吸烟小鼠呼吸道上皮凋亡与增殖间的关系*
作者：吴人亮 郝春荣 许三林 王 曦 李娜萍
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室， 武汉 430030
关键词：吸烟；细胞凋亡；增殖细胞核抗原；呼吸道
同济医科大学学报990206 摘要 利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色对不同阶段吸烟小鼠呼吸道粘膜上皮凋亡细胞、增殖细胞的阳性细胞率与分布进行检测，并结合电镜的形态学观察对照研究。结果：正常呼吸道粘膜上皮凋亡细胞位于表层、增殖细胞带位于基底部，而吸烟小鼠丧失了上述分布特征。小鼠吸烟4周时，呼吸道上皮凋亡细胞和增殖细胞阳性率均明显高于未吸烟正常对照组。吸烟8周时，凋亡细胞和增殖细胞阳性率与吸烟4周时相比明显减少。吸烟12周时，凋亡细胞明显增多，而增殖细胞明显减少。结论：吸烟小鼠呼吸道上皮开始不仅存在大量细胞凋亡而且出现活跃的细胞增殖，随着吸烟时间延长，呼吸道上皮以细胞凋亡占优势，呈现为细胞损伤逐渐加重而细胞再生修复能力减弱的病变特征。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R56， R392.11
The Relationship between Apoptosis and Proliferation on Epithelium
of Respiratory Tract in Smoking Mice
Wu Renliang, Hao Chunrong, Xu Sanlin et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract TUNEL technique and PCNA immuno-histochemical staining were used to examine the percentage of positive cells and distribution of apoptotic cells, proliferating cells in respiratory epithelium of smoking mice with different stages. Meanwhile, the morphological changes in the epithelial cells observed by electron microscopy were comparatively studied. The results showed that the zone of apoptotic cells located in superfices and zone of proliferating cells in base in normal mucosa of respiratory tract, but these characteristics of distribution were disappeared in smoking mice. Percentage of postive cells of apoptosis and proliferation in the respiratory epithelium after smoking for 4 weeks was significantly higher than that in normal control. After smoking for 8 weeks, it was significantly lower than that after smoking for 4 weeks. After smoking for 12 weeks apoptotic cells were increased and proliferating cells decreased significantly. It was concluded that the respiratory epithelium in smoking mice not only had large apoptosis, but also active proliferation. As the smoking time went on, the cells had highly apoptosis predominated, presenting that cellular injury was more severe and the capacity of regenerative repair was weaker.
, 百拇医药
Key words smoking; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen; respiratory tract
细胞凋亡(apoptosis)是细胞的主动死亡，它参与调节机体许多生理及病理过程，许多因素如辐射、高温、生长因子缺乏、化疗药物均能诱导细胞凋亡。近年来研究表明细胞凋亡与氧化有密切关系[1，2]，而吸烟可产生大量氧化剂[3]，吸烟引起呼吸道病变中是否也存在着细胞凋亡现象国内外尚未见报道。为此我们采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术，PCNA免疫组织化学方法、并结合电镜的形态学观察不同阶段吸烟小鼠呼吸道上皮病变中细胞凋亡、细胞增殖的特征，探讨其在呼吸道损伤过程中的变化规律。
1 材料与方法
1.1 动物香烟烟雾吸入实验
, http://www.100md.com
健康昆明种小白鼠32只，体重18～20 g(由同济医科大学实验动物学部提供)，每组8只，共分4组。其中一组不吸烟作为正常对照，余下3组做香烟烟雾吸入实验，实验用烟为市售红双喜牌过滤嘴香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支，每次燃烧4支卷烟，每支10 min，换烟时，停止吸烟5 min，每次共需1 h，每d 1次，每周6次，连续12周，分别于4周、8周和12周吸烟完毕后各处死一组动物。
1.2 电镜观察
每组取3例同一部位气管、肺组织，用30 ml/L戊二醛固定，10 g/L锇酸后固定，Epon812包埋，切成1 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位修块取气管、细支气管组织，再进一步制作超薄切片，常规醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，Opton EM 10C型透射电镜观察。
1.3 染色方法
, 百拇医药 所有标本取同一部位气管、肺组织，均用100 ml/L缓冲甲醛液固定、石蜡包埋、5 μm厚连续切片，作如下染色：(1) TUNEL染色：①切片脱蜡至水；②0.03 ml/L H2O2 甲醇阻断37 ℃、30 min；③20 mg/L蛋白酶K消化37 ℃、30 min；④取dUTP 1 μl标记液作阳性对照，加入50 μl核苷末端转移酶混合：(TUNEL)核苷酸/核苷酸转移酶滴加切片37 ℃、1 h；⑤转换POD 37 ℃、30 min；⑥DAB显色、苏木素复染细胞核，以上原位凋亡检测试剂盒为德国Boenriger Mannhein公司产品。(2) PCNA 免疫组织化学染色：一抗为北京中山生物技术有限公司购买的PCNA单克隆抗体，1∶100稀释，第二抗体和SP法采用Santa Cruz产品，染色前用微波进行抗原修复。用正常血清代一抗作阴性对照。
1.4 判断标准及数据处理
用半定量方法，将TUNEL和PCNA染色切片，分别在Olympus双目显微镜400倍放大下连续观察1000个位于气道上皮中(气管和细支气管各数500个上皮细胞)TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和PCNA阳性细胞数(增殖细胞)，换算成百分率，数据以±s表示，采用SNK软件进行配对t检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 形态学观察
正常不吸烟对照组： 电镜下气管及细支气管粘膜上皮结构完整，纤毛细胞纤毛排列整齐，其间含有刷细胞和少许杯状细胞，细胞连接紧密，未见凋亡和明显增生、肥大的上皮细胞。
吸烟组： 吸烟4周时，电镜下气管及细支气管纤毛上皮细胞纤毛倒伏、脱落、部分细胞水肿、线粒体、内质网扩张，多数上皮细胞连接松散，细胞体积缩小，细胞器密集，高尔基器及内质网扩张，细胞核染色质浓缩聚集于核膜下形成颗粒状半月形指状物、有的累及整个核而呈环状，核周间隙增宽，并有膜包裹的崩解的细胞碎片形成的凋亡小体(图1)[4]，基底细胞明显增生、肥大、上移、胞浆内细胞器、微丝较丰富、溶酶体增多(图2)。吸烟8周时，呼吸道上皮细胞排列整齐，纤毛细胞减少，无纤毛细胞、刷细胞及杯状细胞增多，上皮细胞连接未见明显改变，典型的凋亡细胞和增生肥大的上皮细胞明显减少。吸烟12周时，呼吸道上皮细胞损伤比吸烟4周时更为严重，凋亡细胞更为显著(图3)，而增生肥大的细胞减少。
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图1 吸烟小鼠4W时气管，上皮纤毛倒伏、减少，细胞连接松散，核固缩。
核周间隙增宽，左侧有膜包绕的凋亡小体形成，右下一凋亡细胞其染色质聚集于核膜下呈环状。 EM×3 500
图2 吸烟小鼠4W时气管，多个增生的基底细胞上移，胞浆内细胞器及微丝较丰富，溶酶体增多。 EM×3 500
图3 吸烟小鼠12W时气管，纤毛脱失，可见多个凋亡细胞，其细胞体积缩小，核周间隙增宽，染色质浓缩、聚集。EM×3 500
2.2 TUNEL及PCNA染色形态学特点
TUNEL阳性染色呈棕黄色，位于细胞核内，常聚集于核膜附近，PCNA阳性染色也呈棕黄色，主要位于核内。正常呼吸道粘膜TUNEL阳性细胞全部位于表层上皮中呈散在或呈簇状分布；PCNA阳性细胞则主要分布于粘膜基底部，数量较少(图4)。吸烟4周时，TUNEL阳性细胞数量明显增多，自气管、细支气管腔表层至基底部均有分布，也有簇状分布倾向；PCNA阳性细胞数量也明显增多、气道表层中最多，在核上移细胞呈强阳性着色(图5)。吸烟8周时，TUNEL阳性细胞散在分布数量明显减少，其凋亡小体呈强阳性；而PCNA阳性细胞分布异常，其数量也明显减少(图6)。吸烟12周时，TUNEL阳性细胞数量比吸烟4周时更多，分布紊乱，气道粘膜上皮有成片的强阳性细胞，其气管粘膜下、软骨组织中以及细支气管周围也可见散在分布的阳性细胞(图7)；而PCNA阳性细胞明显减少。
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图4 正常小鼠细支气管，上皮表层可见4个散在分布的凋亡细胞；(TUNEL)；
图右上显示，上皮基底部有带状排列的增生细胞(PCNA)。 SP ×200
图5 吸烟小鼠4W时气管上皮中凋亡细胞明显增多，分布紊乱(TUNEL);
图右上显示细支气管增生的上皮细胞数量明显增多，分布不规则(PCNA)。 SP ×200
图6 吸烟小鼠8W时细支气管，增生的上皮细胞上移，位于表面，数量减少。
PCNA SP ×200
图7 吸烟小鼠12W时细支气管，凋亡细胞数量明显增加，分布紊乱，其细支气管周围也可见凋亡细胞。 TUNEL ×200
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2.3 TUNEL及PCNA阳性细胞率
各组小鼠呼吸道上皮细胞凋亡与增殖阳性细胞率见附表。
附表 各组呼吸道粘膜上皮中细胞凋亡和增殖阳性细胞率(±s) 组别
例数
凋亡细胞
增殖细胞
N
8
5.232±1.411△
5.233±1.073△
S-4周
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8
24.447±2.207*
31.225±4.444*
S-8周
8
6.589±0.921△
7.289±1.502△
S-12周
8
28.946±3.717*
6.796±0.470△
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N为正常组，S为吸烟组； 与正常组比较 * P<0.01；
与吸烟4周时比较 △ P<0.01
由附表可见，吸烟4周时，呼吸道上皮中TUNEL与PCNA阳性细胞率均明显高于正常未吸烟组(P<0.01)；吸烟8周时，两者阳性细胞率下降，与正常对照组比较无差异(P>0.05)；吸烟时间延长至12周时，TUNEL阳性细胞率比吸烟4周更高，但与吸烟4周时比较无差异(P>0.05)，与正常对照组和吸烟8周时比较有显著性差异(P<0.01)，而PCNA阳性细胞率却明显减少，除与吸烟4周时比较有显著性差异外(P<0.01)，与其他各组比较无差异(P>0.05)。
3 讨 论
细胞凋亡是正常组织细胞更新的过程，是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素[5]。本文结果显示，在正常呼吸道粘膜中凋亡细胞位于粘膜表层，而增殖细胞位于粘膜基底部，这种分布特点表明呼吸道粘膜上皮自基底向表层逐渐成熟、迁移、衰老、死亡的生长规律。在吸烟小鼠呼吸道粘膜中，丧失了细胞凋亡和细胞增殖的分布特点，提示，吸烟可引起呼吸道粘膜细胞凋亡和增殖的调节紊乱。
, 百拇医药
吸烟是呼吸系统疾病的危险因子，是引起慢性阻塞性肺病主要原因，在我们以往的实验研究发现吸烟小鼠气道粘膜上皮变性、坏死和细胞再生修复的病变特征[6，7]，近来研究表明细胞凋亡与氧化有密切关系[2]，而香烟可产生大量氧化剂[3]，我们推测吸烟不仅可引起上皮细胞变性、坏死而且还存在细胞凋亡，目前对吸烟引起的细胞凋亡，尤其是吸烟引起细胞凋亡和细胞增殖的关系，国内外尚未见报道。本次实验结果发现，吸烟4周时，气道粘膜中不仅存在大量的上皮细胞凋亡，而且还出现活跃的细胞增殖，表明在吸烟早期引起细胞损伤的同时，存在着细胞再生予以修复的变化。吸烟8周时，上皮细胞损伤减轻，细胞凋亡和细胞增殖减少，炎症病变减轻，表明此时上皮处在修复后阶段。但随着时间的延长，吸烟持续12周时，呼吸道上皮细胞凋亡增加更为显著，而细胞增殖明显减少，而慢性炎症细胞浸润明显增加，表明上皮细胞损伤加重，而细胞分化、增殖、再生修复的能力减弱。
香烟中烟雾和焦油可产生大量氧自由基[3]，通过活性氧转入细胞，引起脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达，经一系列生化反应，而发生细胞凋亡[2]。吸烟引起呼吸道上皮细胞凋亡与增殖比率的变化，是机体适应自身调节的过程，随着吸烟时间延长、剂量的增加，细胞凋亡与细胞增生的平衡被破坏可能在呼吸道上皮损伤与修复病变的发生、发展中起重要作用。为此，进一步深入研究吸烟引起气道上皮细胞及肺血管平滑肌细胞凋亡与增殖及其基因调控，可为吸烟引起慢性阻塞性肺病机制作出新的解释。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(No.39570288)
作者简介：吴人亮，男，1943年生，教授
参考文献
1 Thompson C B. Apoptosis in the pathogensis and treatment of disease. Science, 1995,267:1452
2 陆 怡, 潘华珍, 许彩民. 氧化与细胞凋亡. 生物化学与生物物理进展, 1996,23(2):118
3 韩晓男, 阮英茆. 慢性阻塞性肺疾病的发病机制. 国外医学呼吸系统分册, 1997,17(3):123
4 Ferguson D J P, Anderson J T, Ultrastructural observation on cell death by apoptosis in the “resting” human breast. Virchows Arch [pathol Anat], 1981,393:193
5 Roff M C. Social controls on cell survival and cell death. Nature, 1992,356:397
6 吴人亮, 李文英, 车东媛等. 吸烟对小鼠小气道损伤的形态学研究. 同济医科大学学报, 1995,24(5):395
7 王 曦, 吴人亮, 郝春荣等. 上皮钙粘附素在吸烟小鼠呼吸道上皮细胞表达的研究. 中国组织化学与细胞化学杂志, 1998,7(3):302
收稿日期：1998-10-08, http://www.100md.com
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室， 武汉 430030
关键词：吸烟；细胞凋亡；增殖细胞核抗原；呼吸道
同济医科大学学报990206 摘要 利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色对不同阶段吸烟小鼠呼吸道粘膜上皮凋亡细胞、增殖细胞的阳性细胞率与分布进行检测，并结合电镜的形态学观察对照研究。结果：正常呼吸道粘膜上皮凋亡细胞位于表层、增殖细胞带位于基底部，而吸烟小鼠丧失了上述分布特征。小鼠吸烟4周时，呼吸道上皮凋亡细胞和增殖细胞阳性率均明显高于未吸烟正常对照组。吸烟8周时，凋亡细胞和增殖细胞阳性率与吸烟4周时相比明显减少。吸烟12周时，凋亡细胞明显增多，而增殖细胞明显减少。结论：吸烟小鼠呼吸道上皮开始不仅存在大量细胞凋亡而且出现活跃的细胞增殖，随着吸烟时间延长，呼吸道上皮以细胞凋亡占优势，呈现为细胞损伤逐渐加重而细胞再生修复能力减弱的病变特征。
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中图法分类号 R56， R392.11
The Relationship between Apoptosis and Proliferation on Epithelium
of Respiratory Tract in Smoking Mice
Wu Renliang, Hao Chunrong, Xu Sanlin et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract TUNEL technique and PCNA immuno-histochemical staining were used to examine the percentage of positive cells and distribution of apoptotic cells, proliferating cells in respiratory epithelium of smoking mice with different stages. Meanwhile, the morphological changes in the epithelial cells observed by electron microscopy were comparatively studied. The results showed that the zone of apoptotic cells located in superfices and zone of proliferating cells in base in normal mucosa of respiratory tract, but these characteristics of distribution were disappeared in smoking mice. Percentage of postive cells of apoptosis and proliferation in the respiratory epithelium after smoking for 4 weeks was significantly higher than that in normal control. After smoking for 8 weeks, it was significantly lower than that after smoking for 4 weeks. After smoking for 12 weeks apoptotic cells were increased and proliferating cells decreased significantly. It was concluded that the respiratory epithelium in smoking mice not only had large apoptosis, but also active proliferation. As the smoking time went on, the cells had highly apoptosis predominated, presenting that cellular injury was more severe and the capacity of regenerative repair was weaker.
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Key words smoking; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen; respiratory tract
细胞凋亡(apoptosis)是细胞的主动死亡，它参与调节机体许多生理及病理过程，许多因素如辐射、高温、生长因子缺乏、化疗药物均能诱导细胞凋亡。近年来研究表明细胞凋亡与氧化有密切关系[1，2]，而吸烟可产生大量氧化剂[3]，吸烟引起呼吸道病变中是否也存在着细胞凋亡现象国内外尚未见报道。为此我们采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术，PCNA免疫组织化学方法、并结合电镜的形态学观察不同阶段吸烟小鼠呼吸道上皮病变中细胞凋亡、细胞增殖的特征，探讨其在呼吸道损伤过程中的变化规律。
1 材料与方法
1.1 动物香烟烟雾吸入实验
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健康昆明种小白鼠32只，体重18～20 g(由同济医科大学实验动物学部提供)，每组8只，共分4组。其中一组不吸烟作为正常对照，余下3组做香烟烟雾吸入实验，实验用烟为市售红双喜牌过滤嘴香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支，每次燃烧4支卷烟，每支10 min，换烟时，停止吸烟5 min，每次共需1 h，每d 1次，每周6次，连续12周，分别于4周、8周和12周吸烟完毕后各处死一组动物。
1.2 电镜观察
每组取3例同一部位气管、肺组织，用30 ml/L戊二醛固定，10 g/L锇酸后固定，Epon812包埋，切成1 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位修块取气管、细支气管组织，再进一步制作超薄切片，常规醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，Opton EM 10C型透射电镜观察。
1.3 染色方法
, 百拇医药 所有标本取同一部位气管、肺组织，均用100 ml/L缓冲甲醛液固定、石蜡包埋、5 μm厚连续切片，作如下染色：(1) TUNEL染色：①切片脱蜡至水；②0.03 ml/L H2O2 甲醇阻断37 ℃、30 min；③20 mg/L蛋白酶K消化37 ℃、30 min；④取dUTP 1 μl标记液作阳性对照，加入50 μl核苷末端转移酶混合：(TUNEL)核苷酸/核苷酸转移酶滴加切片37 ℃、1 h；⑤转换POD 37 ℃、30 min；⑥DAB显色、苏木素复染细胞核，以上原位凋亡检测试剂盒为德国Boenriger Mannhein公司产品。(2) PCNA 免疫组织化学染色：一抗为北京中山生物技术有限公司购买的PCNA单克隆抗体，1∶100稀释，第二抗体和SP法采用Santa Cruz产品，染色前用微波进行抗原修复。用正常血清代一抗作阴性对照。
1.4 判断标准及数据处理
用半定量方法，将TUNEL和PCNA染色切片，分别在Olympus双目显微镜400倍放大下连续观察1000个位于气道上皮中(气管和细支气管各数500个上皮细胞)TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和PCNA阳性细胞数(增殖细胞)，换算成百分率，数据以±s表示，采用SNK软件进行配对t检验。
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2 结 果
2.1 形态学观察
正常不吸烟对照组： 电镜下气管及细支气管粘膜上皮结构完整，纤毛细胞纤毛排列整齐，其间含有刷细胞和少许杯状细胞，细胞连接紧密，未见凋亡和明显增生、肥大的上皮细胞。
吸烟组： 吸烟4周时，电镜下气管及细支气管纤毛上皮细胞纤毛倒伏、脱落、部分细胞水肿、线粒体、内质网扩张，多数上皮细胞连接松散，细胞体积缩小，细胞器密集，高尔基器及内质网扩张，细胞核染色质浓缩聚集于核膜下形成颗粒状半月形指状物、有的累及整个核而呈环状，核周间隙增宽，并有膜包裹的崩解的细胞碎片形成的凋亡小体(图1)[4]，基底细胞明显增生、肥大、上移、胞浆内细胞器、微丝较丰富、溶酶体增多(图2)。吸烟8周时，呼吸道上皮细胞排列整齐，纤毛细胞减少，无纤毛细胞、刷细胞及杯状细胞增多，上皮细胞连接未见明显改变，典型的凋亡细胞和增生肥大的上皮细胞明显减少。吸烟12周时，呼吸道上皮细胞损伤比吸烟4周时更为严重，凋亡细胞更为显著(图3)，而增生肥大的细胞减少。
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图1 吸烟小鼠4W时气管，上皮纤毛倒伏、减少，细胞连接松散，核固缩。
核周间隙增宽，左侧有膜包绕的凋亡小体形成，右下一凋亡细胞其染色质聚集于核膜下呈环状。 EM×3 500
图2 吸烟小鼠4W时气管，多个增生的基底细胞上移，胞浆内细胞器及微丝较丰富，溶酶体增多。 EM×3 500
图3 吸烟小鼠12W时气管，纤毛脱失，可见多个凋亡细胞，其细胞体积缩小，核周间隙增宽，染色质浓缩、聚集。EM×3 500
2.2 TUNEL及PCNA染色形态学特点
TUNEL阳性染色呈棕黄色，位于细胞核内，常聚集于核膜附近，PCNA阳性染色也呈棕黄色，主要位于核内。正常呼吸道粘膜TUNEL阳性细胞全部位于表层上皮中呈散在或呈簇状分布；PCNA阳性细胞则主要分布于粘膜基底部，数量较少(图4)。吸烟4周时，TUNEL阳性细胞数量明显增多，自气管、细支气管腔表层至基底部均有分布，也有簇状分布倾向；PCNA阳性细胞数量也明显增多、气道表层中最多，在核上移细胞呈强阳性着色(图5)。吸烟8周时，TUNEL阳性细胞散在分布数量明显减少，其凋亡小体呈强阳性；而PCNA阳性细胞分布异常，其数量也明显减少(图6)。吸烟12周时，TUNEL阳性细胞数量比吸烟4周时更多，分布紊乱，气道粘膜上皮有成片的强阳性细胞，其气管粘膜下、软骨组织中以及细支气管周围也可见散在分布的阳性细胞(图7)；而PCNA阳性细胞明显减少。
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图4 正常小鼠细支气管，上皮表层可见4个散在分布的凋亡细胞；(TUNEL)；
图右上显示，上皮基底部有带状排列的增生细胞(PCNA)。 SP ×200
图5 吸烟小鼠4W时气管上皮中凋亡细胞明显增多，分布紊乱(TUNEL);
图右上显示细支气管增生的上皮细胞数量明显增多，分布不规则(PCNA)。 SP ×200
图6 吸烟小鼠8W时细支气管，增生的上皮细胞上移，位于表面，数量减少。
PCNA SP ×200
图7 吸烟小鼠12W时细支气管，凋亡细胞数量明显增加，分布紊乱，其细支气管周围也可见凋亡细胞。 TUNEL ×200
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2.3 TUNEL及PCNA阳性细胞率
各组小鼠呼吸道上皮细胞凋亡与增殖阳性细胞率见附表。
附表 各组呼吸道粘膜上皮中细胞凋亡和增殖阳性细胞率(±s) 组别
例数
凋亡细胞
增殖细胞
N
8
5.232±1.411△
5.233±1.073△
S-4周
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8
24.447±2.207*
31.225±4.444*
S-8周
8
6.589±0.921△
7.289±1.502△
S-12周
8
28.946±3.717*
6.796±0.470△
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N为正常组，S为吸烟组； 与正常组比较 * P<0.01；
与吸烟4周时比较 △ P<0.01
由附表可见，吸烟4周时，呼吸道上皮中TUNEL与PCNA阳性细胞率均明显高于正常未吸烟组(P<0.01)；吸烟8周时，两者阳性细胞率下降，与正常对照组比较无差异(P>0.05)；吸烟时间延长至12周时，TUNEL阳性细胞率比吸烟4周更高，但与吸烟4周时比较无差异(P>0.05)，与正常对照组和吸烟8周时比较有显著性差异(P<0.01)，而PCNA阳性细胞率却明显减少，除与吸烟4周时比较有显著性差异外(P<0.01)，与其他各组比较无差异(P>0.05)。
3 讨 论
细胞凋亡是正常组织细胞更新的过程，是同增殖、分化机制一起共同维持机体内环境稳定的重要因素[5]。本文结果显示，在正常呼吸道粘膜中凋亡细胞位于粘膜表层，而增殖细胞位于粘膜基底部，这种分布特点表明呼吸道粘膜上皮自基底向表层逐渐成熟、迁移、衰老、死亡的生长规律。在吸烟小鼠呼吸道粘膜中，丧失了细胞凋亡和细胞增殖的分布特点，提示，吸烟可引起呼吸道粘膜细胞凋亡和增殖的调节紊乱。
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吸烟是呼吸系统疾病的危险因子，是引起慢性阻塞性肺病主要原因，在我们以往的实验研究发现吸烟小鼠气道粘膜上皮变性、坏死和细胞再生修复的病变特征[6，7]，近来研究表明细胞凋亡与氧化有密切关系[2]，而香烟可产生大量氧化剂[3]，我们推测吸烟不仅可引起上皮细胞变性、坏死而且还存在细胞凋亡，目前对吸烟引起的细胞凋亡，尤其是吸烟引起细胞凋亡和细胞增殖的关系，国内外尚未见报道。本次实验结果发现，吸烟4周时，气道粘膜中不仅存在大量的上皮细胞凋亡，而且还出现活跃的细胞增殖，表明在吸烟早期引起细胞损伤的同时，存在着细胞再生予以修复的变化。吸烟8周时，上皮细胞损伤减轻，细胞凋亡和细胞增殖减少，炎症病变减轻，表明此时上皮处在修复后阶段。但随着时间的延长，吸烟持续12周时，呼吸道上皮细胞凋亡增加更为显著，而细胞增殖明显减少，而慢性炎症细胞浸润明显增加，表明上皮细胞损伤加重，而细胞分化、增殖、再生修复的能力减弱。
香烟中烟雾和焦油可产生大量氧自由基[3]，通过活性氧转入细胞，引起脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达，经一系列生化反应，而发生细胞凋亡[2]。吸烟引起呼吸道上皮细胞凋亡与增殖比率的变化，是机体适应自身调节的过程，随着吸烟时间延长、剂量的增加，细胞凋亡与细胞增生的平衡被破坏可能在呼吸道上皮损伤与修复病变的发生、发展中起重要作用。为此，进一步深入研究吸烟引起气道上皮细胞及肺血管平滑肌细胞凋亡与增殖及其基因调控，可为吸烟引起慢性阻塞性肺病机制作出新的解释。
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*国家自然科学基金资助项目(No.39570288)
作者简介：吴人亮，男，1943年生，教授
参考文献
1 Thompson C B. Apoptosis in the pathogensis and treatment of disease. Science, 1995,267:1452
2 陆 怡, 潘华珍, 许彩民. 氧化与细胞凋亡. 生物化学与生物物理进展, 1996,23(2):118
3 韩晓男, 阮英茆. 慢性阻塞性肺疾病的发病机制. 国外医学呼吸系统分册, 1997,17(3):123
4 Ferguson D J P, Anderson J T, Ultrastructural observation on cell death by apoptosis in the “resting” human breast. Virchows Arch [pathol Anat], 1981,393:193
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收稿日期：1998-10-08, http://www.100md.com