羟苯氨酮强心作用的生化机理研究
作者：叶益新 范礼理 林勇 杨晓然 乔小英 陈兰兰
单位：叶益新 杨晓然 乔小英 陈兰兰 中国医学科学院、中国协和医科大学基础医学研究所, 北京 100005；范礼理 林勇 药物研究所，北京 100050
关键词：羟苯氨酮；钠，钾-三磷酸腺苷酶；磷酸二酯酶；钙-三磷酸腺苷酶；环-磷酸腺苷；钙增敏剂
药学学报990203 摘要 目的：研究羟苯氨酮(oxyphenamone, Oxy)强心作用的生化机理。方法：采用Na+,K+-ATP酶活性和cAMP-PDE活性、肌浆网Ca2+-ATP酶活性和cAMP含量以及心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性等测定法，研究Oxy对它们的影响，并与milrinone和MCI-154作比较。 结果：Oxy对Na+,K+-ATP酶和PDE无抑制作用，也不影响心肌cAMP含量，但能显著增强心肌肌原纤维对Ca2+的敏感性，高浓度时轻度抑制心肌肌浆网Ca2+-ATP酶活性。结论：Oxy的强心作用方式不同于强心苷、β受体激动剂和PDE抑制剂等强心药,可能为一种新的钙增敏性强心药物。
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BIOCHEMCAL MECHANISM OF THE POSITIVE
INOTROPIC EFFECT OF OXYPHENAMONE
Ye Yixin(Ye YX),Yang Xiaoran(Yang XR),Qiao Xiaoying(Qiao XY) and Chen Lanlan(Chen LL)
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medial College, Beijing 100005)
Fan Lili(Fan LL) Lin Yong(Lin Y)
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(Institute of Meteria Medica Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medial College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To investigated the biochemical mechanisms of the positive inotropic effect of oxyphenamone(Oxy). METHODS: The assays of Na+,K+-ATPase activity, cAMP dependent phosphodiesterase(cAMP-PDE) activity and Ca2+-ATPase activity in sarcoplasmic reticulum(SR) isolated from cardiac muscle, cAMP level in cardiac muscle and the cardiac myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity were adopted and compared with those of strophanthin-G(Str) and milrinone(Mil). RESULTS: Oxy at its effective concentration, showed no remarkable inhibition on Na+,K+-ATPase and cAMP dependent phosphodiesterase (cAMP-PDE) activities, while in parallel experiments Na+,K+-ATPase and cAMP-PDE activities were significantly inhibited by Str and Mil. Their IC50 values were found to be 2.0 μmol.L-1, and 85 μmol.L-1, respectively. Oxy did not affect the cAMP level in cardiac muscle of guinea pig. However, Mil at 30 μmol.L-1 in control experiments increased the cAMP level by 73.6%. These results suggest that the mechanism of the positive inotropic effect of Oxy differs from that of glycosides, PDE inhibitors and β-adrenergic agonists. Oxy at 100 μmol.L-1 inhibited Ca2+-ATPase activity significantly in cardiac sarcoplasmic reticulum. Its IC50 value was 200 μmol.L-1. The result suggests that Oxy at high concentration exerts inhibitory effect on the Ca2+ uptake by SR. This mechanism may be partly responsible for the positive inotropic effect of Oxy. Oxy at 50 μmol.L-1 shifted the relationship curve between pCa2+and myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity to the left without affecting the maximum enzyme activity. When pCa 7, Oxy increased the myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity in a concentration dependent manner and EC50 value was about 10 μmol.L-1. MCI-154 at 100 μmol.L-1 and some new derivatives of Oxy with positive inotropic effect enhanced the Ca2+ sensitivity. Mil at 100 μmol.L-1and some new derivatives of Oxy with no positive inotropic effect showed no effect at all. Solaro and Kitada found a positive correlation between the increase of myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity and the enhancement of Ca2+ sensitivity of the contractile protein system. CONCLUSION: These results demonstrate that the biochemical mechanism of the positive inotropic effect of Oxy is different from these of the cardiac glycosides, PDE inhibitors and β-adrenergic agonists, therefore, it may be a novel cardiotonic agent, a calcium sensitizer.
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KEY WORDS oxyphenamone; Na+,K+-ATPase; phosphodiesterase; Ca2+,Mg2+-ATPase; cAMP; calcium sensitizers
羟苯氨酮(oxyphenamone, Oxy)系中国医学科学院药物研究所合成的新化合物，经离体、整体和分子水平的实验研究表明有显著的强心和扩血管作用[1,2]。为探讨Oxy强心作用的生化机理，本文研究了Oxy对Na+,K+-ATP酶、磷酸二酯酶(PDE)、cAMP含量和肌浆网Ca2+-ATP酶以及去膜心肌肌原纤维钙敏性的影响。
材料和方法
材料 羟苯氨酮由我院药物研究所合成室提供,用蒸馏水稍加温制成母液。 米利农(milrinone, Mil)由重庆医工所提供,用少量0.1 mol.L-1 HCl溶解后用碱液调至pH中性备用。毒毛旋花子甙G(strophanthin-G, Str)购自Sigma公司,用50%～60%乙醇溶解后用缓冲液稀释配成母液,乙醇的终浓度不超过1%。 上述母液的浓度均为10 mmol.L-1，实验前用缓冲液稀释至所需浓度。 3H-cAMP 购自中国原子能研究所,比活性为1028.6 GBq.mmol-1。
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Na+,K+-ATP酶制备及其活性测定[3] 用经典方法从猫肾皮质提取纯化得到较纯的Na+,K+-ATP酶制备,制备的比活性为30～40 u.mg-1(蛋白)，占总酶的(90～95)%，浓度为1 mg(蛋白).ml-1。测定酶活性的方法简述如下: 反应液成分(mmol.L-1): NaCl 100, MgCl2 5, KCl 15, EDTA 0.1 和Tris-HCl 50, pH 7.4。 酶制备约0.1 mg.ml-1, 总体积1 ml。 空白管不加酶制备,Mg2+-ATP酶管加Str 1 mmol.L-1，总酶管不加Str, 药物管加不同浓度测试药物。 37℃保温10 min后,加入Na2ATP 4 mmol.L-1启动反应。10 min后,加15%三氯醋酸(TCA)终止反应。 各管置冰浴降温10 min,离心(3 000 r.min-1,常温) 10 min取上清液1 ml, 按Bonting法[4]测释放的无机磷量。酶活性单位为μmolPi.mg-1(蛋白).h-1，总酶和Mg2+-ATP酶的差即为Na+,K+-ATP酶活性。药物对酶活性的影响按下式计算: %对照值=加药管酶活性/无药管酶活性×100。
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磷酸二酯酶(PDE)的制备及其活性测定 参考文献[5]法,取豚鼠心室肌约1 g加5倍量缓冲液(mmol.L-1: MgCl2 5, Tris-HCl 50),离心(8 000×g, 4℃) 30 min, 上清液为酶制备,置-20℃冰箱保存,用前加缓冲液稀释。
cAMP-PDE(cGAP-PDE)活性测定原理:
用QAE-Sephadex柱分离 [3H]cAMP(cGMP)和[3H]腺苷,测定[3H]腺苷的放射性,以[3H]cAMP转化成[3H]腺苷的转化率表示PDE活性。药物对酶活性的影响的计算同Na+,K+-ATP酶。测定PDE酶的方法简述如下: 反应液的成分(mmol.L-1): MgCl2 5, Tris-HCl 50, pH 7.4, [3H]cAMP(cGMP)cpm为80 000～100 000 min-1, 一定量酶制备和测试药物,总体积250 μl。 空白管加入灭活酶制备或不加酶制备,37℃反应15 min后,置沸水75 s终止反应。 冷却后加入蛇毒(10mg.ml-1) 15 μl,再温育10 min(37℃),加腺苷(25 mmol.L-1) 735 μl，然后将全部液体倒入色谱柱,用10 ml小瓶收集。待液体全部流出后,加甲酸铵(20 mmol.L-1)4 ml洗脱。收集洗脱液于同一小瓶中,另取[3H]cAMP(cGMP) 50 μl,加腺苷950 μl和甲酸胺(浓度均同上) 4 ml,作为放射活性参比管,最后从上述小瓶中各取1 ml液体至闪烁杯中,加甲苯-Triton X 100闪烁液7 ml,混合后测放射计数。
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心肌cAMP含量测定 豚鼠左心房固定于预先通95% O2+5% CO2的32℃Krebs-Henseleit液(mmol.L-1: NaCl 118, KCl 4.8, KH2PO4 1.0, MgCl2 1.2, CaCl2 1.4, NaHCO3 27.2, 葡萄糖11.1, pH 7.45)的浴糟中，给予4 ms, 1 Hz和1.5倍的阈电压场刺激以引发收缩,前负荷为1 g,平衡1 h后,加入30 μmol.L-1普萘洛尔阻断内源性儿茶酚胺的作用,待收缩力再度平衡后分别加入相应浓度和体积的Oxy，Mil和等体积的蒸馏水,待收缩力达到最大时,将心肌标本迅速放入液氮中冷却并保存,参考文献[6,7]提取并测定cAMP含量。
心肌肌浆网Ca2+-ATP酶制备及其活性测定 参照Jones方法[8]从犬心室肌提取肌浆网Ca2+-ATP酶制备。修改后测定Ca2+-ATP酶活性的方法简述如下: 测定Ca2+,Mg2+-ATP酶活性(总酶)管的反应液成分(mmol.L-1): KCl 100, MgCl2 5, CaCl2 0.05, NaN3 5, Str 0.1和Tris-HCl 50, pH 7.4，Mg2+-ATP酶管反应液成分除无Ca2+和加0.5 mmol.L-1 EGTA外,其他成分同总酶管。 酶制备0.2～0.4 mg.ml-1, 药物管加测试药物，温育10 min后,加Na2ATP 5 mmol.L-1启动反应。 以下步骤同Na+,K+-ATP酶。Ca2+-ATP酶活性=Ca2+,Mg2+-ATP酶活性-Mg2+-ATP酶活性。
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去膜心肌肌原纤维制备及其Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定 参考Alous和Paggni等[9，10]方法制备去膜心肌肌原纤维。 给狗iv戊巴比妥钠麻醉，肝素抗凝。开胸，迅速取出心脏，用冰冷的Krebs-Henseleit液洗2～3次，取左室游离壁分成数份，立即提取或置-40℃～-80℃保存。每次测定取1份，迅速剪成碎块，加匀浆液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0) 200 ml,用高速匀浆器研磨5 s×10次(1 000 r.min-1),再用Teflon匀浆器以500 r.min-1匀浆20次。组织悬液过120目筛，用A液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0, MgCl2 2.0) 1∶1稀释，12 000×g离心10 min,共3次，弃去上清液，沉淀部分置含有1%Triton X-100的A液100 ml中搅拌20 min,3 000×g离心10 min，用含1 mmol.L-1 EGTA的A液100 ml洗2次。沉淀悬浮于50 ml B液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0, MgCl2 1.0)，先后以3 000×g与12 000×g各离心15 min。最后，用B液调节制备的蛋白量至4 mg.ml-1左右。以上各步均在0～4℃下进行，pH为7.0。
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去膜心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定[9，10] 取上述制备用反应液(mmol.L-1: KCl 60,咪唑 30, MgCl2 7.5, EGTA 0～1.0, CaCl2 0～1.5。反应液中的游离Ca2+浓度，采用Robertson法的计算机程序[11]) 配成一系列pCa 8.00～5.00各管(pCa=-log Ca2+ mol.L-1)。除空白管外,各管都加制备约0.4 mg(蛋白).ml-1和不同浓度测试药物,总体积1 ml, pH 7.0, 30℃温育10 min后,加5 mmol.L-1 Na2ATP启动,10 min后加1 ml 15% TCA终止反应。测磷和计算方法同Na+,K+-ATP酶。 酶活性单位以nmolPi.mg-1(蛋白).min-1表示。
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为观察药物对收缩蛋白“Ca2+敏感性”的影响，比较药物和对照液对pCa和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性间反应曲线的影响，同时测定pCa为7.0时，药物与去膜肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性间的量效和时效关系。
统计 上述实验均用双管测定,实验数据以±s表示，组间比较用t检验。
结果
1 对Na+,K+-ATP酶活性的影响
Str对Na+,K+-ATP酶的最低有效浓度为0.1 μmol.L-1，抑制率为14.6%, IC50为2 μmol.L-1。Oxy在正性肌力作用浓度范围(0.1～100 μmol.L-1)内，不抑制Na+,K+-ATP酶活性，最低有效浓度为300 μmol.L-1，抑制率为21.1%。与Str比较，两者作用强度相差近千倍以上,显示Oxy不影响Na+,K+-ATP酶活性(图略)。
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2 对心肌PDE的影响
Mil 10 μmol.L-1 已显示抑制cAMP-PDE的作用，IC50为85 μmol.L-1, 而Oxy的浓度高至100 μmol.L-1才有抑制作用，抑制率为21.8%，300 μmol.L-1的抑制率为39.9%。两者比较，作用强度相差近10倍。它们对cGMP-PDE活性的抑制作用都很弱，Mil和Oxy 100 μmol.L-1的抑制率分别为27.5%和26.5%，300 μmol.L-1的抑制率分别为50.7%和41.0%。 两者比较经统计学处理均无差别(图略)。表明Mil选择性抑制cAMP-PDE，不抑制cGMP-PDE，与文献报道一致[12,13]。 Oxy对上述两种PDE均无抑制作用。
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3 对心肌细胞内cAMP水平的影响
对照组平均cAMP含量为0.64±0.11 pmol.mg-1，Mil 30 μmol.L-1的cAMP含量为1.11±0.19 pmol.mg-1，增加73.3%, 与对照组比较差别非常显著，表明Mil有增加胞内cAMP的作用。Oxy 30和100 μmol.L-1的cAMP含量分别为(0.68±0.13)和(0.60±0.13) pmol.mg-1，与对照组比较差别均不显著，两个浓度间比较差别也不显著，表明Oxy不影响心肌细胞内cAMP含量。
4 对心肌肌浆网Ca2+-ATP酶的影响
Oxy 100 μmol.L-1时对心肌的肌浆网Ca2+-ATP酶的抑制率为27.7%，IC50为200 μmol.L-1，提示高浓度Oxy对心肌肌浆网Ca2+-ATP酶有一定的抑制作用。
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5 对心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶的影响
本研究得到的去膜心肌肌原纤维pCa和Ca2+,Mg2+-ATP酶活性关系曲线与文献[9，10]相似。
图1显示Oxy 50 μmol.L-1使肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性和pCa曲线明显向左上方移动,而对最大酶活性的影响不显著。 图2显示pCa为7时，Oxy增强酶活性作用呈浓度依赖关系，EC5010 μmol.L-1。图3显示反应液中加入不同浓度Oxy后，温育时间与肌原纤维释放无机磷量(Ca2+,Mg2+-ATP酶活性)的时效曲线，Oxy 3,10和30 μmol.L-1 的时效曲线均显著高于对照曲线。以上3种实验结果均支持Oxy有增强收缩蛋白对Ca2+敏感性的作用。
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Fig 1 Effect of oxyphenamone at 50 μmol.L-1 on the relationship between pCa and the cardiac myofibrillar Ca2+, Mg2+-ATPase activity. ○—○ control; ●—● oxyphenamone. *P<0.05, **P<0.01 compared with the corresponding control value. ±s, n=4.
Fig 2 Concentration dependence of the effect of oxyphenamone on the activity of cardiac myofibrillar Ca2+, Mg2+-ATPase at pCa 7. **P<0.01 compared with the control value(0 mol.L-1). ±s, n=4.
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Fig 3 Time course of Pi(inorganic phosphate) liberation by cardiac myofibrils incubated with oxyphenamone 30 μmol.L-1(●—●), 10 μmol.L-1(□—□), 3 μmol.L-1 (■—■) at pCa 7. Control (○—○). ±s, n=4～7.
讨论
从豚鼠离体心肌收缩肌力实验结果可见Oxy有明显的增强心肌收缩力的作用，其最高效应为给药前的3倍，有效浓度为1～100 μmol.L-1。当前常用的强心药物有强心苷，β受体激动剂和磷酸二酯酶(PDE)抑制剂等,它们的化学结构和强心作用途径各不相同,但最终都是通过提高心肌细胞内的Ca2+浓度，增强肌原纤维收缩而加强肌力。Oxy系新化合物，它增强心肌收缩力，但不增加心率，其强心作用机理是否与上述药物不同？ 为此，我们系统研究了Oxy强心的生化药理作用并与Str和Mil等药物作了比较。
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抑制Na+,K+-ATP酶是强心苷正性肌力的主要机制。我们用经典方法从肾皮质提取得到的较纯的Na+,K+-ATP酶制备，有酶比活性高、Na+,K+-ATP酶占总酶比例高，和一次提取收获量大等优点，而其性质与心肌Na+,K+-ATP酶相同。所以，很多实验室用这种酶制备来研究强心药物。Str是该酶的特异性抑制剂，为一种常用的研究该类药物的工具药。 本文结果显示Str的IC50为2 μmol.L-1，与文献报道相符。Oxy的浓度高至300 μmol.L-1的抑制率只有21%，此浓度已超过其强心作用的浓度范围。因此，可认为Oxy的强心作用方式与Str等强心苷不同。
PDE抑制剂的种类很多，心肌的PDE又可分为3型。多数PDE抑制剂如Mil等均选择性作用第3型即依赖cAMP型(简写cAMP-PDE)，对cGMP-PDE型无抑制作用。文献采用纯化PDE制备和粗制备。前者纯化方法复杂，作者采用后者，即以同位素[3H]cAMP和[3H]cGMP为底物分别测定cAMP-PDE和cGMP-PDE活性，此方法简便易行，结果显示Mil抑制cAMP-PDE的IC50=85 μmol.L-1，介于文献用粗酶(IC50=114 μmol.L-1)[12]和纯酶(IC50=45 μmol.L-1)[13]之间,对cGMP-PDE无显著抑制作用,与文献报道相符。Oxy不抑制上述两种PDE的结果表明，Oxy的强心方式不同于PDE抑制剂。
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增强腺苷酸环化酶活性和抑制PDE活性的药物如β激动剂和PDE抑制剂均能增加cAMP含量。本研究结果显示Oxy不影响心肌cAMP含量，其强心作用似与cAMP的变化无关，再次表明Oxy既非β受体激动剂又不是PDE抑制剂。
高浓度Oxy对心肌肌浆网的Ca2+-ATP酶有轻度抑制作用，我们也发现Oxy(30 μmol.L-1)使心肌收缩静息后增强效应提高近15%(另文资料)，可推理高浓度Oxy能轻度抑制心肌肌浆网Ca2+再摄取和增加心肌肌浆网Ca2+的释放。
钙增敏剂是近年来研究强心药的热点，肌原纤维去膜Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定是研究该类药物有无“钙增敏性”的一种常用方法。Solaro等证明，药物如能使肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性增高，使酶活性-pCa曲线向左上方移动，便认为该药物有钙增敏性[14，15]。本文Oxy的结果与上述特性完全相符。作者同时比较了Oxy的几个衍生物, Mil和已知的“钙增敏剂”MCI-154, 发现有强心作用的Oxy化合物均有增敏作用而无强心作用的Oxy化合物均无钙增敏作用；100 μmol.L-1 MCI-154使曲线向左向上移动，结果与文献一致；100 μmol.L-1 Mil不影响反应曲线甚至比对照组曲线还低(另文资料)。这些结果均支持Oxy的强心作用与“钙增敏”作用相关。
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综上所述，可以认为Oxy是一种非强心苷、非β受体激动剂和非PDE抑制剂的强心药，其增强心肌收缩蛋白系统对钙离子的敏感性可能是其主要的强心作用机理。高浓度时，可能有抑制心肌肌浆网Ca2+重吸收和增加心肌肌浆网Ca2+释放的机理参与，值得进一步研究。
基金项目：国家医药管理局新药研究基金(合同号90-03); 国家自然科学基金(39170844)
Tel:(010)65296402, Fax:(010)65240529, E-mail:wanping@hns.cjfh.ac.cn
参考文献
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收稿日期：1998-04-09, http://www.100md.com
单位：叶益新 杨晓然 乔小英 陈兰兰 中国医学科学院、中国协和医科大学基础医学研究所, 北京 100005；范礼理 林勇 药物研究所，北京 100050
关键词：羟苯氨酮；钠，钾-三磷酸腺苷酶；磷酸二酯酶；钙-三磷酸腺苷酶；环-磷酸腺苷；钙增敏剂
药学学报990203 摘要 目的：研究羟苯氨酮(oxyphenamone, Oxy)强心作用的生化机理。方法：采用Na+,K+-ATP酶活性和cAMP-PDE活性、肌浆网Ca2+-ATP酶活性和cAMP含量以及心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性等测定法，研究Oxy对它们的影响，并与milrinone和MCI-154作比较。 结果：Oxy对Na+,K+-ATP酶和PDE无抑制作用，也不影响心肌cAMP含量，但能显著增强心肌肌原纤维对Ca2+的敏感性，高浓度时轻度抑制心肌肌浆网Ca2+-ATP酶活性。结论：Oxy的强心作用方式不同于强心苷、β受体激动剂和PDE抑制剂等强心药,可能为一种新的钙增敏性强心药物。
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INOTROPIC EFFECT OF OXYPHENAMONE
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Fan Lili(Fan LL) Lin Yong(Lin Y)
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ABSTRACT AIM: To investigated the biochemical mechanisms of the positive inotropic effect of oxyphenamone(Oxy). METHODS: The assays of Na+,K+-ATPase activity, cAMP dependent phosphodiesterase(cAMP-PDE) activity and Ca2+-ATPase activity in sarcoplasmic reticulum(SR) isolated from cardiac muscle, cAMP level in cardiac muscle and the cardiac myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity were adopted and compared with those of strophanthin-G(Str) and milrinone(Mil). RESULTS: Oxy at its effective concentration, showed no remarkable inhibition on Na+,K+-ATPase and cAMP dependent phosphodiesterase (cAMP-PDE) activities, while in parallel experiments Na+,K+-ATPase and cAMP-PDE activities were significantly inhibited by Str and Mil. Their IC50 values were found to be 2.0 μmol.L-1, and 85 μmol.L-1, respectively. Oxy did not affect the cAMP level in cardiac muscle of guinea pig. However, Mil at 30 μmol.L-1 in control experiments increased the cAMP level by 73.6%. These results suggest that the mechanism of the positive inotropic effect of Oxy differs from that of glycosides, PDE inhibitors and β-adrenergic agonists. Oxy at 100 μmol.L-1 inhibited Ca2+-ATPase activity significantly in cardiac sarcoplasmic reticulum. Its IC50 value was 200 μmol.L-1. The result suggests that Oxy at high concentration exerts inhibitory effect on the Ca2+ uptake by SR. This mechanism may be partly responsible for the positive inotropic effect of Oxy. Oxy at 50 μmol.L-1 shifted the relationship curve between pCa2+and myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity to the left without affecting the maximum enzyme activity. When pCa 7, Oxy increased the myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity in a concentration dependent manner and EC50 value was about 10 μmol.L-1. MCI-154 at 100 μmol.L-1 and some new derivatives of Oxy with positive inotropic effect enhanced the Ca2+ sensitivity. Mil at 100 μmol.L-1and some new derivatives of Oxy with no positive inotropic effect showed no effect at all. Solaro and Kitada found a positive correlation between the increase of myofibrillar Ca2+,Mg2+-ATPase activity and the enhancement of Ca2+ sensitivity of the contractile protein system. CONCLUSION: These results demonstrate that the biochemical mechanism of the positive inotropic effect of Oxy is different from these of the cardiac glycosides, PDE inhibitors and β-adrenergic agonists, therefore, it may be a novel cardiotonic agent, a calcium sensitizer.
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KEY WORDS oxyphenamone; Na+,K+-ATPase; phosphodiesterase; Ca2+,Mg2+-ATPase; cAMP; calcium sensitizers
羟苯氨酮(oxyphenamone, Oxy)系中国医学科学院药物研究所合成的新化合物，经离体、整体和分子水平的实验研究表明有显著的强心和扩血管作用[1,2]。为探讨Oxy强心作用的生化机理，本文研究了Oxy对Na+,K+-ATP酶、磷酸二酯酶(PDE)、cAMP含量和肌浆网Ca2+-ATP酶以及去膜心肌肌原纤维钙敏性的影响。
材料和方法
材料 羟苯氨酮由我院药物研究所合成室提供,用蒸馏水稍加温制成母液。 米利农(milrinone, Mil)由重庆医工所提供,用少量0.1 mol.L-1 HCl溶解后用碱液调至pH中性备用。毒毛旋花子甙G(strophanthin-G, Str)购自Sigma公司,用50%～60%乙醇溶解后用缓冲液稀释配成母液,乙醇的终浓度不超过1%。 上述母液的浓度均为10 mmol.L-1，实验前用缓冲液稀释至所需浓度。 3H-cAMP 购自中国原子能研究所,比活性为1028.6 GBq.mmol-1。
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Na+,K+-ATP酶制备及其活性测定[3] 用经典方法从猫肾皮质提取纯化得到较纯的Na+,K+-ATP酶制备,制备的比活性为30～40 u.mg-1(蛋白)，占总酶的(90～95)%，浓度为1 mg(蛋白).ml-1。测定酶活性的方法简述如下: 反应液成分(mmol.L-1): NaCl 100, MgCl2 5, KCl 15, EDTA 0.1 和Tris-HCl 50, pH 7.4。 酶制备约0.1 mg.ml-1, 总体积1 ml。 空白管不加酶制备,Mg2+-ATP酶管加Str 1 mmol.L-1，总酶管不加Str, 药物管加不同浓度测试药物。 37℃保温10 min后,加入Na2ATP 4 mmol.L-1启动反应。10 min后,加15%三氯醋酸(TCA)终止反应。 各管置冰浴降温10 min,离心(3 000 r.min-1,常温) 10 min取上清液1 ml, 按Bonting法[4]测释放的无机磷量。酶活性单位为μmolPi.mg-1(蛋白).h-1，总酶和Mg2+-ATP酶的差即为Na+,K+-ATP酶活性。药物对酶活性的影响按下式计算: %对照值=加药管酶活性/无药管酶活性×100。
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磷酸二酯酶(PDE)的制备及其活性测定 参考文献[5]法,取豚鼠心室肌约1 g加5倍量缓冲液(mmol.L-1: MgCl2 5, Tris-HCl 50),离心(8 000×g, 4℃) 30 min, 上清液为酶制备,置-20℃冰箱保存,用前加缓冲液稀释。
cAMP-PDE(cGAP-PDE)活性测定原理:
用QAE-Sephadex柱分离 [3H]cAMP(cGMP)和[3H]腺苷,测定[3H]腺苷的放射性,以[3H]cAMP转化成[3H]腺苷的转化率表示PDE活性。药物对酶活性的影响的计算同Na+,K+-ATP酶。测定PDE酶的方法简述如下: 反应液的成分(mmol.L-1): MgCl2 5, Tris-HCl 50, pH 7.4, [3H]cAMP(cGMP)cpm为80 000～100 000 min-1, 一定量酶制备和测试药物,总体积250 μl。 空白管加入灭活酶制备或不加酶制备,37℃反应15 min后,置沸水75 s终止反应。 冷却后加入蛇毒(10mg.ml-1) 15 μl,再温育10 min(37℃),加腺苷(25 mmol.L-1) 735 μl，然后将全部液体倒入色谱柱,用10 ml小瓶收集。待液体全部流出后,加甲酸铵(20 mmol.L-1)4 ml洗脱。收集洗脱液于同一小瓶中,另取[3H]cAMP(cGMP) 50 μl,加腺苷950 μl和甲酸胺(浓度均同上) 4 ml,作为放射活性参比管,最后从上述小瓶中各取1 ml液体至闪烁杯中,加甲苯-Triton X 100闪烁液7 ml,混合后测放射计数。
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心肌cAMP含量测定 豚鼠左心房固定于预先通95% O2+5% CO2的32℃Krebs-Henseleit液(mmol.L-1: NaCl 118, KCl 4.8, KH2PO4 1.0, MgCl2 1.2, CaCl2 1.4, NaHCO3 27.2, 葡萄糖11.1, pH 7.45)的浴糟中，给予4 ms, 1 Hz和1.5倍的阈电压场刺激以引发收缩,前负荷为1 g,平衡1 h后,加入30 μmol.L-1普萘洛尔阻断内源性儿茶酚胺的作用,待收缩力再度平衡后分别加入相应浓度和体积的Oxy，Mil和等体积的蒸馏水,待收缩力达到最大时,将心肌标本迅速放入液氮中冷却并保存,参考文献[6,7]提取并测定cAMP含量。
心肌肌浆网Ca2+-ATP酶制备及其活性测定 参照Jones方法[8]从犬心室肌提取肌浆网Ca2+-ATP酶制备。修改后测定Ca2+-ATP酶活性的方法简述如下: 测定Ca2+,Mg2+-ATP酶活性(总酶)管的反应液成分(mmol.L-1): KCl 100, MgCl2 5, CaCl2 0.05, NaN3 5, Str 0.1和Tris-HCl 50, pH 7.4，Mg2+-ATP酶管反应液成分除无Ca2+和加0.5 mmol.L-1 EGTA外,其他成分同总酶管。 酶制备0.2～0.4 mg.ml-1, 药物管加测试药物，温育10 min后,加Na2ATP 5 mmol.L-1启动反应。 以下步骤同Na+,K+-ATP酶。Ca2+-ATP酶活性=Ca2+,Mg2+-ATP酶活性-Mg2+-ATP酶活性。
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去膜心肌肌原纤维制备及其Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定 参考Alous和Paggni等[9，10]方法制备去膜心肌肌原纤维。 给狗iv戊巴比妥钠麻醉，肝素抗凝。开胸，迅速取出心脏，用冰冷的Krebs-Henseleit液洗2～3次，取左室游离壁分成数份，立即提取或置-40℃～-80℃保存。每次测定取1份，迅速剪成碎块，加匀浆液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0) 200 ml,用高速匀浆器研磨5 s×10次(1 000 r.min-1),再用Teflon匀浆器以500 r.min-1匀浆20次。组织悬液过120目筛，用A液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0, MgCl2 2.0) 1∶1稀释，12 000×g离心10 min,共3次，弃去上清液，沉淀部分置含有1%Triton X-100的A液100 ml中搅拌20 min,3 000×g离心10 min，用含1 mmol.L-1 EGTA的A液100 ml洗2次。沉淀悬浮于50 ml B液(mmol.L-1: 咪唑25.0，KCl 60.0, MgCl2 1.0)，先后以3 000×g与12 000×g各离心15 min。最后，用B液调节制备的蛋白量至4 mg.ml-1左右。以上各步均在0～4℃下进行，pH为7.0。
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去膜心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定[9，10] 取上述制备用反应液(mmol.L-1: KCl 60,咪唑 30, MgCl2 7.5, EGTA 0～1.0, CaCl2 0～1.5。反应液中的游离Ca2+浓度，采用Robertson法的计算机程序[11]) 配成一系列pCa 8.00～5.00各管(pCa=-log Ca2+ mol.L-1)。除空白管外,各管都加制备约0.4 mg(蛋白).ml-1和不同浓度测试药物,总体积1 ml, pH 7.0, 30℃温育10 min后,加5 mmol.L-1 Na2ATP启动,10 min后加1 ml 15% TCA终止反应。测磷和计算方法同Na+,K+-ATP酶。 酶活性单位以nmolPi.mg-1(蛋白).min-1表示。
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为观察药物对收缩蛋白“Ca2+敏感性”的影响，比较药物和对照液对pCa和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性间反应曲线的影响，同时测定pCa为7.0时，药物与去膜肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性间的量效和时效关系。
统计 上述实验均用双管测定,实验数据以±s表示，组间比较用t检验。
结果
1 对Na+,K+-ATP酶活性的影响
Str对Na+,K+-ATP酶的最低有效浓度为0.1 μmol.L-1，抑制率为14.6%, IC50为2 μmol.L-1。Oxy在正性肌力作用浓度范围(0.1～100 μmol.L-1)内，不抑制Na+,K+-ATP酶活性，最低有效浓度为300 μmol.L-1，抑制率为21.1%。与Str比较，两者作用强度相差近千倍以上,显示Oxy不影响Na+,K+-ATP酶活性(图略)。
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2 对心肌PDE的影响
Mil 10 μmol.L-1 已显示抑制cAMP-PDE的作用，IC50为85 μmol.L-1, 而Oxy的浓度高至100 μmol.L-1才有抑制作用，抑制率为21.8%，300 μmol.L-1的抑制率为39.9%。两者比较，作用强度相差近10倍。它们对cGMP-PDE活性的抑制作用都很弱，Mil和Oxy 100 μmol.L-1的抑制率分别为27.5%和26.5%，300 μmol.L-1的抑制率分别为50.7%和41.0%。 两者比较经统计学处理均无差别(图略)。表明Mil选择性抑制cAMP-PDE，不抑制cGMP-PDE，与文献报道一致[12,13]。 Oxy对上述两种PDE均无抑制作用。
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3 对心肌细胞内cAMP水平的影响
对照组平均cAMP含量为0.64±0.11 pmol.mg-1，Mil 30 μmol.L-1的cAMP含量为1.11±0.19 pmol.mg-1，增加73.3%, 与对照组比较差别非常显著，表明Mil有增加胞内cAMP的作用。Oxy 30和100 μmol.L-1的cAMP含量分别为(0.68±0.13)和(0.60±0.13) pmol.mg-1，与对照组比较差别均不显著，两个浓度间比较差别也不显著，表明Oxy不影响心肌细胞内cAMP含量。
4 对心肌肌浆网Ca2+-ATP酶的影响
Oxy 100 μmol.L-1时对心肌的肌浆网Ca2+-ATP酶的抑制率为27.7%，IC50为200 μmol.L-1，提示高浓度Oxy对心肌肌浆网Ca2+-ATP酶有一定的抑制作用。
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5 对心肌肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶的影响
本研究得到的去膜心肌肌原纤维pCa和Ca2+,Mg2+-ATP酶活性关系曲线与文献[9，10]相似。
图1显示Oxy 50 μmol.L-1使肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性和pCa曲线明显向左上方移动,而对最大酶活性的影响不显著。 图2显示pCa为7时，Oxy增强酶活性作用呈浓度依赖关系，EC5010 μmol.L-1。图3显示反应液中加入不同浓度Oxy后，温育时间与肌原纤维释放无机磷量(Ca2+,Mg2+-ATP酶活性)的时效曲线，Oxy 3,10和30 μmol.L-1 的时效曲线均显著高于对照曲线。以上3种实验结果均支持Oxy有增强收缩蛋白对Ca2+敏感性的作用。
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Fig 1 Effect of oxyphenamone at 50 μmol.L-1 on the relationship between pCa and the cardiac myofibrillar Ca2+, Mg2+-ATPase activity. ○—○ control; ●—● oxyphenamone. *P<0.05, **P<0.01 compared with the corresponding control value. ±s, n=4.
Fig 2 Concentration dependence of the effect of oxyphenamone on the activity of cardiac myofibrillar Ca2+, Mg2+-ATPase at pCa 7. **P<0.01 compared with the control value(0 mol.L-1). ±s, n=4.
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Fig 3 Time course of Pi(inorganic phosphate) liberation by cardiac myofibrils incubated with oxyphenamone 30 μmol.L-1(●—●), 10 μmol.L-1(□—□), 3 μmol.L-1 (■—■) at pCa 7. Control (○—○). ±s, n=4～7.
讨论
从豚鼠离体心肌收缩肌力实验结果可见Oxy有明显的增强心肌收缩力的作用，其最高效应为给药前的3倍，有效浓度为1～100 μmol.L-1。当前常用的强心药物有强心苷，β受体激动剂和磷酸二酯酶(PDE)抑制剂等,它们的化学结构和强心作用途径各不相同,但最终都是通过提高心肌细胞内的Ca2+浓度，增强肌原纤维收缩而加强肌力。Oxy系新化合物，它增强心肌收缩力，但不增加心率，其强心作用机理是否与上述药物不同？ 为此，我们系统研究了Oxy强心的生化药理作用并与Str和Mil等药物作了比较。
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抑制Na+,K+-ATP酶是强心苷正性肌力的主要机制。我们用经典方法从肾皮质提取得到的较纯的Na+,K+-ATP酶制备，有酶比活性高、Na+,K+-ATP酶占总酶比例高，和一次提取收获量大等优点，而其性质与心肌Na+,K+-ATP酶相同。所以，很多实验室用这种酶制备来研究强心药物。Str是该酶的特异性抑制剂，为一种常用的研究该类药物的工具药。 本文结果显示Str的IC50为2 μmol.L-1，与文献报道相符。Oxy的浓度高至300 μmol.L-1的抑制率只有21%，此浓度已超过其强心作用的浓度范围。因此，可认为Oxy的强心作用方式与Str等强心苷不同。
PDE抑制剂的种类很多，心肌的PDE又可分为3型。多数PDE抑制剂如Mil等均选择性作用第3型即依赖cAMP型(简写cAMP-PDE)，对cGMP-PDE型无抑制作用。文献采用纯化PDE制备和粗制备。前者纯化方法复杂，作者采用后者，即以同位素[3H]cAMP和[3H]cGMP为底物分别测定cAMP-PDE和cGMP-PDE活性，此方法简便易行，结果显示Mil抑制cAMP-PDE的IC50=85 μmol.L-1，介于文献用粗酶(IC50=114 μmol.L-1)[12]和纯酶(IC50=45 μmol.L-1)[13]之间,对cGMP-PDE无显著抑制作用,与文献报道相符。Oxy不抑制上述两种PDE的结果表明，Oxy的强心方式不同于PDE抑制剂。
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增强腺苷酸环化酶活性和抑制PDE活性的药物如β激动剂和PDE抑制剂均能增加cAMP含量。本研究结果显示Oxy不影响心肌cAMP含量，其强心作用似与cAMP的变化无关，再次表明Oxy既非β受体激动剂又不是PDE抑制剂。
高浓度Oxy对心肌肌浆网的Ca2+-ATP酶有轻度抑制作用，我们也发现Oxy(30 μmol.L-1)使心肌收缩静息后增强效应提高近15%(另文资料)，可推理高浓度Oxy能轻度抑制心肌肌浆网Ca2+再摄取和增加心肌肌浆网Ca2+的释放。
钙增敏剂是近年来研究强心药的热点，肌原纤维去膜Ca2+,Mg2+-ATP酶活性测定是研究该类药物有无“钙增敏性”的一种常用方法。Solaro等证明，药物如能使肌原纤维Ca2+,Mg2+-ATP酶活性增高，使酶活性-pCa曲线向左上方移动，便认为该药物有钙增敏性[14，15]。本文Oxy的结果与上述特性完全相符。作者同时比较了Oxy的几个衍生物, Mil和已知的“钙增敏剂”MCI-154, 发现有强心作用的Oxy化合物均有增敏作用而无强心作用的Oxy化合物均无钙增敏作用；100 μmol.L-1 MCI-154使曲线向左向上移动，结果与文献一致；100 μmol.L-1 Mil不影响反应曲线甚至比对照组曲线还低(另文资料)。这些结果均支持Oxy的强心作用与“钙增敏”作用相关。
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综上所述，可以认为Oxy是一种非强心苷、非β受体激动剂和非PDE抑制剂的强心药，其增强心肌收缩蛋白系统对钙离子的敏感性可能是其主要的强心作用机理。高浓度时，可能有抑制心肌肌浆网Ca2+重吸收和增加心肌肌浆网Ca2+释放的机理参与，值得进一步研究。
基金项目：国家医药管理局新药研究基金(合同号90-03); 国家自然科学基金(39170844)
Tel:(010)65296402, Fax:(010)65240529, E-mail:wanping@hns.cjfh.ac.cn
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收稿日期：1998-04-09, http://www.100md.com