吩噻嗪类化合物抑制肿瘤细胞多药耐药及蛋白激酶C活性的三维构效关系研究
作者：彭晖 杨纯正 梁巍 齐静 黄牛 郭宗儒
单位：彭晖 杨纯正 梁巍 齐静 中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所， 天津 300020；黄牛 郭宗儒 中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所， 北京 100050
关键词：吩噻嗪类衍生物；多药耐药；逆转剂；蛋白激酶C
药学学报990208 摘要 目的：利用本室诱导建立的耐药细胞株K562/A02,研究在体外条件下吩噻嗪类衍生物(PTZs)逆转多药耐药(MDR)活性的构效关系。方法与结果：利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构，结合计算化学和分子图形学手段对PKC抑制剂与PKC蛋白分子间可能的相互作用模式进行探讨。结果表明，2位取代各种基团逆转MDR作用强度依次为：COC3H7>CF3>COCH3>H。边链哌嗪环4′-位取代基作用强度为:CH3>COOC2H5>C2H4OH。结论：选出代表性化合物测定对鼠脑的抑制活性，初步三维构效关系研究表明，PTZs抑制PKC活性确实与特定的立体结构特征有关。本研究为进一步探索PTZs，PKC和MDR三者间的内在机制和设计有效PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了新的途径。
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STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIP OF PHENOTHIAZINES
FOR INHIBITION OF PROTEIN KINASE C AND
REVERSAL OF MULTIDRUG RESISTANCE
Peng Hui(Peng H), Yang Chunzheng(Yang CZ), Liang Wei(Liang W), Qi Jing(Qi J)
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020
Huang Niu(Huang N)1 and Guo Zongru(Guo ZR)1
, 百拇医药
Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To study the structure-activity relationship of phenothiazines(PTZs) for inhibition of protein kinase C (PKC) and reversal of multidrug resistance (MDR) in vitro. METHODS and RESULTS: The possible binding model of PTZs to PKC based upon the X-ray structure of PMA(phorbol myristic acetate) in complex with PKC Cys 2 with DOCK program was explored. The results showed that the order of potency of reversal effect of PTZs on MDR is as follows: 2-COC3H7>2-CF3>2-COCH3>H. The type of piperazinyl substitution also significantly affected potency against MDR. The result showed the order: CH3>COOC2H5>C2H4OH. CONCLUSION: Some derivatives of PTZ was tested for inhibition of PKC. The observation indicates that PTZs inhibit PKC in a manner related to specific structural feature. Our molecular-modeling study suggests preliminarily how these PTZs bind to PKC and provide a structural basis for the design of high affinity PKC-modulator. Our structure-activity studies offer a way to understand which molecular structure affects activity, and this information may be used in the rational design of more effective drugs.
, 百拇医药
KEY WORDS phenothiazines; multidrug resistance; reversal agent; protein kinase C
肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因。所谓肿瘤多药耐药性，是指患者接受化疗药物治疗后，对原来药物产生耐药，并且对其它的药物产生交叉耐药，从而出现临床疗效的降低或无效的现象。MDR的产生与mdr 1基因的过度表达有关，mdr 1基因的产物P-糖蛋白(Pgp或P-170)是位于细胞膜表面的能量依赖性药物外排泵，可将各种不同的细胞毒药物泵出细胞外，从而减少细胞内药物聚集，防止药物杀伤细胞的作用[1]。因此，开发针对肿瘤细胞耐药的逆转剂是当前研究主流之一。
蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一种Ca2+、磷脂依赖性蛋白激酶，已经证实，激活的PKC使蛋白质磷酸化，从而产生各种生物学效应，在细胞的信号传递中起重要作用，尤其是证实PKC可通过影响Pgp磷酸化水平而影响其转运功能，更引起人们的极大重视。新近研究表明，PKC可诱导和加速Pgp的磷酸化而导致MDR的发生和发展[2,3]。因此，PKC自然就成为一个非常重要的逆转MDR研究的靶点。
, 百拇医药
吩噻嗪类衍生物对MDR有较强的逆转作用，且被广泛用于体外多种肿瘤耐药细胞系的逆转研究中。虽然吩噻嗪类衍生物逆转MDR机制仍不清楚，但是一个主要假设机制已被提出[4,5]：吩噻嗪类衍生物是通过与细胞毒药物竞争Pgp的同一结合位点而阻止药物外排，或者是通过抑制PKC酶，从而阻断Pgp的磷酸化来达到抑制MDR产生。
为阐明吩噻嗪类衍生物逆转多药耐药与抑制PKC的结构特征，我们利用本室诱导建立的耐药细胞株K562/A02[6]研究吩噻嗪类衍生物逆转MDR过程中PKC的作用。
为进一步研究吩噻嗪类衍生物与PKC生物活性机制，我们利用DOCK软件—分子对接软件，直观地在三维空间中考察配体小分子与受体大分子相互作用时的结合模式特征，并结合生物活性初步探讨吩噻嗪类衍生物、PKC和MDR三者间可能的内在机制，为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供新型结构信息。
, 百拇医药
材料和方法
材料、PKC蛋白酶的分离纯化、PKC蛋白酶活性的测定和细胞毒实验以及逆转阿霉素耐药作用测定 见另文[7]。
吩噻嗪类衍生物和PKC的结合 所有化合物用Tripos公司分子模拟软件系统Alchemy 2000中“Alchemy minimizer”程序进行能量优化，原子点电荷采用Gasteiger-Huckel体系, 收敛到能量变化<0.02 Kcal.mol-1。 分子对接研究是在SGI RZ 4000图形工作站上用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包完成的，所有参数均为SYBYL缺省值。DOCK步骤如下:从PMA(phorbol myristic acetate)-PKC复合物中抽提出PMA, 将吩噻嗪类衍生物分子与PMA进行分子叠合，以保证它们的空间取向一致,把叠合后的吩噻嗪类衍生物分子导入PKC结合腔中，优化分子间的相互作用能量,过程中保持受体位点构象不变，只改变配体构象。
, 百拇医药
结果
1 吩噻嗪类衍生物对MDR细胞耐药逆转作用
吩噻嗪类衍生物分子结构和实验结果见表1。以衍生物对阿霉素(ADR)对MDR细胞耐药逆转倍数(IC50 ADR/IC50(ADR+药物))比较各种基团变化对MDR细胞耐药逆转强度的情况。结果为2-COC3H7>2-CF3>2-COCH3>H。
Tab 1 Structure of phenothiazines and effect on K562/A02
Name
X
R
, 百拇医药
5-position
MDR Ratio
PTZ1
COCH3
SO2
5.18
PTZ2
COCH3
S
1.29
PTZ4
COC3H7
, 百拇医药
S
4.67
PTZ5
COC3H7
S
2.94
PTZ6
COCH3
SO2
2.49
PTZ7
CF3
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SO2
36.58
PTZ11
COC3H7
S
75.78
PTZ13
Cl
S
17.32
PTZ14
H
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S
3.40
PTZ15
COCH3
S
8.04
TFP
CF3
S
3.97
K562/A02: MDR cell line; MDR: Multidrug resistance; PTZ: Phenothiazines; TFP: Trifluoperazine.
, 百拇医药
结合表1中各种结构式可见: (1) PTZ14与PTZ15比较, 除2位基团外, 其余部分完全相同,PTZ14逆转MDR细胞作用强度明显减弱, 可见2位COCH3比无取代作用强。 (2) 同样有相似结构的PTZ6与PTZ7比较, 2位取代CF3基团远远优于COCH3基团。 (3) 与对照品三氟拉嗪(TFP)比较, PTZ11的2位取代COC3H7基团大大优于CF3基团。
另外, 同样有吩噻嗪环主结构的PTZ4,PTZ5和PTZ11之间, 若边链4′位哌嗪环取代基不同, 其逆转作用强度仍有明显差异(表1), 实验结果如下: CH3>COOC2H5>C2H4OH。
2 吩噻嗪类衍生物对鼠脑PKC活性抑制作用
, 百拇医药
按试剂盒说明测定4种吩噻嗪类衍生物(PTZ6，PTZ7，PTZ11和TFP)对PKC酶活性的影响, 结果见表2, 以IC50(使50%鼠脑PKC酶活性受到抑制的吩噻嗪类衍生物的浓度(mol.L-1))比较抑制作用强度, 其中PTZ11与TFP抑制作用强度大于PTZ6与PTZ7。
Tab 2 Inhibition of PKC(rat brain) by PTZs Chemosensitizer
IC50/μmol.L-1
Activity
TFP
100.00±30.00
, 百拇医药
High
PTZ11
133.00±9.64
High
PTZ6
489.77±31.40
Poor
PTZ7
>500
Poor
PKC： Protein kinase C.
3 PMA存在下, PTZ11对PKC活性抑制
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结果见图1, 表明在PKC激动剂PMA存在下, PTZ11仍能抑制PKC活性, 但抑制率降低, 提示PTZ11可能和PMA竞争性地结合PKC, 从而抑制PMA激活作用。
Fig 1 Inhibition of PKC in vitro by PTZ11 in the presence of PMA(10 μmol.L-1). PKC activity was determined in the presence of various concentrations of PTZ11(100, 200 and 300 μmol.L-1). ■ PMA: Phorbol myristic acetate; □ PMA+PTZ: Phorbol myristic acetate and phenothiazines.
4 PTZ11对K562/A02细胞PKC活性抑制作用
, 百拇医药
结果表明, PTZ11存在时, 细胞内的PKC活性为229 min-1.mg-1, 而阴性对照K562/A02细胞内PKC活性为2761 min-1.mg-1, 两者差别有显著意义(P<0.05), 提示PTZ11能抑制细胞内PKC活性。
5 吩噻嗪类衍生物与PKC相互作用的分子图形
利用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包, 我们模拟了有结构代表性的两个化合物PTZ11和PTZ6与PKC Cys 2功能区可能的结合模型, 如图2所示，从不同配体和受体相互作用模式的区别有显著意义方面阐明PTZ11和PTZ6抑制PKC活性(实验数据)。另外，通过Alchemy“RMS Fit”程序对这4个化合物进行叠合，见图3和图4。
Fig 2 Overall features of the binding model for PTZ11 and PTZ6 in complex with PKC δ Cys 2. The protein backbone is shown in a ribbon diagram. The ligand is displayed as a stick model, and three hydrophobic residues in close contact with the ligand are displayed as a stick and ball model.
, 百拇医药
Fig 3 Comparison of the conformation of PTZ6 and PTZ11.
Fig 4 Comparison of the conformation of PTZ6, PTZ7, PTZ11 and TFP.
讨论
目前已应用于逆转MDR的药物，最主要的一大类为膜转运调节剂, 如钙离子通道拮抗剂和钙调蛋白(calmodulin, CaM)抑制剂等。吩噻嗪类衍生物是一种较典型的CaM抑制剂。我们的研究表明, 新的吩噻嗪类衍生物都有一定的逆转MDR活性的作用, 但作用强度差别很大。吩噻嗪环上2-位和边链哌嗪环4′-位取代基团不同，逆转MDR活性有明显差异。具2-位取代基团化学结构的逆转作用强度依次为COC3H7>CF3>COCH3>H。具边链哌嗪环4′-位取代基的逆转作用强度为CH3>COOC2H5>C2H4OH。可见4′-位带有羰基和羟基的极性取代基团不利于活性，而CH3这种疏水烷基有利于逆转活性。推测可能是药物分子边链与受体的某疏水区域相互作用的结果。另外，从PTZ1和PTZ6活性比较来看，边链4′-取代烷基哌嗪环比哌啶环有利于逆转MDR活性。
, 百拇医药
有报道[9]，吩噻嗪类衍生物也可抑制PKC活性，这是否与逆转MDR相关尚未见报道。我们选择4个代表性化合物测定对鼠脑PKC酶的抑制活性。结果表明：PTZ11与TFP活性高，而PTZ6与PTZ7活性较低。通过Alchemy “RMS Fit”程序对这4个化合物进行叠合，发现主要区别在于10位氮原子上边链的走向不一致，见图4，PTZ11和TFP取向一致，而PTZ6与PTZ7取向相同。恰巧与上面抑制PKC活性结果一致，提示吩噻嗪类衍生物抑制PKC确实与特定的立体结构特征有关。见图3，造成PTZ6与PTZ11构象不同的主要原因为5位取代基团，PTZ11是硫醚键，而PTZ6的5位氧化为砜。
通过研究在PKC激动剂PMA存在下PTZ11对PKC活性的影响，发现其抑制PKC活性能力下降，且与PTZ11浓度呈正相关，提示PTZ11可能通过与PMA竞争PKC的结合位点而起作用。这为利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构来探索与抑制剂结合模型提供实验依据。利用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包进行分子图形学研究。PKC Cys 2功能区的原子坐标来源于PDB(Brookhaven Protein Data Bank)数据库，经DOCK研究，得到PTZ11，PTZ6与PKC Cys 2相互作用的模式，由图2可见，PTZ11中的两个苯环与一个长烷基边链可分别与PKC中的3个疏水作用区域紧密结合，也进一步证实Kozikowski等[8]提出抑制剂与3个疏水区域相互作用模型，而活性较差的PTZ6仅边链与PKC一个疏水区域相互作用，从分子图形学研究可明显解释活性差异(实验数据)与相互作用模式相关性。由于PTZ6与PTZ11结构上差异，造成构象的不同，使得两者在与PKC相互作用时产生不同强度的疏水作用，从而抑制PKC活性的程度有很大差别。另外，这种作用模型也部分解释了哌嗪环4′位疏水取代基CH3作用大于极性取代基COOC2H5和C2H4OH作用的结果。结合前面MDR研究，发现PTZ11与PTZ6逆转MDR细胞(K562/A02)对阿霉素耐药倍数分别为75.78和2.49，提示吩噻嗪类衍生物抑制PKC与逆转MDR之间可能有某些关联。本研究应用计算机辅助分子图形学初步探索了PKC酶与抑制剂相互作用模式，为进一步设计有效的PKC抑制剂提供了新的途径。
, 百拇医药
PKC与MDR关系的研究起步较晚，有些问题还未搞清或未被完全证实，但其在MDR发生发展的作用基本上是可以肯定的。吩噻嗪类衍生物是否通过抑制PKC酶从而间接作用于Pgp蛋白，逆转多药耐药？ 我们的初步探索结果不能作为结论。首先，PKC酶活性的抑制实验都是在离体的鼠脑组织中测定的。其次，我们还需要更多吩噻嗪类衍生物进行MDR和PKC构效关系分析。通过系列化合物(配体)与受体结合的相互作用能计算值与实验生物活性相关性，来研究分子作用机制。我们只是试图从三维分子图形角度阐明吩噻嗪类衍生物抑制PKC活性差异，而且尝试利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构来探索与抑制剂结合的模型，为深入研究吩噻嗪类衍生物的作用机制，进一步设计受体选择性配体探索一条可行途径。
联系人
基金项目：国家自然科学基金赞助项目(39470816)
参考文献
, 百拇医药
1 Bradley G, Juranka PF, Ling V. Mechanism of multidrug resistance. Biochim Biophys Acta, 1988,948∶87
2 Fine RL, Patel J, Chabner BA. Phorbol esters induce multidrug resistance in human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85∶582
3 Posada JA, Mckeegan EM, Worthington KF, et al. Human multidrug resistant KB cells overexpress protein kinase C: involvement in drug resistance. Cancer Commun, 1989,1∶285
, 百拇医药
4 Ford JM, Prozialeck WC, Hait WN. Structural features determining activity of phenothiazines and related drugs for inhibition of cell growth and reversal of multidrug resistance. Mol Pharmacol, 1989,35∶105
5 Ford JM, Bruggeman EP, Pastan I, et al. Cellular and biochemical characterization of Thioxanthenes for reversal of multidrug resistance in human and murine cell lines. Cancer Research, 1990,50∶1748
6 栾凤君，杨纯正，马建国, 等. 一株人红白血病多药耐药细胞系K562/A02的建立及其耐药特性的研究. 中华肿瘤杂志，1993,15∶101
, http://www.100md.com
7 梁巍，杨纯正，齐静, 等. 吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用研究. 科学通报， 1998,43∶1196
8 Kozikowski AP, Wang S, Ma D, et al. Modeling, chemistry, and biology of the benzolactam analogues of indolactam V (ILV). 2. Identification of the binding site of the benzolactams in the CRD2 activator-binding domain of PKC δ and discovery of an ILV analogue of improved isozyme selectivity. J Med Chem, 1997,40∶1316
9 Aftab DT, Ballas LM, Loomis CR, et al. Structure-activity relationships of phenothiazines and related drugs for inhibition of protein kinase C. Mol Pharmacol, 1991,40∶798
收稿日期：1998-01-23, http://www.100md.com
单位：彭晖 杨纯正 梁巍 齐静 中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所， 天津 300020；黄牛 郭宗儒 中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所， 北京 100050
关键词：吩噻嗪类衍生物；多药耐药；逆转剂；蛋白激酶C
药学学报990208 摘要 目的：利用本室诱导建立的耐药细胞株K562/A02,研究在体外条件下吩噻嗪类衍生物(PTZs)逆转多药耐药(MDR)活性的构效关系。方法与结果：利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构，结合计算化学和分子图形学手段对PKC抑制剂与PKC蛋白分子间可能的相互作用模式进行探讨。结果表明，2位取代各种基团逆转MDR作用强度依次为：COC3H7>CF3>COCH3>H。边链哌嗪环4′-位取代基作用强度为:CH3>COOC2H5>C2H4OH。结论：选出代表性化合物测定对鼠脑的抑制活性，初步三维构效关系研究表明，PTZs抑制PKC活性确实与特定的立体结构特征有关。本研究为进一步探索PTZs，PKC和MDR三者间的内在机制和设计有效PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了新的途径。
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STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIP OF PHENOTHIAZINES
FOR INHIBITION OF PROTEIN KINASE C AND
REVERSAL OF MULTIDRUG RESISTANCE
Peng Hui(Peng H), Yang Chunzheng(Yang CZ), Liang Wei(Liang W), Qi Jing(Qi J)
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020
Huang Niu(Huang N)1 and Guo Zongru(Guo ZR)1
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Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To study the structure-activity relationship of phenothiazines(PTZs) for inhibition of protein kinase C (PKC) and reversal of multidrug resistance (MDR) in vitro. METHODS and RESULTS: The possible binding model of PTZs to PKC based upon the X-ray structure of PMA(phorbol myristic acetate) in complex with PKC Cys 2 with DOCK program was explored. The results showed that the order of potency of reversal effect of PTZs on MDR is as follows: 2-COC3H7>2-CF3>2-COCH3>H. The type of piperazinyl substitution also significantly affected potency against MDR. The result showed the order: CH3>COOC2H5>C2H4OH. CONCLUSION: Some derivatives of PTZ was tested for inhibition of PKC. The observation indicates that PTZs inhibit PKC in a manner related to specific structural feature. Our molecular-modeling study suggests preliminarily how these PTZs bind to PKC and provide a structural basis for the design of high affinity PKC-modulator. Our structure-activity studies offer a way to understand which molecular structure affects activity, and this information may be used in the rational design of more effective drugs.
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KEY WORDS phenothiazines; multidrug resistance; reversal agent; protein kinase C
肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因。所谓肿瘤多药耐药性，是指患者接受化疗药物治疗后，对原来药物产生耐药，并且对其它的药物产生交叉耐药，从而出现临床疗效的降低或无效的现象。MDR的产生与mdr 1基因的过度表达有关，mdr 1基因的产物P-糖蛋白(Pgp或P-170)是位于细胞膜表面的能量依赖性药物外排泵，可将各种不同的细胞毒药物泵出细胞外，从而减少细胞内药物聚集，防止药物杀伤细胞的作用[1]。因此，开发针对肿瘤细胞耐药的逆转剂是当前研究主流之一。
蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一种Ca2+、磷脂依赖性蛋白激酶，已经证实，激活的PKC使蛋白质磷酸化，从而产生各种生物学效应，在细胞的信号传递中起重要作用，尤其是证实PKC可通过影响Pgp磷酸化水平而影响其转运功能，更引起人们的极大重视。新近研究表明，PKC可诱导和加速Pgp的磷酸化而导致MDR的发生和发展[2,3]。因此，PKC自然就成为一个非常重要的逆转MDR研究的靶点。
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吩噻嗪类衍生物对MDR有较强的逆转作用，且被广泛用于体外多种肿瘤耐药细胞系的逆转研究中。虽然吩噻嗪类衍生物逆转MDR机制仍不清楚，但是一个主要假设机制已被提出[4,5]：吩噻嗪类衍生物是通过与细胞毒药物竞争Pgp的同一结合位点而阻止药物外排，或者是通过抑制PKC酶，从而阻断Pgp的磷酸化来达到抑制MDR产生。
为阐明吩噻嗪类衍生物逆转多药耐药与抑制PKC的结构特征，我们利用本室诱导建立的耐药细胞株K562/A02[6]研究吩噻嗪类衍生物逆转MDR过程中PKC的作用。
为进一步研究吩噻嗪类衍生物与PKC生物活性机制，我们利用DOCK软件—分子对接软件，直观地在三维空间中考察配体小分子与受体大分子相互作用时的结合模式特征，并结合生物活性初步探讨吩噻嗪类衍生物、PKC和MDR三者间可能的内在机制，为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供新型结构信息。
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材料和方法
材料、PKC蛋白酶的分离纯化、PKC蛋白酶活性的测定和细胞毒实验以及逆转阿霉素耐药作用测定 见另文[7]。
吩噻嗪类衍生物和PKC的结合 所有化合物用Tripos公司分子模拟软件系统Alchemy 2000中“Alchemy minimizer”程序进行能量优化，原子点电荷采用Gasteiger-Huckel体系, 收敛到能量变化<0.02 Kcal.mol-1。 分子对接研究是在SGI RZ 4000图形工作站上用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包完成的，所有参数均为SYBYL缺省值。DOCK步骤如下:从PMA(phorbol myristic acetate)-PKC复合物中抽提出PMA, 将吩噻嗪类衍生物分子与PMA进行分子叠合，以保证它们的空间取向一致,把叠合后的吩噻嗪类衍生物分子导入PKC结合腔中，优化分子间的相互作用能量,过程中保持受体位点构象不变，只改变配体构象。
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结果
1 吩噻嗪类衍生物对MDR细胞耐药逆转作用
吩噻嗪类衍生物分子结构和实验结果见表1。以衍生物对阿霉素(ADR)对MDR细胞耐药逆转倍数(IC50 ADR/IC50(ADR+药物))比较各种基团变化对MDR细胞耐药逆转强度的情况。结果为2-COC3H7>2-CF3>2-COCH3>H。
Tab 1 Structure of phenothiazines and effect on K562/A02
Name
X
R
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5-position
MDR Ratio
PTZ1
COCH3
SO2
5.18
PTZ2
COCH3
S
1.29
PTZ4
COC3H7
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S
4.67
PTZ5
COC3H7
S
2.94
PTZ6
COCH3
SO2
2.49
PTZ7
CF3
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SO2
36.58
PTZ11
COC3H7
S
75.78
PTZ13
Cl
S
17.32
PTZ14
H
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S
3.40
PTZ15
COCH3
S
8.04
TFP
CF3
S
3.97
K562/A02: MDR cell line; MDR: Multidrug resistance; PTZ: Phenothiazines; TFP: Trifluoperazine.
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结合表1中各种结构式可见: (1) PTZ14与PTZ15比较, 除2位基团外, 其余部分完全相同,PTZ14逆转MDR细胞作用强度明显减弱, 可见2位COCH3比无取代作用强。 (2) 同样有相似结构的PTZ6与PTZ7比较, 2位取代CF3基团远远优于COCH3基团。 (3) 与对照品三氟拉嗪(TFP)比较, PTZ11的2位取代COC3H7基团大大优于CF3基团。
另外, 同样有吩噻嗪环主结构的PTZ4,PTZ5和PTZ11之间, 若边链4′位哌嗪环取代基不同, 其逆转作用强度仍有明显差异(表1), 实验结果如下: CH3>COOC2H5>C2H4OH。
2 吩噻嗪类衍生物对鼠脑PKC活性抑制作用
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按试剂盒说明测定4种吩噻嗪类衍生物(PTZ6，PTZ7，PTZ11和TFP)对PKC酶活性的影响, 结果见表2, 以IC50(使50%鼠脑PKC酶活性受到抑制的吩噻嗪类衍生物的浓度(mol.L-1))比较抑制作用强度, 其中PTZ11与TFP抑制作用强度大于PTZ6与PTZ7。
Tab 2 Inhibition of PKC(rat brain) by PTZs Chemosensitizer
IC50/μmol.L-1
Activity
TFP
100.00±30.00
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High
PTZ11
133.00±9.64
High
PTZ6
489.77±31.40
Poor
PTZ7
>500
Poor
PKC： Protein kinase C.
3 PMA存在下, PTZ11对PKC活性抑制
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结果见图1, 表明在PKC激动剂PMA存在下, PTZ11仍能抑制PKC活性, 但抑制率降低, 提示PTZ11可能和PMA竞争性地结合PKC, 从而抑制PMA激活作用。
Fig 1 Inhibition of PKC in vitro by PTZ11 in the presence of PMA(10 μmol.L-1). PKC activity was determined in the presence of various concentrations of PTZ11(100, 200 and 300 μmol.L-1). ■ PMA: Phorbol myristic acetate; □ PMA+PTZ: Phorbol myristic acetate and phenothiazines.
4 PTZ11对K562/A02细胞PKC活性抑制作用
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结果表明, PTZ11存在时, 细胞内的PKC活性为229 min-1.mg-1, 而阴性对照K562/A02细胞内PKC活性为2761 min-1.mg-1, 两者差别有显著意义(P<0.05), 提示PTZ11能抑制细胞内PKC活性。
5 吩噻嗪类衍生物与PKC相互作用的分子图形
利用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包, 我们模拟了有结构代表性的两个化合物PTZ11和PTZ6与PKC Cys 2功能区可能的结合模型, 如图2所示，从不同配体和受体相互作用模式的区别有显著意义方面阐明PTZ11和PTZ6抑制PKC活性(实验数据)。另外，通过Alchemy“RMS Fit”程序对这4个化合物进行叠合，见图3和图4。
Fig 2 Overall features of the binding model for PTZ11 and PTZ6 in complex with PKC δ Cys 2. The protein backbone is shown in a ribbon diagram. The ligand is displayed as a stick model, and three hydrophobic residues in close contact with the ligand are displayed as a stick and ball model.
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Fig 3 Comparison of the conformation of PTZ6 and PTZ11.
Fig 4 Comparison of the conformation of PTZ6, PTZ7, PTZ11 and TFP.
讨论
目前已应用于逆转MDR的药物，最主要的一大类为膜转运调节剂, 如钙离子通道拮抗剂和钙调蛋白(calmodulin, CaM)抑制剂等。吩噻嗪类衍生物是一种较典型的CaM抑制剂。我们的研究表明, 新的吩噻嗪类衍生物都有一定的逆转MDR活性的作用, 但作用强度差别很大。吩噻嗪环上2-位和边链哌嗪环4′-位取代基团不同，逆转MDR活性有明显差异。具2-位取代基团化学结构的逆转作用强度依次为COC3H7>CF3>COCH3>H。具边链哌嗪环4′-位取代基的逆转作用强度为CH3>COOC2H5>C2H4OH。可见4′-位带有羰基和羟基的极性取代基团不利于活性，而CH3这种疏水烷基有利于逆转活性。推测可能是药物分子边链与受体的某疏水区域相互作用的结果。另外，从PTZ1和PTZ6活性比较来看，边链4′-取代烷基哌嗪环比哌啶环有利于逆转MDR活性。
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有报道[9]，吩噻嗪类衍生物也可抑制PKC活性，这是否与逆转MDR相关尚未见报道。我们选择4个代表性化合物测定对鼠脑PKC酶的抑制活性。结果表明：PTZ11与TFP活性高，而PTZ6与PTZ7活性较低。通过Alchemy “RMS Fit”程序对这4个化合物进行叠合，发现主要区别在于10位氮原子上边链的走向不一致，见图4，PTZ11和TFP取向一致，而PTZ6与PTZ7取向相同。恰巧与上面抑制PKC活性结果一致，提示吩噻嗪类衍生物抑制PKC确实与特定的立体结构特征有关。见图3，造成PTZ6与PTZ11构象不同的主要原因为5位取代基团，PTZ11是硫醚键，而PTZ6的5位氧化为砜。
通过研究在PKC激动剂PMA存在下PTZ11对PKC活性的影响，发现其抑制PKC活性能力下降，且与PTZ11浓度呈正相关，提示PTZ11可能通过与PMA竞争PKC的结合位点而起作用。这为利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构来探索与抑制剂结合模型提供实验依据。利用Tripos公司的SYBYL 6.04软件包进行分子图形学研究。PKC Cys 2功能区的原子坐标来源于PDB(Brookhaven Protein Data Bank)数据库，经DOCK研究，得到PTZ11，PTZ6与PKC Cys 2相互作用的模式，由图2可见，PTZ11中的两个苯环与一个长烷基边链可分别与PKC中的3个疏水作用区域紧密结合，也进一步证实Kozikowski等[8]提出抑制剂与3个疏水区域相互作用模型，而活性较差的PTZ6仅边链与PKC一个疏水区域相互作用，从分子图形学研究可明显解释活性差异(实验数据)与相互作用模式相关性。由于PTZ6与PTZ11结构上差异，造成构象的不同，使得两者在与PKC相互作用时产生不同强度的疏水作用，从而抑制PKC活性的程度有很大差别。另外，这种作用模型也部分解释了哌嗪环4′位疏水取代基CH3作用大于极性取代基COOC2H5和C2H4OH作用的结果。结合前面MDR研究，发现PTZ11与PTZ6逆转MDR细胞(K562/A02)对阿霉素耐药倍数分别为75.78和2.49，提示吩噻嗪类衍生物抑制PKC与逆转MDR之间可能有某些关联。本研究应用计算机辅助分子图形学初步探索了PKC酶与抑制剂相互作用模式，为进一步设计有效的PKC抑制剂提供了新的途径。
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PKC与MDR关系的研究起步较晚，有些问题还未搞清或未被完全证实，但其在MDR发生发展的作用基本上是可以肯定的。吩噻嗪类衍生物是否通过抑制PKC酶从而间接作用于Pgp蛋白，逆转多药耐药？ 我们的初步探索结果不能作为结论。首先，PKC酶活性的抑制实验都是在离体的鼠脑组织中测定的。其次，我们还需要更多吩噻嗪类衍生物进行MDR和PKC构效关系分析。通过系列化合物(配体)与受体结合的相互作用能计算值与实验生物活性相关性，来研究分子作用机制。我们只是试图从三维分子图形角度阐明吩噻嗪类衍生物抑制PKC活性差异，而且尝试利用已知PKC Cys 2功能区晶体结构来探索与抑制剂结合的模型，为深入研究吩噻嗪类衍生物的作用机制，进一步设计受体选择性配体探索一条可行途径。
联系人
基金项目：国家自然科学基金赞助项目(39470816)
参考文献
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收稿日期：1998-01-23, http://www.100md.com