小鼠脾脏树突细胞的免疫刺激作用
作者：薛静波 刘希英
单位：青岛医学院(青岛266021)；薛静波(免疫学教研室)；刘希英(微生物学教研室)
关键词：树突细胞；巨噬细胞；T淋巴细胞，增殖；小鼠
青岛医学院学报990207 【摘要】 ①目的 探讨小鼠脾脏树突细胞(DC)的免疫刺激作用。②方法 以DC作为刺激细胞，T淋巴细胞作为反应细胞，检测同种混合淋巴细胞反应(MLR)。③结果 DC的免疫刺激作用比巨噬细胞显著增高，差异有显著意义(t′=29.5～48.7,P<0.001)；DC刺激T细胞对氧化物丝裂原NaIO4的增殖反应比巨噬细胞有显著增强(t′=46.3,P<0.001)。④结论 DC具有较强的免疫刺激作用。
中国图书馆分类法分类号 R392.12
IMMUNE STIMULATORY EFFECT OF MURINE
, 百拇医药
SPLENIC DENDRITIC CELLS
Xue Jingbo, Liu Xiying
Department of Immunology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the immune stimulatory effe ct of murine splenic dendritic cells (DC). Methods With DC as stimulatory cell and T cell as reactive cells, to induce the mixed lymphocyte reaction (MLR). Results The stimulatory effect of DC was significantly higher t han that of macrophage in primary mixed lymphocyte reaction (t′=29.5-48.7, P <0.001); The proliferation reaction of T cell stimulated by DC to mitogen NaIO 4 was much stronger than that of macrophage (t′=46.3,P<0.001). Conclusion DC possesses a potent immune stimulatory effect.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 dendritic cell; macrophages; T lymphocyte, proliferat ion; mice
机体的免疫应答首先是抗原递呈细胞(APC)捕获并加工处理抗原，然后将抗原信息传递给T，B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答。因此，APC是引起免疫应答的首要环节。近年来发现，树突细胞(DC)是一种抗原递呈细胞〔1〕。由于DC的分离纯化较困难，所以国内有关DC的研究并不多见。本文从小鼠脾脏经多步骤分离纯化DC，与巨噬细胞比较其功能，初步探讨了DC的免疫刺激作用。
1 材料与方法
1.1 动物选择
DBA/2小鼠，C57BL/6小鼠，均为雌性，体质量18～20g，由中国医学科学院实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 仪器与试剂
Percoll系Pharacia公司产品；Mitomycin,NaIO4系Sigma公司产品；抗Ia单克隆抗体系华美公司产品；RPMI-1640由Gibco公司生产；新生小牛血清(NBCS)由天津生化制药厂生产；3H-UdR由中国科学院原子能研究所提供。液闪仪系Bechman公司产品。
1.3 DC和巨噬细胞的分离与纯化
按文献〔2〕的方法。将DBA/2小鼠脾细胞(1011/L)悬浮于密度为1.032kg/L的Percoll液中，然后加在密度为1.072kg/L的Percoll分离液上，作连续密度梯度离心分离25min(800r/min).吸出1.072kg/L密度液界面上的低密度层细胞。用磷酸盐缓冲液洗2次，1000r/min离心5min.细胞重悬于RPMI-1640(内含体积分数为0.05的NBCS)，细胞浓度(1～2)×1010/L，接种于9cm塑料平皿上，在37℃,体积分数为0.05的CO2条件下培养2h.去除非黏附细胞，黏附细胞重新加入RPMI-1640(内含体积分数为0.1的NBCS)过夜培养。仍然黏附的细胞是巨噬细胞。脱落细胞用前法再次黏附，收集非黏附细胞，即为DC.
, 百拇医药
1.4 小鼠脾脏T细胞的提纯
按文献〔3〕方法提取T细胞，然后在(3～5)×109/L细胞悬液中加入抗Ia单抗和新鲜的豚鼠血清(补体)，在37℃下温育1h，用大量的PBS洗3次。最后将纯化的T细胞悬浮于RPMI-1640(内含体积分数为0.1的NBCS)培养液中。
1.5 混合淋巴细胞反应(MLR)的测定
DBA/2小鼠脾脏DC和巨噬细胞(均用丝裂霉素C25mg/L预处理30min,然后用PBS洗3次作为刺激细胞，C57BL/6小鼠的脾脏T细胞为反应细胞。MLR测定按文献〔3〕的方法进行。
1.6 NaIO4刺激的T细胞增殖反应及测定
按文献〔4〕的方法进行。
, http://www.100md.com
1.7 统计学处理
实验结果以
±s表示，组间比较采用t′检验。
2 结果
2.1 DC在MLR中的刺激作用
2×108/LT细胞和不同R/S(反应细胞/刺激细胞)比值的DC或巨噬细胞作MLR，试验于72h终止。结果显示，在R/S值为(1∶8)～(1∶64)的各组间，DC的刺激作用较巨噬细胞显著增强(t′=29.5～48.7,P<0.001)。见表1.
表1 DC刺激T细胞的增殖作用(f/min-1,±s) 组别
, 百拇医药
n
R/S
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
巨噬细胞
6
436±12
173±5
161±13
112±15
树突细胞
, 百拇医药
6
15337±1643*
13455±1255*
8849±821*
4237±983*
与巨噬细胞比较,*t′=29.5～48.7,P<0.001
2.2 DC刺激T细胞对NaIO4的增殖作用
T细胞对NaIO4作用的增殖反应也需要刺激细胞的作用。在48h时，测定增殖反应。结果显示，巨噬细胞仅有微弱的增殖作用，而DC则有明显的增殖反应，二者比较差异有极显著性(t=46.3,P<0.001)。见表2.
, 百拇医药
表2 DC刺激T细胞对NaIO4的增殖作用(f/min-1,±s) 组别
n
MLR中刺激细胞的数量
0
2×104
巨噬细胞
6
394±6
1083±83
树突细胞
, http://www.100md.com
6
394±6
47245±1226*
与巨噬细胞比较,*t′=46.3,P<0.001
3 讨论
机体对蛋白质抗原的应答有赖于APC的辅助作用。APC包括DC,巨噬细胞、B细胞等。其中DC是功能最强的APC，因其在成熟期形态伸出树突样伪足而得名。DC广泛分布于全身各个组织器官。有别于其他APC，DC最大的特点是能够显著刺激原始型T细胞增殖，而巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。所以，DC是机体免疫反应的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特地位〔5〕。由于DC数量极少，分离困难，所以对DC的研究很少。随着分子生物学、分子免疫学等理论和技术的发展，近年来克隆和表达了许多细胞因子，使DC能在体外大量扩增。DC的研究逐渐成为免疫学研究中一个不断升温的热点。
, 百拇医药
本文采用多步骤从小鼠脾细胞分离纯化DC，研究其刺激同种初级MLR.结果表明，DC在此反应中的作用，要远远强于巨噬细胞的作用。并且，在氧化物丝裂原诱导的T淋巴细胞增殖反应中，也需要APC的辅助作用，而DC的刺激作用明显强于巨噬细胞的作用。从一个侧面反映了DC是机体免疫应答中最强有力的免疫刺激细胞。
体内外研究表明，成熟DC高表达MHCⅠ,Ⅱ类分子，同时提供充分的协同刺激信号，在与T细胞结合后而强烈激活T细胞。另外，在体外经抗原致敏的DC或抗原基因转染的DC，回输或免疫接种至荷瘤小鼠体内，能显著诱导机体产生抗原特异性CTL，进行肿瘤免疫治疗〔6〕。
有关DC体内游走、选择性趋化、抗原递呈、激发免疫应答的分子机制是一崭新的研究领域，深入认识其作用不仅有助于了解机体免疫应答的调控机制，而且可以通过调节DC的功能来调节免疫应答，对感染、肿瘤、移植排斥、免疫耐受和自身免疫疾病的治疗和预防具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Inaba K. Dendritic cells as antigen-presenting cells in vivo. Imm unol Cell Biol, 1997, 185: 1131
2 Steinman RM, Schuler G, Brooks CF, et al. Purification of spleen dend ritic cells in vitro. J Exp Med, 1979, 1: 149
3 Steinman RM, Schuler G, Brooks CF, et al. Dendritic cells are the pri ncipal stimulators of the primary mixed lymphocyte reaction in mice. J Exp Med , 1983, 157: 613
, 百拇医药
4 Estelle M, Malissen B, Walden P, et al. Accessory cells dependent T l ymphocyte proliferation: potent activity of dendritic cells. Immunobiology, 1987, 174:30
5 Hart D. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control t he primary immune response. Blood, 1997, 90: 3245
6 Schuler G, Steinman RM. Dendritic cells as ajuvants for immune-media ted resistance to tumors. J Exp Med, 1997, 186: 1183
(1998-11-18收稿 1999-04-26修回), 百拇医药
单位：青岛医学院(青岛266021)；薛静波(免疫学教研室)；刘希英(微生物学教研室)
关键词：树突细胞；巨噬细胞；T淋巴细胞，增殖；小鼠
青岛医学院学报990207 【摘要】 ①目的 探讨小鼠脾脏树突细胞(DC)的免疫刺激作用。②方法 以DC作为刺激细胞，T淋巴细胞作为反应细胞，检测同种混合淋巴细胞反应(MLR)。③结果 DC的免疫刺激作用比巨噬细胞显著增高，差异有显著意义(t′=29.5～48.7,P<0.001)；DC刺激T细胞对氧化物丝裂原NaIO4的增殖反应比巨噬细胞有显著增强(t′=46.3,P<0.001)。④结论 DC具有较强的免疫刺激作用。
中国图书馆分类法分类号 R392.12
IMMUNE STIMULATORY EFFECT OF MURINE
, 百拇医药
SPLENIC DENDRITIC CELLS
Xue Jingbo, Liu Xiying
Department of Immunology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the immune stimulatory effe ct of murine splenic dendritic cells (DC). Methods With DC as stimulatory cell and T cell as reactive cells, to induce the mixed lymphocyte reaction (MLR). Results The stimulatory effect of DC was significantly higher t han that of macrophage in primary mixed lymphocyte reaction (t′=29.5-48.7, P <0.001); The proliferation reaction of T cell stimulated by DC to mitogen NaIO 4 was much stronger than that of macrophage (t′=46.3,P<0.001). Conclusion DC possesses a potent immune stimulatory effect.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 dendritic cell; macrophages; T lymphocyte, proliferat ion; mice
机体的免疫应答首先是抗原递呈细胞(APC)捕获并加工处理抗原，然后将抗原信息传递给T，B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答。因此，APC是引起免疫应答的首要环节。近年来发现，树突细胞(DC)是一种抗原递呈细胞〔1〕。由于DC的分离纯化较困难，所以国内有关DC的研究并不多见。本文从小鼠脾脏经多步骤分离纯化DC，与巨噬细胞比较其功能，初步探讨了DC的免疫刺激作用。
1 材料与方法
1.1 动物选择
DBA/2小鼠，C57BL/6小鼠，均为雌性，体质量18～20g，由中国医学科学院实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 仪器与试剂
Percoll系Pharacia公司产品；Mitomycin,NaIO4系Sigma公司产品；抗Ia单克隆抗体系华美公司产品；RPMI-1640由Gibco公司生产；新生小牛血清(NBCS)由天津生化制药厂生产；3H-UdR由中国科学院原子能研究所提供。液闪仪系Bechman公司产品。
1.3 DC和巨噬细胞的分离与纯化
按文献〔2〕的方法。将DBA/2小鼠脾细胞(1011/L)悬浮于密度为1.032kg/L的Percoll液中，然后加在密度为1.072kg/L的Percoll分离液上，作连续密度梯度离心分离25min(800r/min).吸出1.072kg/L密度液界面上的低密度层细胞。用磷酸盐缓冲液洗2次，1000r/min离心5min.细胞重悬于RPMI-1640(内含体积分数为0.05的NBCS)，细胞浓度(1～2)×1010/L，接种于9cm塑料平皿上，在37℃,体积分数为0.05的CO2条件下培养2h.去除非黏附细胞，黏附细胞重新加入RPMI-1640(内含体积分数为0.1的NBCS)过夜培养。仍然黏附的细胞是巨噬细胞。脱落细胞用前法再次黏附，收集非黏附细胞，即为DC.
, 百拇医药
1.4 小鼠脾脏T细胞的提纯
按文献〔3〕方法提取T细胞，然后在(3～5)×109/L细胞悬液中加入抗Ia单抗和新鲜的豚鼠血清(补体)，在37℃下温育1h，用大量的PBS洗3次。最后将纯化的T细胞悬浮于RPMI-1640(内含体积分数为0.1的NBCS)培养液中。
1.5 混合淋巴细胞反应(MLR)的测定
DBA/2小鼠脾脏DC和巨噬细胞(均用丝裂霉素C25mg/L预处理30min,然后用PBS洗3次作为刺激细胞，C57BL/6小鼠的脾脏T细胞为反应细胞。MLR测定按文献〔3〕的方法进行。
1.6 NaIO4刺激的T细胞增殖反应及测定
按文献〔4〕的方法进行。
, http://www.100md.com
1.7 统计学处理
实验结果以
±s表示，组间比较采用t′检验。2 结果
2.1 DC在MLR中的刺激作用
2×108/LT细胞和不同R/S(反应细胞/刺激细胞)比值的DC或巨噬细胞作MLR，试验于72h终止。结果显示，在R/S值为(1∶8)～(1∶64)的各组间，DC的刺激作用较巨噬细胞显著增强(t′=29.5～48.7,P<0.001)。见表1.
表1 DC刺激T细胞的增殖作用(f/min-1,
±s) 组别, 百拇医药
n
R/S
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
巨噬细胞
6
436±12
173±5
161±13
112±15
树突细胞
, 百拇医药
6
15337±1643*
13455±1255*
8849±821*
4237±983*
与巨噬细胞比较,*t′=29.5～48.7,P<0.001
2.2 DC刺激T细胞对NaIO4的增殖作用
T细胞对NaIO4作用的增殖反应也需要刺激细胞的作用。在48h时，测定增殖反应。结果显示，巨噬细胞仅有微弱的增殖作用，而DC则有明显的增殖反应，二者比较差异有极显著性(t=46.3,P<0.001)。见表2.
, 百拇医药
表2 DC刺激T细胞对NaIO4的增殖作用(f/min-1,
±s) 组别n
MLR中刺激细胞的数量
0
2×104
巨噬细胞
6
394±6
1083±83
树突细胞
, http://www.100md.com
6
394±6
47245±1226*
与巨噬细胞比较,*t′=46.3,P<0.001
3 讨论
机体对蛋白质抗原的应答有赖于APC的辅助作用。APC包括DC,巨噬细胞、B细胞等。其中DC是功能最强的APC，因其在成熟期形态伸出树突样伪足而得名。DC广泛分布于全身各个组织器官。有别于其他APC，DC最大的特点是能够显著刺激原始型T细胞增殖，而巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。所以，DC是机体免疫反应的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特地位〔5〕。由于DC数量极少，分离困难，所以对DC的研究很少。随着分子生物学、分子免疫学等理论和技术的发展，近年来克隆和表达了许多细胞因子，使DC能在体外大量扩增。DC的研究逐渐成为免疫学研究中一个不断升温的热点。
, 百拇医药
本文采用多步骤从小鼠脾细胞分离纯化DC，研究其刺激同种初级MLR.结果表明，DC在此反应中的作用，要远远强于巨噬细胞的作用。并且，在氧化物丝裂原诱导的T淋巴细胞增殖反应中，也需要APC的辅助作用，而DC的刺激作用明显强于巨噬细胞的作用。从一个侧面反映了DC是机体免疫应答中最强有力的免疫刺激细胞。
体内外研究表明，成熟DC高表达MHCⅠ,Ⅱ类分子，同时提供充分的协同刺激信号，在与T细胞结合后而强烈激活T细胞。另外，在体外经抗原致敏的DC或抗原基因转染的DC，回输或免疫接种至荷瘤小鼠体内，能显著诱导机体产生抗原特异性CTL，进行肿瘤免疫治疗〔6〕。
有关DC体内游走、选择性趋化、抗原递呈、激发免疫应答的分子机制是一崭新的研究领域，深入认识其作用不仅有助于了解机体免疫应答的调控机制，而且可以通过调节DC的功能来调节免疫应答，对感染、肿瘤、移植排斥、免疫耐受和自身免疫疾病的治疗和预防具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Inaba K. Dendritic cells as antigen-presenting cells in vivo. Imm unol Cell Biol, 1997, 185: 1131
2 Steinman RM, Schuler G, Brooks CF, et al. Purification of spleen dend ritic cells in vitro. J Exp Med, 1979, 1: 149
3 Steinman RM, Schuler G, Brooks CF, et al. Dendritic cells are the pri ncipal stimulators of the primary mixed lymphocyte reaction in mice. J Exp Med , 1983, 157: 613
, 百拇医药
4 Estelle M, Malissen B, Walden P, et al. Accessory cells dependent T l ymphocyte proliferation: potent activity of dendritic cells. Immunobiology, 1987, 174:30
5 Hart D. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control t he primary immune response. Blood, 1997, 90: 3245
6 Schuler G, Steinman RM. Dendritic cells as ajuvants for immune-media ted resistance to tumors. J Exp Med, 1997, 186: 1183
(1998-11-18收稿 1999-04-26修回), 百拇医药