隐丹参酮及其代谢物在猪体内的药代动力学研究
作者：薛明 崔颖 汪汉卿 罗永江 张彬 周宗田
单位：薛明 崔颖 罗永江 张彬 周宗田 中国农业科学院中兽医研究所, 兰州 730050；汪汉卿 中国科学院兰州化学物理研究所, 兰州 730050
关键词：隐丹参酮；丹参酮IIA；药代动力学；高效液相色谱法
药学学报990201 摘要 目的： 研究隐丹参酮(CT)及其代谢物丹参酮IIA(TS)在猪体内的药代动力学。方法： 实验猪5头, 单剂量(10 mg.kg-1) iv隐丹参酮后,采用反相 HPLC法检测CT及TS的血浆浓度。 以二苄基为内标, 流动相为甲醇—水(85∶15),检测波长254 nm。 结果： CT血药时程符合二室开放模型。im与po给药后, CT和TS的血药浓度很低。 少量原药及其代谢产物在胆汁中随着给药时间的延长逐渐增多。不同途径给药后(iv及po),隐丹参酮及丹参酮IIA在尿中的排泄量占给药剂量的比例很小。 结论： 猪CT及TS药代动力学数据为动物临床用药提供有价值的理论依据。
, 百拇医药
PHARMACOKINETICS OF CRYPTOTANSHINONE AND
ITS METABOLITE IN PIGS
Xue Ming(Xue M), Cui Ying(Cui Y),Luo Yongjiang(Luo YJ),Zhang Bin(Zhang B) and Zhou Zongtian(Zhou ZT)
(Insititute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Chinese Academy of Agricultural Sciences Lanzhou 730050)
Wang Hanqing(Wang HQ)
(Lanzhou Institute of Physical Chemistry, Academia Sinica, Lanzhou 730050)
, 百拇医药
ABSTRACT AIM: To study the pharmacokinetics and excretion of the antibacterial constituent cryptotanshinone (CT) isolated from the roots of Saliva przewaalskii Maxim (Labiatae) and its metabolite tanshinone IIA(TS) in pigs. METHODS: Normal pigs were given CT iv 10 mg.kg-1. The concentrations of CT and TS in porcine plasma, urine and bile were determined by an HPLC method developed in our laberatory. A waters model 480 instrument was used throughout the experiment. Dibenyl was used as the internal standard at absorption wavelength of 254 nm. A mixture of methanol and water(85∶15) was used as the mobile phase with a flow rate of 1 ml.min-1, and YWG C18H37 as stationary phase. RESULTS: The method is simple, sensitive and available for pharmacokinetics studies. Plasma drug concentration-time course of CT after iv adminstration of CT was found to be fitted to a two compartment open model and its pharmacokinetic paremeters were as follows: T1/2α=2.36 min, T1/2β=64.78 min, AUC=23.83 mg.min.L-1. TS was detected simultaneously. Peak plasma concentration of TS was reached at about 4.6 minutes after dosing. Cmax=0.62 μg.ml-1, T1/2β=189.04 min, AUC=22.97 mg.min.L-1. The excretion of CT and TS in urine and bile in 24～48 hour was very few after iv and po administration of CT. CONCLUSION: The pharmacokinetics of CT and TS in pigs provided a useful index for clinical trial in animals.
, 百拇医药
KEY WORDS cryptotanshinone; tanshinone IIA; pharmacokinetics; HPLC
隐丹参酮(cryptotanshinone， CT)是从药用鼠尾草植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)及甘西鼠尾草(S.przewaquskii Maxim)的根中分离提纯的二萜醌类化合物。体外试验证明，对金葡菌及其耐药菌株、链球菌、分枝杆菌等病源菌有较强的抑杀作用[1，2]。临床应用以CT为主成分的总酮治疗人的一些感染性疾病，收到较好效果[3，4]。我们开始用其治疗畜禽感染性疾病如乳腺炎、子宫内膜炎、外伤感染、腹泻等，效果满意。CT在动物体内的药代动力学未见报道。本文报道CT及其活性代谢产物丹参酮IIA(tanshinone IIA,TS)在猪体内的药代动力学、排泄与代谢。为临床合理用药、新药研制及剂型改进提供理论依据。
材料与方法
, 百拇医药
药品与试剂 CT标准品由本实验室从甘西鼠尾草的根中分离纯化制得，经熔点、TLC及光谱数据证明为纯品[2，5]。 纯度大于99%，静脉注射液用丙二醇溶解CT标准品制得，浓度为15 mg.ml-1。甲醇为色谱纯，重蒸水，内标二苄基(dibenzyl, DB) 为实验试剂，重结晶。其它试剂均为市售分析纯。
实验动物 健康杂交猪5头，雄性阉割，体重(30±5) kg， 购自甘肃省种猪场。先iv CT 10 mg.kg-1, 约半月后, po CT 40 mg.kg-1, 并分别在代谢笼内收集(0～48) h自然排出的尿液, -20℃冰箱保存备用。另选健康猪2头, 禁食12 h后灌服CT 40 mg.kg-1, 在乙醚麻醉下插胆管, 并分段收集胆汁, 测定药物及其代谢物含量。
, 百拇医药
给药及采样 每头猪由耳静脉插套管后，先经iv，半月后经po给药，给药前禁食12 h，不禁水。给药前即时及给药后不同时间采取静脉血5 ml，肝素液抗凝，离心(3 000 r.min-1) 10 min，分离血浆，每个时间点精确吸取血浆1.0 ml。同时采集胆汁与尿液，-20℃冰箱保存。
仪器与色谱条件 Waters高效液相色谱仪系列； YWG-C18H37(10 μm) 4.0 mm×150 mm色谱柱； Waters 510型泵; 480型紫外检测器; U6K型进样阀；AST型数据处理仪；3800型打印机。流动相为甲醇—水(85∶15),流速1.0 ml.min-1;柱温25±0.5℃;检测波长254 nm；内标为DB。
药物检测方法及数据处理 分别精确量取血浆样品1.0 ml，胆汁1.0 ml及尿液2.0 ml, 精确加入内标，再加入等体积乙酸乙酯提取3次, 涡旋1 min, 3 000 r.min-1离心10 min, 合并上清液, 氮气吹干, 残渣用流动相100 μl溶解, 取10 μl进样, 反相HPLC检测CT及TS浓度[6]。 iv的血药时程数据按非线性最小二乘法用MCPKP药代动力学程序处理[7]。
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结 果
1 色谱行为
在上述色谱条件下，空白血浆及尿液和给药后血浆及尿液的色谱图见图1，CT的保留时间(TR)为(4.1±0.1) min, TS的TR为(5.9±0.1) min。
Fig 1 Representative chromatograms of (a) blank plasma, (b) a plasma sample from a pig(given crytotanshinone) containing cryptotanshinone 0.82 μg.ml-1 and tanshinone IIA 1.41 μg.ml-1, (c) blank urine and (d) a urine sample from a pig(given crytotanshinone) containing cryptotanshinone 8.28 μg.ml-1 and tanshinone IIA 3.22 μg.ml-1. 1: Cryptotanshinone; 2: Dibenzy(internal standard); 3: Tanshinone IIA.
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2 线性范围和检测灵敏度
分别配制浓度为0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00及12.5 μg.ml-1的CT及TS的标准血样及尿样各2管, 按样品测定方法操作,以CT的浓度对CT峰面积与内标DB的峰面积比值进行线性回归,得回归方程, 血浆:Y=0.3068X-0.0337, γ=0.9994， 尿样:Y=0.7727X-0.0317, γ=0.9998。
以TS的浓度对TS峰面积与DB的峰面积比值进行线性回归, 得回归方程, 血浆: Y=1.1783X-0.0428, γ=0.9998, 尿样: Y=1.1116X+0.0048, γ=0.9998。
最低检测量为10 ng, 最低检测浓度为16 ng.ml-1。
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3 精密度试验
分别配制含CT 0.2, 0.5, 2.5及含TS 0.16, 0.5, 2.5 μg.ml-1的标准血样, 配制含CT与TS各0.8, 3.0, 12.5 μg.ml-1的尿样, 各管中加内标适量。依法操作，分别测定日内及日间精密度，结果日内测得各浓度的相对标准差(RSD)小于3%, 日间测得各浓度的RSD小于6%。
4 回收率测定
分别于空白血浆1.0 ml中加入CT 0.2, 0.5, 2.5 μg, 和TS 0.16, 0.5, 2.5 μg及内标等量, 按所建立的HPLC法测定。分别于空白尿样2.0 ml中各加入CT及TS各0.8, 3.0, 12.5 μg, 并加内标等量, HPLC法测定, 结果血样平均方法回收率为: (92.57±7.33)%(CT), (91.84±2.75)%(TS); 尿样平均方法回收率: CT为(98.26±4.16)%,TS为(97.33±3.85)%。
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5 代谢物的干扰试验
CT在体内的其它两个代谢物与TS在该条件下的保留时间都低于TS，且与CT及TS有较好的分离度, 对测定无干扰。
6 iv CT在猪体内的药代动力学
单剂量(10 mg.kg-1) iv CT给药后，CT在猪血浆中的浓度-时间曲线如图2所示。血浆浓度数据经处理，选定最佳药代动力学模型为二室开放模型。
由表1可见，CT的分布半衰期很小(T1/2α为2.36 min),说明CT在猪体内分布很快；中央室分布容积(V1)占总体分布容积(VB)的比例较小，说明CT在猪体内分布较广；其消除半衰期较短(T1/2β为64.78 min)，提示其在猪体内消除较快。
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Fig 2 Plasma concentration-time curve of CT and TS after single intravenous(10 mg.kg-1) adminstration of CT to pigs. ●—● CT; ▲—▲ TS. CT: Cryptotanshinone; TS: Tanshinone IIA.
7 代谢物TS在猪体内的药代动力学
CT单剂量iv后, 在测定CT血药浓度的同时, 对其活性代谢物TS也进行了测定,其在猪血浆中的浓度-时间曲线见图2。
由图2可见,CT在猪体内部分可迅速代谢为TS, 在iv CT后4.6 min,TS血浆浓度达到高峰, 峰值约为0.62 μg.ml-1。此后TS血浆浓度逐渐减少,并随着CT的消除而消除(表1)。
, 百拇医药
Tab 1 Pharmacokinetics parameters describing disposition CT and TS in pigs after iv a single dose(10 mg.kg-1) Parameter
±s
CT A/μg.ml-1
2.90±2.11
B/μg.ml-1
0.19±0.08
α/min-1
0.41±0.25
, 百拇医药
β/min-1
0.014±0.009
T1/2α/min
2.36±1.62
T1/2β/min
64.78±33.28
K12/min-1
0.25±0.22
K21/min-1
0.039±0.023
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Ke1/min-1
0.132±0.047
V1/L.kg-1
3.47±1.67
VB/L.kg-1
45.25±22.17
ClB/L.kg-1.min-1
0.55±0.28
, http://www.100md.com AUC/mg.min.L-1
23.83±12.74
fc
0.12±0.09
TS T1/2β/min
189.04±103.42
AUC/mg.min.L-1
22.97±10.83
Tp/min
4.61±1.61
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Cmax/μg.ml-1
0.62±0.26
8 血管外途径给药后CT在猪血中浓度的测定
给猪灌服单剂量20 mg.kg-1,然后定时采血, 分析血浆中的CT和TS, 结果均为阴性。当剂量提高到40 mg.kg-1时检测,结果大部分检样也为阴性, 仅在给药后1 h左右测得血样浓度为0.043 μg.ml-1。当给猪im CT 20 mg.kg-1时, 结果大部分检样亦为阴性, 仅在给药后15 min测得CT浓度为0.051 μg.ml-1, 20 min时CT浓度为0.056 μg.ml-1。而TS浓度均在检测浓度以下, 未测得。
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9 排泄
尿排泄 6头猪, 禁食12 h, iv CT 10 mg.kg-1,或po CT 40 mg.kg-1,给药后分别分段收集尿样, 测定CT及TS含量。结果iv给药后, CT从尿液中排出很少, 服药24 h时仅排出给药量的0.20%，48 h共排出0.24%。CT活性代谢物TS在48 h内共排出0.095%。po给药后, CT自尿液中排出的量更少, 48 h时仅排出给药量的0.023%，TS则仅为0.0057%。
胆汁排泄 2头猪po CT 40 mg.kg-1, po后6,12,24 h内原型药CT自胆汁排出分别为给药量的0.011%，0.0195%及0.238%。代谢物TS的排出量则分别为0.0065%，0.017%及0.041%。讨论
, http://www.100md.com CT在实验动物小鼠、大鼠体内的代谢转化研究已有报道[8,9],但在靶动物猪体内进行药代动力学、排泄与代谢研究，国内外尚属首次。我们从iv CT的猪尿中分离出4种成分，其中经鉴定，TS为原药CT经体内血液与肝药酶作用经脱氢反应首先产生的主要代谢产物,其进一步可被转化。TS对金葡菌的抑制作用低于原药[10]，但据文献报道，对分枝杆菌的作用却强于原药[1]。对此，有待进一步研究。
iv, po及im给药后, CT及其活性代谢产物TS在血中维持的浓度较低，且消除较快, 尤其以po及im给药时表现明显。药物在血中浓度较低也预示原形药自尿中排泄较少，如iv CT 后48 h内CT的排泄量仅占给药量的0.24%。与大鼠的排泄结果比较，po给药后, 48 h内猪体内原形药仅排出给药量的0.023%，胆汁排泄24 h为0.24%, 而大鼠分别为0.34%与0.80%，表明有种属共性。增加给药剂量也未能明显提高po给药后的血药浓度。结果表明, po CT在猪体内吸收较差或吸收后迅速被肝脏转化(首过效应), 一部分首先转化为TS, 后者进一步被羟化代谢为含羟基代谢物, 并结合内源物使极性增大而利于排出。另外, 由于CT及TS 等化合物皆含有邻醌结构, 而具此结构的化合物可以直接参与体内电子转移反应, 其结构本身也可能发生一些较复杂的变化, 其机理尚需研究。文献报道po丹参酮对感染金葡菌的小鼠无治疗保护作用, 而体外抑菌试验结果明显[1], 原因是 CT在体内迅速被转化为TS而不能在相当时间内维持一定的血药浓度, 而且TS抑金葡菌的活性较低, 因此达不到抑菌浓度而不能起到保护作用。提示在兽医临床上, 以im或po途径给药有一定局限性,除非进行结构改造或剂型改进。但是，在兽医临床上, 以CT为主成分的总酮一般多用于局部给药, 如治疗子宫内膜炎、乳腺炎、外伤感染等都是由局部注入或局敷，其治疗效果确实显著。另外，po给药后, 我们从猪的粪便中回收到约12%的CT, 这表明有一部分CT未被吸收, 经肠道由粪便排出, 而这种情况确可保持肠道的抑菌效果, 实际上,po治疗一些猪的腹泻症, 效果明显。
, 百拇医药
体外抑菌试验表明，TS对分枝结核杆菌的抑菌作用较强, 因此,用CT及TS等丹参酮类化合物iv治疗动物分枝结核杆菌病, 值得重视。要正确评价CT的药代动力学性质及其制剂的质量，最好同时检测血中的原药及其主要活性代谢产物。是否原药与代谢物在同时发挥药理作用，值得进一步研究。
致谢 夏文江研究员及胡振英、史彦斌同志参加部分工作。
基金项目：“九五”国家重点科研项目(攻关)(96-005-02-04-05)参考文献
1 高玉桂,宋玉梅,杨友义,等. 丹参酮的药理. 药学学报，1979,14∶75
2 房其年,张佩玲,徐宗沛. 丹参抗菌有效成分的研究. 化学学报，1976,34∶197
3 高晓山,金润. 丹参酮治疗化脓性感染综合报告. 中草药通讯， 1978,(4)∶33
, 百拇医药
4 张锡源. 丹参注射液静脉滴注治疗急性腹泻91例. 中国中西医结合杂志， 1993,13∶109
5 Chang HN, Cheng KP, Choang TF, et al. Structure elucidation and total synthesis of new tanshinones isolated Salvia miltiorrhiza Bunge. J Org Chem, 1990,55∶3537
6 崔颖,薛明,史彦斌,等. 反相高效液相色谱法测定隐丹参酮的血浆浓度. 中国兽医科技, 1997,27∶28
7 夏文江,成章瑞. MCPKP-药物动力学室分析的一种微机程序. 中国药理学报, 1988,9∶188
8 谢明智,申竹芳. 隐丹参酮的吸收，分布,排泄和代谢. 药学学报， 1983,18∶90
9 罗厚蔚,盛龙生,张胜强,等. 抗分枝杆菌活性成份丹参酮的胆汁排泄与肝内转化. 药学学报, 1983,18∶1
10 薛明，崔颖，张彬，等. 抗菌活性成份隐丹参酮在猪体内 的生物转化与活性研究. 中国兽医学报, 1998,(待发表)
收稿日期：1998-03-30, 百拇医药
单位：薛明 崔颖 罗永江 张彬 周宗田 中国农业科学院中兽医研究所, 兰州 730050；汪汉卿 中国科学院兰州化学物理研究所, 兰州 730050
关键词：隐丹参酮；丹参酮IIA；药代动力学；高效液相色谱法
药学学报990201 摘要 目的： 研究隐丹参酮(CT)及其代谢物丹参酮IIA(TS)在猪体内的药代动力学。方法： 实验猪5头, 单剂量(10 mg.kg-1) iv隐丹参酮后,采用反相 HPLC法检测CT及TS的血浆浓度。 以二苄基为内标, 流动相为甲醇—水(85∶15),检测波长254 nm。 结果： CT血药时程符合二室开放模型。im与po给药后, CT和TS的血药浓度很低。 少量原药及其代谢产物在胆汁中随着给药时间的延长逐渐增多。不同途径给药后(iv及po),隐丹参酮及丹参酮IIA在尿中的排泄量占给药剂量的比例很小。 结论： 猪CT及TS药代动力学数据为动物临床用药提供有价值的理论依据。
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PHARMACOKINETICS OF CRYPTOTANSHINONE AND
ITS METABOLITE IN PIGS
Xue Ming(Xue M), Cui Ying(Cui Y),Luo Yongjiang(Luo YJ),Zhang Bin(Zhang B) and Zhou Zongtian(Zhou ZT)
(Insititute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Chinese Academy of Agricultural Sciences Lanzhou 730050)
Wang Hanqing(Wang HQ)
(Lanzhou Institute of Physical Chemistry, Academia Sinica, Lanzhou 730050)
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ABSTRACT AIM: To study the pharmacokinetics and excretion of the antibacterial constituent cryptotanshinone (CT) isolated from the roots of Saliva przewaalskii Maxim (Labiatae) and its metabolite tanshinone IIA(TS) in pigs. METHODS: Normal pigs were given CT iv 10 mg.kg-1. The concentrations of CT and TS in porcine plasma, urine and bile were determined by an HPLC method developed in our laberatory. A waters model 480 instrument was used throughout the experiment. Dibenyl was used as the internal standard at absorption wavelength of 254 nm. A mixture of methanol and water(85∶15) was used as the mobile phase with a flow rate of 1 ml.min-1, and YWG C18H37 as stationary phase. RESULTS: The method is simple, sensitive and available for pharmacokinetics studies. Plasma drug concentration-time course of CT after iv adminstration of CT was found to be fitted to a two compartment open model and its pharmacokinetic paremeters were as follows: T1/2α=2.36 min, T1/2β=64.78 min, AUC=23.83 mg.min.L-1. TS was detected simultaneously. Peak plasma concentration of TS was reached at about 4.6 minutes after dosing. Cmax=0.62 μg.ml-1, T1/2β=189.04 min, AUC=22.97 mg.min.L-1. The excretion of CT and TS in urine and bile in 24～48 hour was very few after iv and po administration of CT. CONCLUSION: The pharmacokinetics of CT and TS in pigs provided a useful index for clinical trial in animals.
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KEY WORDS cryptotanshinone; tanshinone IIA; pharmacokinetics; HPLC
隐丹参酮(cryptotanshinone， CT)是从药用鼠尾草植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)及甘西鼠尾草(S.przewaquskii Maxim)的根中分离提纯的二萜醌类化合物。体外试验证明，对金葡菌及其耐药菌株、链球菌、分枝杆菌等病源菌有较强的抑杀作用[1，2]。临床应用以CT为主成分的总酮治疗人的一些感染性疾病，收到较好效果[3，4]。我们开始用其治疗畜禽感染性疾病如乳腺炎、子宫内膜炎、外伤感染、腹泻等，效果满意。CT在动物体内的药代动力学未见报道。本文报道CT及其活性代谢产物丹参酮IIA(tanshinone IIA,TS)在猪体内的药代动力学、排泄与代谢。为临床合理用药、新药研制及剂型改进提供理论依据。
材料与方法
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药品与试剂 CT标准品由本实验室从甘西鼠尾草的根中分离纯化制得，经熔点、TLC及光谱数据证明为纯品[2，5]。 纯度大于99%，静脉注射液用丙二醇溶解CT标准品制得，浓度为15 mg.ml-1。甲醇为色谱纯，重蒸水，内标二苄基(dibenzyl, DB) 为实验试剂，重结晶。其它试剂均为市售分析纯。
实验动物 健康杂交猪5头，雄性阉割，体重(30±5) kg， 购自甘肃省种猪场。先iv CT 10 mg.kg-1, 约半月后, po CT 40 mg.kg-1, 并分别在代谢笼内收集(0～48) h自然排出的尿液, -20℃冰箱保存备用。另选健康猪2头, 禁食12 h后灌服CT 40 mg.kg-1, 在乙醚麻醉下插胆管, 并分段收集胆汁, 测定药物及其代谢物含量。
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给药及采样 每头猪由耳静脉插套管后，先经iv，半月后经po给药，给药前禁食12 h，不禁水。给药前即时及给药后不同时间采取静脉血5 ml，肝素液抗凝，离心(3 000 r.min-1) 10 min，分离血浆，每个时间点精确吸取血浆1.0 ml。同时采集胆汁与尿液，-20℃冰箱保存。
仪器与色谱条件 Waters高效液相色谱仪系列； YWG-C18H37(10 μm) 4.0 mm×150 mm色谱柱； Waters 510型泵; 480型紫外检测器; U6K型进样阀；AST型数据处理仪；3800型打印机。流动相为甲醇—水(85∶15),流速1.0 ml.min-1;柱温25±0.5℃;检测波长254 nm；内标为DB。
药物检测方法及数据处理 分别精确量取血浆样品1.0 ml，胆汁1.0 ml及尿液2.0 ml, 精确加入内标，再加入等体积乙酸乙酯提取3次, 涡旋1 min, 3 000 r.min-1离心10 min, 合并上清液, 氮气吹干, 残渣用流动相100 μl溶解, 取10 μl进样, 反相HPLC检测CT及TS浓度[6]。 iv的血药时程数据按非线性最小二乘法用MCPKP药代动力学程序处理[7]。
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结 果
1 色谱行为
在上述色谱条件下，空白血浆及尿液和给药后血浆及尿液的色谱图见图1，CT的保留时间(TR)为(4.1±0.1) min, TS的TR为(5.9±0.1) min。
Fig 1 Representative chromatograms of (a) blank plasma, (b) a plasma sample from a pig(given crytotanshinone) containing cryptotanshinone 0.82 μg.ml-1 and tanshinone IIA 1.41 μg.ml-1, (c) blank urine and (d) a urine sample from a pig(given crytotanshinone) containing cryptotanshinone 8.28 μg.ml-1 and tanshinone IIA 3.22 μg.ml-1. 1: Cryptotanshinone; 2: Dibenzy(internal standard); 3: Tanshinone IIA.
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2 线性范围和检测灵敏度
分别配制浓度为0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.50, 5.00及12.5 μg.ml-1的CT及TS的标准血样及尿样各2管, 按样品测定方法操作,以CT的浓度对CT峰面积与内标DB的峰面积比值进行线性回归,得回归方程, 血浆:Y=0.3068X-0.0337, γ=0.9994， 尿样:Y=0.7727X-0.0317, γ=0.9998。
以TS的浓度对TS峰面积与DB的峰面积比值进行线性回归, 得回归方程, 血浆: Y=1.1783X-0.0428, γ=0.9998, 尿样: Y=1.1116X+0.0048, γ=0.9998。
最低检测量为10 ng, 最低检测浓度为16 ng.ml-1。
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3 精密度试验
分别配制含CT 0.2, 0.5, 2.5及含TS 0.16, 0.5, 2.5 μg.ml-1的标准血样, 配制含CT与TS各0.8, 3.0, 12.5 μg.ml-1的尿样, 各管中加内标适量。依法操作，分别测定日内及日间精密度，结果日内测得各浓度的相对标准差(RSD)小于3%, 日间测得各浓度的RSD小于6%。
4 回收率测定
分别于空白血浆1.0 ml中加入CT 0.2, 0.5, 2.5 μg, 和TS 0.16, 0.5, 2.5 μg及内标等量, 按所建立的HPLC法测定。分别于空白尿样2.0 ml中各加入CT及TS各0.8, 3.0, 12.5 μg, 并加内标等量, HPLC法测定, 结果血样平均方法回收率为: (92.57±7.33)%(CT), (91.84±2.75)%(TS); 尿样平均方法回收率: CT为(98.26±4.16)%,TS为(97.33±3.85)%。
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5 代谢物的干扰试验
CT在体内的其它两个代谢物与TS在该条件下的保留时间都低于TS，且与CT及TS有较好的分离度, 对测定无干扰。
6 iv CT在猪体内的药代动力学
单剂量(10 mg.kg-1) iv CT给药后，CT在猪血浆中的浓度-时间曲线如图2所示。血浆浓度数据经处理，选定最佳药代动力学模型为二室开放模型。
由表1可见，CT的分布半衰期很小(T1/2α为2.36 min),说明CT在猪体内分布很快；中央室分布容积(V1)占总体分布容积(VB)的比例较小，说明CT在猪体内分布较广；其消除半衰期较短(T1/2β为64.78 min)，提示其在猪体内消除较快。
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Fig 2 Plasma concentration-time curve of CT and TS after single intravenous(10 mg.kg-1) adminstration of CT to pigs. ●—● CT; ▲—▲ TS. CT: Cryptotanshinone; TS: Tanshinone IIA.
7 代谢物TS在猪体内的药代动力学
CT单剂量iv后, 在测定CT血药浓度的同时, 对其活性代谢物TS也进行了测定,其在猪血浆中的浓度-时间曲线见图2。
由图2可见,CT在猪体内部分可迅速代谢为TS, 在iv CT后4.6 min,TS血浆浓度达到高峰, 峰值约为0.62 μg.ml-1。此后TS血浆浓度逐渐减少,并随着CT的消除而消除(表1)。
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Tab 1 Pharmacokinetics parameters describing disposition CT and TS in pigs after iv a single dose(10 mg.kg-1) Parameter
±s
CT A/μg.ml-1
2.90±2.11
B/μg.ml-1
0.19±0.08
α/min-1
0.41±0.25
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β/min-1
0.014±0.009
T1/2α/min
2.36±1.62
T1/2β/min
64.78±33.28
K12/min-1
0.25±0.22
K21/min-1
0.039±0.023
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Ke1/min-1
0.132±0.047
V1/L.kg-1
3.47±1.67
VB/L.kg-1
45.25±22.17
ClB/L.kg-1.min-1
0.55±0.28
, http://www.100md.com AUC/mg.min.L-1
23.83±12.74
fc
0.12±0.09
TS T1/2β/min
189.04±103.42
AUC/mg.min.L-1
22.97±10.83
Tp/min
4.61±1.61
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Cmax/μg.ml-1
0.62±0.26
8 血管外途径给药后CT在猪血中浓度的测定
给猪灌服单剂量20 mg.kg-1,然后定时采血, 分析血浆中的CT和TS, 结果均为阴性。当剂量提高到40 mg.kg-1时检测,结果大部分检样也为阴性, 仅在给药后1 h左右测得血样浓度为0.043 μg.ml-1。当给猪im CT 20 mg.kg-1时, 结果大部分检样亦为阴性, 仅在给药后15 min测得CT浓度为0.051 μg.ml-1, 20 min时CT浓度为0.056 μg.ml-1。而TS浓度均在检测浓度以下, 未测得。
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9 排泄
尿排泄 6头猪, 禁食12 h, iv CT 10 mg.kg-1,或po CT 40 mg.kg-1,给药后分别分段收集尿样, 测定CT及TS含量。结果iv给药后, CT从尿液中排出很少, 服药24 h时仅排出给药量的0.20%，48 h共排出0.24%。CT活性代谢物TS在48 h内共排出0.095%。po给药后, CT自尿液中排出的量更少, 48 h时仅排出给药量的0.023%，TS则仅为0.0057%。
胆汁排泄 2头猪po CT 40 mg.kg-1, po后6,12,24 h内原型药CT自胆汁排出分别为给药量的0.011%，0.0195%及0.238%。代谢物TS的排出量则分别为0.0065%，0.017%及0.041%。讨论
, http://www.100md.com CT在实验动物小鼠、大鼠体内的代谢转化研究已有报道[8,9],但在靶动物猪体内进行药代动力学、排泄与代谢研究，国内外尚属首次。我们从iv CT的猪尿中分离出4种成分，其中经鉴定，TS为原药CT经体内血液与肝药酶作用经脱氢反应首先产生的主要代谢产物,其进一步可被转化。TS对金葡菌的抑制作用低于原药[10]，但据文献报道，对分枝杆菌的作用却强于原药[1]。对此，有待进一步研究。
iv, po及im给药后, CT及其活性代谢产物TS在血中维持的浓度较低，且消除较快, 尤其以po及im给药时表现明显。药物在血中浓度较低也预示原形药自尿中排泄较少，如iv CT 后48 h内CT的排泄量仅占给药量的0.24%。与大鼠的排泄结果比较，po给药后, 48 h内猪体内原形药仅排出给药量的0.023%，胆汁排泄24 h为0.24%, 而大鼠分别为0.34%与0.80%，表明有种属共性。增加给药剂量也未能明显提高po给药后的血药浓度。结果表明, po CT在猪体内吸收较差或吸收后迅速被肝脏转化(首过效应), 一部分首先转化为TS, 后者进一步被羟化代谢为含羟基代谢物, 并结合内源物使极性增大而利于排出。另外, 由于CT及TS 等化合物皆含有邻醌结构, 而具此结构的化合物可以直接参与体内电子转移反应, 其结构本身也可能发生一些较复杂的变化, 其机理尚需研究。文献报道po丹参酮对感染金葡菌的小鼠无治疗保护作用, 而体外抑菌试验结果明显[1], 原因是 CT在体内迅速被转化为TS而不能在相当时间内维持一定的血药浓度, 而且TS抑金葡菌的活性较低, 因此达不到抑菌浓度而不能起到保护作用。提示在兽医临床上, 以im或po途径给药有一定局限性,除非进行结构改造或剂型改进。但是，在兽医临床上, 以CT为主成分的总酮一般多用于局部给药, 如治疗子宫内膜炎、乳腺炎、外伤感染等都是由局部注入或局敷，其治疗效果确实显著。另外，po给药后, 我们从猪的粪便中回收到约12%的CT, 这表明有一部分CT未被吸收, 经肠道由粪便排出, 而这种情况确可保持肠道的抑菌效果, 实际上,po治疗一些猪的腹泻症, 效果明显。
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体外抑菌试验表明，TS对分枝结核杆菌的抑菌作用较强, 因此,用CT及TS等丹参酮类化合物iv治疗动物分枝结核杆菌病, 值得重视。要正确评价CT的药代动力学性质及其制剂的质量，最好同时检测血中的原药及其主要活性代谢产物。是否原药与代谢物在同时发挥药理作用，值得进一步研究。
致谢 夏文江研究员及胡振英、史彦斌同志参加部分工作。
基金项目：“九五”国家重点科研项目(攻关)(96-005-02-04-05)参考文献
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6 崔颖,薛明,史彦斌,等. 反相高效液相色谱法测定隐丹参酮的血浆浓度. 中国兽医科技, 1997,27∶28
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收稿日期：1998-03-30, 百拇医药