胞凋亡，如出现凋亡的形态学特征(凋亡小体出现等)；DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的阶梯型带；流式细胞式分析证明凋亡细胞数增加，但Bcl-2蛋白未有明显改变。 结论 T8712能抑制HL60细胞增殖，在不同浓度条件下可诱导HL60细胞向单核/巨噬样细胞分化或发生凋亡，其凋亡过程可能与Bcl-2无明显相关性。
THE INDUCTION OF DIFFERENTIATION AND APOPTOSIS IN
HL60 CELLS BY TADPOLE EXTRACT
Yang Hongmei, Bai Jingxiu△,Ding Mingjie, Zhang Xiaoli*, Zheng Wei, Niu Fuwen
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(Department of Pathophysiology, Henan Medical Staffs College, Zhengzhou; Department of Histology and Embryology,*Department of Science Research of Henan Medical University, Zhengzhou)
【Abstract】 Objective In order to search for new tumor cell differentiation inducer, the antitumor effects of the tadpole ether extract (T8712) were studied. Methods T8712 and RPMI1640 medium were mixed in the ratio of 1:200(v/v). The HL60 cells were cultured in this mixed medium. Results T8712 might induce HL60 cell differentiation to monocyte-macrophage, as shown by growth inhibition; enhancing of NBT reducing ability; increasing of ANAE activity, similar shape to monocyte-macrophage.
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When the ratio of T8712 and RPMI1640 medium is raised to 1:100(v/v), HL60 cells were induced to apoptosis, as evidenced by (1) characteristic morphology of apoptosis (i.e, formation of apoptotic bodies, etc). (2) DNA agarose gel electrophoresis showed a characteristic “ladder” pattern. (3) The flow cytometry analysis showed the number of apoptotic HL60 cells increased, but Bcl-2 proteins did not change. Conclusion T8712 might inhibite HL60 cell proliferation. Under distinct circumstances T8712 might induce HL60 cell differentiation to monocyte-macrophage or apoptosis, but the apoptotive course was not strikingly related to Bcl-2 protein.
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【Key Words】 Extract of tadpole: HL60 cell; Differentiation; Apoptosis
白血病是增殖分化异常性疾病。HL60细胞是目前体外研究白血病细胞分化的良好的模型，已知蝌蚪提取液(T871)能诱导小鼠红白血病细胞向良性方向转化[1]，为进一步了解T-871的抗肿瘤作用，本研究观察了T8712诱导HL60细胞发生分化和凋亡的作用。
材料和方法
1.材料
1.1 人早幼粒白血病细胞(HL60)引自河南医科大学微生物学和免疫学教研室。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养(内含青霉素105IU/L，链霉素105IU/L，谷氨酰胺2mol/L)。临用前用8%NaHCO3调pH值至7.0～7.2，37℃，饱和湿度，5%CO2条件下悬浮培养。
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1.2 蝌蚪提取液的制备：取池塘黑色有尾无腿的活蝌蚪(经鉴定为河蛙蝌蚪)，洗净、晾干、称重，蒸馏水浸泡48h后，用醚提取法[2]制成蝌蚪提取液(以下简称T8712)。其浓度为1ml相当于1g干重蝌蚪。-25℃保存备用。
1.3 Bcl-2多抗：美国Santa Cruz
2.实验方法
2.1 取对数生长期HL60细胞，以每毫升5×104个细胞接种于24孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱孵育。实验组分2组，用T8712与RPMI1640培养基按1∶100和1∶200(v/v)分别混合后的培养基培养，对照组用RPMI1640培养基培养。于接种细胞后第1、3、5、7d分别取每组细胞各3孔，分别计数，取其均值，绘制生长曲线；并分别涂片，作Wright染色，每张涂片计数200个细胞，依形态学改变计算其中单核/巨噬样细胞或凋亡细胞数，取3孔的均数、即代表此时的分化率或凋亡发生率。
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2.2 NBT还原试验[3]取培养24h后的细胞，PBS洗3次，调细胞浓度为106/ml，取细胞悬液0.1ml加入0.1ml 0.1%NBT-100mg/LTPA-PBS反应液，37℃温育15～30min，PBS洗，涂片，光镜下观察，阳性结果为胞浆内有蓝紫色沉淀，每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.3 酸性非特异性酯酶(ANAE)活性检测[4]：取培养24h后的各孔细胞，涂片，于冰冷的10%福尔马林液中固定10min，水洗，置酶孵育液(10mg α-醋酸萘酯溶于20ml 1/15mol/L磷酸缓冲液)中，37℃，1.5h，水洗，镜下见阳性细胞胞浆中有棕红色沉淀。每张涂片计数200个细胞，取均值，即为此时阳性细胞的百分率。
2.4 凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳[5]：取培养细胞，PBS洗3次，加入0.5～1ml细胞裂解液(1g/L蛋白酶K，10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, 0.4%SDS) 37℃ 24h, 加入等体积酚/氯仿各抽提2次，取上清加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5体积的无水乙醇，混匀，10 000 r/min离心沉淀DNA，70%乙醇洗，溶入TE缓冲液100μl，加入RNA酶，37℃，30min，而后加入半量的上样缓冲液。制备1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5mg/L溴化乙锭)。每孔30μl点样，电压2V/cm，6h，紫外灯下观察并摄片记录。
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2.5 流式细胞仪对凋亡细胞数的分析[6]：分别取培养细胞，PBS洗3次，70%冷乙醇固定，染色前PBS洗，后加入50mg/L碘化丙啶，4℃，避光30min，上机测定(流式细胞仪，美国FACS-420型)，所得数据经Sigle Histogram Statistics软件处理，计算出凋亡细胞百分比。
2.6 Bcl-2蛋白的免疫荧光流式细胞仪测定[7]：分别取培养细胞、PBS洗，70%冷乙醇固定，计数各取1×106单细胞悬液，PBS洗，离心，弃上清，加入1∶100稀释的Bcl-2多抗，37℃，水浴30min，PBS洗2次，加入1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG(中国军事医学科学院微生物研究所)100μl，37℃，温育30min，PBS洗以去除未结合的多余荧光抗体，检测前加入1.0ml PBS液经400目筛网过滤后上机(流式细胞仪，美国FACS-420型，输出功率300mW，激发波长488nm)，测量数据用Sigle Histogram Statistics软件处理。
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结 果
1.T8712对HL60细胞生长的影响
经蝌蚪提取液处理后不同时间HL60细胞生长情况见图1。经统计学t检验处理，第3、5、7d细胞计数3组间皆有显著性差异(P<0.01)。——对照培养基(contral medinm)---1∶200(v/v)T8712 培养基
1∶200(v/v)T8712 medium
-.-.-1∶100(v/v)T8712 培养基
1∶100(v/v)T8712 medium
图1 T8712对HL60细胞生长的影响
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Fig.1 The influence of T8712 on HL60 cell growth.
2.对利用T8712与RPMI1640培养基按1：200(v/v)混合后培养的HL60细胞的检测
2.1倒置显微镜观察培养第2d的HL60细胞，可见有少量贴壁，摇动后脱落。随培养时间延长，细胞变小，有细胞碎片形成。而对照组则细胞生长旺盛，不贴壁。培养细胞涂片Wright染色，镜下可见实验组细胞核浆比例减小；核形态不规则，有的呈肾形、马蹄铁状；染色质浓缩，呈向单核/巨噬细胞方向分化之特征(图2，3)。计数单核/巨噬细胞的百分率见表1。
表1 1:200(v/v)T8712培养HL60细胞中单核/巨噬细胞的百分率*
, http://www.100md.com Table 1 Percentage of monocyte-macrophage-like cells in
1:200(v/v)T8712 mediated HL60 cells
1d
3d
5d
7d
对照组
control group
10.7±1.9
9.0±3.0
10.8±2.0
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9.2±1.6
T8712 培养组
T8712 group
51.3±3.0
38.8±2.4
28.8±2.8
24.3±1.8
*经1、3、5、7d培养的HL60细胞中单核/巨噬样细胞的百分率，实验组与对照组相比较，皆有显著性差异(P<0.01)
*Significant difference in mean percentages of monocyte-macrophage-like cells were found between two groups. P<0.01
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2.2 NBT还原试验：镜下检查可见经T8712作用24h后，胞浆中有蓝紫色沉淀的阳性细胞占(41.7±3.4)%，而对照组为(8.6±1.5)%，有显著性差异(P<0.01)。
2.3 ANAE染色:镜下可见胞浆中有棕红色颗粒的阳性细胞，实验组为(57.1±1.9)%，对照组为(19.5±6.8)%，两者间有显著性差异(P<0.01)。
3.对利用T8712与RPMI1640培养基按1∶100(v/v)混合后培养的HL60细胞的检测
3.1 观察连续培养72h的HL60细胞，可见细胞渐变小皱缩，细胞碎片增多，至第5d已大部分死亡。细胞涂片Wright染色观察可见胞浆内有空泡出现，核固缩，核内染色质聚集、断裂、部分核膜崩解后断裂的染色质形成粗细不匀的颗粒弥散于胞浆中，凋亡小体明显(图4，5)。随着时间的延长，发生凋亡的细胞数逐渐增多(表2)。
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3.2 提取T8712作用24h后的HL60细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳示DNA呈阶梯型条带，而对照组未见此种改变(图6)。
3.3 利用流式细胞仪测定T8712处理HL60细胞bcl-2蛋白之变化见表2。统计学处理变化无显著性差异(P>0.05)。
表2 T8712培养HL60细胞中凋亡细胞数与Bcl-2蛋白的变化
Table 2 Number of apoptotic cells and change of Bcl-2 protein in T8712 mediated HL60 cells
T8712实验组(experimental group)
对照组(contral group)
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1d
2d
3d
1d
2d
3d
凋亡细胞百分比
percentage of apoptotic cells
6.8±2.1
14.5±3.4
19.8±2.4
2.8±1.4
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4.3±1.2
3.2±0.7
Bcl-2蛋白表达率*
expressional rate of bcl-2 protein
36.6±2.3
36.5±6.0
39.7±0.9
30.5±3.3
27.2±1.6
32.8±4.8
*bcl-2蛋白表达率在不同培养时间实验组与对照组比较皆无差异(P>0.05)
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*Significant difference in bcl-2 protein expression averages was not found between two groups. P>0.05
讨 论
细胞分化的主要标志是合成特异性功能蛋白，出现组织或细胞类型功能特征性改变，停止或失去分裂增殖活性，同时进行该细胞表现型的形态结构分化。HL60是体外研究白血病细胞分化的常用细胞系，在不同药物作用下，可向不同方向分化，如TPA、维生素D3等可诱导其向单核/巨噬细胞方向分化，而DMSO却诱导其向成熟粒细胞分化。本研究利用蝌蚪的醚提取液培养HL60细胞，根据生长曲线和形态学观察证明T8712有诱导HL60细胞分化的作用，根据表1可以观察到诱导分化效果最佳时间是在培养的24h后，故我们选用经T8712处理24h后的HL60细胞进行检测，结果表现分化的HL60细胞中ANAE活性明显增强，NBT还原能力增强。而ANAE是单核/巨噬细胞的标志酶[8]，NBT还原能力是判定细胞成熟的重要标志[3]，再结合细胞形态学之改变，证明T8712有诱导HL60细胞向单核/巨噬细胞方向分化的作用。
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当T8712增加至1：100(v/v)时，对培养的HL60细胞表现出诱导其发生凋亡的作用。即经T8712作用后HL60细胞核固缩，染色体断裂、凋亡小体形成等发生一系列凋亡细胞的形态学改变，提取经T8712作用后的HL60细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳可见明显的阶梯型带。总之，从本实验可知，T8712和其他许多抗肿瘤药物一样，当其在低浓度时有诱导瘤细胞分化之作用，而在高浓度时有诱导凋亡、杀伤瘤细胞之作用。已知凋亡是由特定基因编码的细胞自杀过程，凋亡可以发生在分化的任意一个阶段，示凋亡对分化起筛选作用。在T8712和TPA诱导HL60细胞向单核/巨噬样细胞分化过程中可观察到凋亡细胞。在RA诱导HL60细胞向粒细胞分化时较成熟的细胞通过凋亡而死亡，故认为凋亡是终末分化的HL60细胞正常死亡形式，阻滞终末分化也伴有细胞凋亡和生长停滞。但凋亡不是诱导分化的唯一结果。Solary等[9]证明HL60受TPA诱导分化为单核/巨噬细胞后，又能抑制喜树碱等多种药物对其诱导的凋亡作用，而全反式维甲酸诱导HL60向粒细胞分化后仍可被上述药物诱导凋亡，而且全反式维甲酸诱导分化过程中就伴有凋亡之发生。总之，凋亡和分化由不同途径调节，但两者间也存在必然联系，因此两者的关系是需要进一步探索的问题。
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许多基因参与肿瘤细胞凋亡过程。Bcl-2是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，当肿瘤细胞发生凋亡时其表达降低。但本实验中未观察到凋亡前后bcl-2蛋白改变，这可能是由于细胞凋亡有着不同的途径，不同药物诱导细胞凋亡激活了不同的凋亡因子所致。Ling等[10]曾证明小鼠急性淋巴细胞白血病细胞可被阿霉素诱导凋亡，此凋亡可被放线菌素D或放线菌酮部分抑制，从而推测凋亡需要某些RNA和大分子蛋白质的合成作为调控因子。但在人淋巴细胞白血病的研究结果与此相反，放线菌素D和放线菌酮不但不能抑制凋亡的发生，而且还可能增强化疗药物诱导白血病细胞凋亡的作用，而单用放线菌素D或放线菌酮也能诱导HL60等细胞之凋亡，这就提示凋亡的生化途径不止一种。有人认为人类细胞凋亡与蛋白质的磷酸化/去磷酸化有重要关系，而与蛋白质合成无关，因此发生凋亡的机制还需进一步探讨。
总之，经过本实验初步证实T8712对HL60细胞有抑制其生长，诱导其分化和凋亡的作用，但有关其作用的机理，还有待更深入地研究，使其成为临床可用的抗肿瘤制剂。
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图版说明
图2 RPMI1640培养的HL60细胞.Wright染色(下同)×400
图3 T8712诱导的向单核/巨噬细胞分化的HL60细胞×400
图4 T8712诱导HL60细胞凋亡×250
图5 凋亡的HL60细胞×1 000
图6 HL60细胞DNA琼脂糖凝胶电泳 a.HL60对照 b.T8712作用1d的HL60细胞 c.T8712作用2d的HL60细胞 d.T8712作用3d的HL60细胞
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Explanation of figures
Fig.2 mediated by RPMI1640 HL60 cells Wright stain. ×400
Fig.3 mediated by T8712 HL60 cells showed differentation to monocyte/macrophage-like cells. Wright stain. ×400
Fig.4 induced by T8712 apoptotic HL60 cells. Wright stain. ×250
Fig.5 apoptotic HL60 cell. Wright stain. ×1 000
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Fig.6 agarose gel electrophoresis of DNA from HL60 cells a.control b.mediated by T8712 HL60 cells for 1d c.mediated by T8712 HL60 cells for 2d d.mediated by T8712 HL60 cells for 3d.
△ Department of Histology and Embryology, He′nan Medical University, Zhengzhou 450052, China
参考文献
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收稿 1997-09 修回 1998-01, http://www.100md.com