谷氨酰胺和盲肠造口/结肠灌洗对猪急性重症胰腺炎后肠源性细菌/内毒素易位的影响
作者：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国 邵海峰 肖光夏 黎 鳌
单位：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国1 邵海峰 南京军区南京总医院； 屠伟峰 黎 鳌 肖光夏 三军医大学西南医院全军烧伤研究所 重庆市 400038
关键词：胰腺炎；谷氨酰胺；内毒素；细菌易位
世界华人消化杂志990216 中国图书资料分类号 R576
摘 要
目的 观察静脉内滴注谷氨酰胺(Gln)对急性重症胰腺炎(ASP)后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用.
方法 选健康长白种猪27头，体重17kg～22kg，雌雄不限，随机分为5组. 组Ⅰ：假手术对照组(n=5)；组Ⅱ：ASP对照组(n=5)；组Ⅲ：ASP+甘氨酸(Gly)组(n=5)；组Ⅳ：ASP+Gln组(n=6)；组Ⅴ：ASP+Gln+盲肠造口、结肠灌洗组(n=6). 在麻醉状态下，进腹向胰总管内注入1mL/kg 50g/L牛磺胆酸钠混合液〔内含胰蛋白酶(8～10)×106 BAEEU/L，pH 7.6〕诱导ASP. 以9g/L NaCl磷酸盐缓冲液取代50g/L牛磺胆酸钠混合液即为假手术对照组. 采集腔静脉血作内毒素测定(鲎试剂法). ASP后72h，采集门、腔静脉血作系列细菌定量培养和细菌鉴定. 然后推注100g/L氯化钾20mL处死后立即进胸腹取大小肠系膜淋巴结、肺组织、肺门淋巴结、胰腺组织，称重后研磨成组织匀浆，并作细菌定量培养和细菌鉴定.
, 百拇医药
结果 静脉内直接输注Gln后可使血浆中Gln浓度较组Ⅰ、组Ⅱ明显升高(P均<0.01). 静脉内Gln支持或Gln+盲肠造口、结肠灌洗均可明显降低血浆内毒素水平，且使血液和组织器官中易位的细菌数量均出现非常显著的下降.
结论 静脉内Gln支持可显著地升高血浆Gln水平. 同时可显著地减轻ASP后肠源性细菌/内毒素易位.
Influence of glutamine and
caecostomy/colonic irrigation on
gut bacteria/endotoxin translocation
in acute severe pancreatitis in pigs
, 百拇医药
TU Wei-Feng1,2， LI Jie-Sou1, ZHU Wei-Ming1, LI Zheng-Da1, LIU Fang-Nan1, CHEN Yong-Ming1, XU Jian-Guo1, SHAO Hai-Feng1, XIAO Guang-Xia2 and LI Ao2
Subject headings pancreatitis; glutamine; endotoxins; bacterial translocation
Abstract
AIM To observe the protection of intravenous glutamine (Gln) on gut-originated bacteria/endotoxin translocation following acute severe pancreatitis (ASP) induced by sodium taurocholate.
, http://www.100md.com
METHODS Twenty seven pigs weighing 17kg-22kg, were divided into five groups. Group Ⅰ (n=5): sham-control; Group Ⅱ (n=5): ASP-control; Group Ⅲ (n=5): ASP+glycine (Gly); Group Ⅳ (n=6): ASP+Gln; Group Ⅴ (n=6): ASP+Gln+caecostomy/colonic irrigation. Anesthesized pigs were infected with 1mL/kg of combined solution of 50g/L sodium taurocholate and (8-10)×106 BAEE units trypsin/L by injection via pancreatic duct. Plasma glutamine were measured by the high performance liquid-phase technique (the product of Waters, U.S.). Systemic plasma endotoxin levels was quantitated by the chromogenic limulus amebocyte lysate (LAL) technique. Both portal and systemic blood samples were obtained before and 72 hours following ASP and cultured for aerobic as well as anaerobic bacterial growth. Subsequently, All pigs were sacrificed by injecting 20mL of 100g/L KCl intravenously. Tissue specimens from mesenteriolum and mesocolon lymph nodes, lung, pulmonary portal lymph nodes and pancreas were removed, weighed and homogenized in grinding tubes. Aliquots of the homogenate were cultured as mentioned above. Positive specimens were subcultured and the bacteria identified by standard procedure.
, http://www.100md.com
RESULTS Intravenous glutamine could effectively prevent the decrease of plasma glutamine levels following acute severe pancreatitis. Both intravenous glutamine and intravenous glutamine + caecostomy/colonic irrigation reduced significantly the levels of plasma endotoxin and the magnitude of bacteria translocation to the portal and systemic blood and remote organs.
CONCLUSION Intravenous glutamine support can enhance plasma glutamine concentrations. Both intravenous glutamine and intravenous glutamine + caecostomy/colonic irrigation can effectively decrease gut-originated bacteria/endotoxin translocation.
, 百拇医药
0 引言
肠道细菌和内毒素易位是导致急性重症胰腺炎(ASP)并发感染和脓毒症致死亡率居高不下的重要原因[1-3]. 肠道内外给予谷氨酰胺(Gln)具有增加肠粘膜厚度和蛋白质、增强粘膜屏障功能、降低肠道内细菌/内毒素易位的作用，从而明显降低和减轻大面积烧伤、重症胰腺炎、重症监护患者继发感染的发生率和严重程度[4-7]. 但由于Gln极不稳定，遇热易降解并释放聚谷氨酸等毒性物质，难以常规配制在TPN制剂中供临床使用. 我们使用日本进口的高纯度(99.0%) Gln粉制备成粉剂供猪试用，以观察Gln对ASP后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用.
1 材料和方法
1.1 动物分组 ①健康长白种猪27头(由南京军区动物实验中心提供)，体重17kg～22kg，雌雄不限，随机分为5组：组Ⅰ：假手术对照组(n=5)，组Ⅱ：胰腺炎组(n=5)；组Ⅲ：胰腺炎+甘氨酸(Gly)组(n=5)，组Ⅳ：胰腺炎+Gln组(n=6)，组Ⅴ：胰腺炎+Gln+盲肠造口/结肠灌洗组(n=6). ②Gln粉剂的制备、鉴定和投给方法：日本进口的高纯度(99.0%)Gln粉在无菌条件下分装成0.5g,1g,2g,2.5g，经60Co辐照后备用. 随机取5份60Co辐照后的Gln经系列真菌、细菌培养和致热原试验证实均为阴性，可供静脉内使用(此项工作由我院药剂制剂科和微生物科协助完成). Gln用量按总氮量0.56g.kg-1.d-1的25%提供，即0.74g.kg-1.d-1. Gln或Gly在成功诱导ASP后6h开始使用. Gln在临用前15min以9g/L NaCl溶解并配成20g/L浓度，经上腔静脉均匀输入(约需1h左右，1次/8h). 以等氮量Gly作为Gln对照组.
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1.2 方法 ①急性重症胰腺炎的诱导：无菌条件下，正中腹直肌切口进腹，暴露胰十二指肠，在胰管开口对侧切一纵型小切口(约1.5cm～ 2.5cm). 仔细暴露胰管开口处，并放置直径为1mm的聚氯乙烯导管，深约3cm～5cm，并暂时结扎胰管，逆行在4kPa压力下缓慢地注入50g/L牛磺胆酸钠混合液〔内含胰蛋白酶(8～10)×106 BAEE U/L，pH 7.6,牛磺胆酸钠和胰蛋白酶均为Sigma产品〕. 10min后拔除胰管内导管. 以9g/L缓冲生理盐水(pH 7.6)取代50g/L牛磺胆酸钠混合液即为对照组. 然后，依次缝合胰十二指肠和腹壁. 液体在手术期间及手术后8h以内按250mL/kg输入，以后按(125±25)mL/kg，交替使用100g/L葡萄糖注射液和复方乳酸林格氏液. ②Gln+盲肠造口/结肠灌洗组：先在诱导ASP前，取右下腹斜切口，进腹后取出盲肠，周围用盐水纱布保护，用1号线在盲肠前结肠带处做两个同心荷包缝合，彼此相距1cm，在荷包缝合中央切一小口，并插入一根蕈状导管，结扎第1荷包缝线，剪去线尾，作第2荷包缝合时，使盲肠壁内翻. 再将线尾穿过腹膜后打结，使盲壁固定于腹膜上，造口管从腹壁切口引出，逐层缝合腹壁切口，并将导管固定于皮肤上. 在诱导ASP后6h静脉内输注Gln同时，开始进行结肠灌洗，逆向自盲肠造口导管灌入(重力法)生理盐水2000mL，1次/2h，直至结肠流出液澄清无残渣后，改为1次/8h，每次500mL～1000mL，以洗去自小肠流入结肠的肠内容物，来确保结肠灌洗的效果. ③观察指标和方法：每日注意猪的全身情况，包括血压、脉搏、呼吸、体温、动静脉血气分析、白细胞计数，以及厌食、嗜睡或烦燥和留置导尿管记24h尿量等. 分别于ASP诱导前30min(T0)，ASP诱导后、6h(T1)，24h(T2)，48h(T3)，72h(T4)采集腔静脉血样本以测定血浆内毒素(采用上海医化所内毒素定量测定试剂盒)和Gln水平(采用美国Waters公司生产的高效液相色谱仪测定). 72h时点同时采集门静脉血作细菌定量培养，并按常规作细菌学鉴定. ASP后72h，存活的猪用100g/L KCl处死(0.1～0.2)g/kg，在无菌条件下剖胸腹取肺组织、肺门淋巴结、大小肠系膜淋巴结、胰腺组织作细菌学定量培养和常规细菌学鉴定. 在上述采样过程中所涉及到的任何器具均经去热原处理和高压灭菌消毒.
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统计学处理 所列计量资料均采用均数±标准差表示，应用统计软件包stat 5.0作方差分析、Newman-Keuls'检验和t检验.
2 结果
2.1 血浆Gln 组Ⅱ和组Ⅲ血浆Gln在诱导ASP后均出现较明显的下降，ASP后24，48和72h时点血浆Gln与正常对照组比较均有非常显著的统计学差别(P均<0.01). 静脉内Gln支持后，在ASP后24，48，72h个时点血浆Gln均较组Ⅱ和组Ⅲ有非常显著的上升(表1和图1)，但组Ⅳ和组Ⅴ两组间无明显统计学差别.
2.2 血浆内毒素的变化 组Ⅲ血浆内毒素的变化与组Ⅱ基本一致，两组间比较无明显统计学差别. 静脉内Gln支持或Gln支持+结肠灌洗均可使血浆内毒素水平大幅度降低，T2，T3和T4三个时点的血浆内毒素水平较组Ⅱ和组Ⅲ均有非常显著的统计学差别(P<0.01，表2). 组Ⅴ在治疗72h后的血浆内毒素水平又要明显低于组Ⅳ(P<0.01).
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2.3 血和组织细菌培养结果 ASP诱导后72h，在小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结均可培养出致病菌，以革氏阴性杆菌为主，绝大部分为肠道常驻菌. 静脉内给予Gln支持或Gln支持+盲肠造口/结肠灌洗均可大幅度减少小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结等部位易位细菌的数量(表3).
表1 ASP猪血浆谷氨酰胺的变化 (±s，μmol/L) 组别
T0
T2
T3
T4
组Ⅰ
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396±58
286±46
316±45
303±52
组Ⅱ
363±101
181±73b
205±53b
183±21b
组Ⅲ
378±99
179±61b
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188±48b
176±24b
组Ⅳ
364±65
337±77adf
378±96adf
323±85df
组Ⅴ
370±119
339±65adf
369±10adf
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324±95df
aP<0.05，bP<0.01，vs 组Ⅰ；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
表2 ASP猪血浆内毒素的变化 (±s，EU/L) 组别
T0
T1
T2
T3
T4
组Ⅱ
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0.48±0.12
1.88±0.74b
2.69±0.91b
3.91±1.21b
2.61±0.25b
组Ⅲ
0.54±0.12
1.80±0.86b
2.52±0.65b
3.47±0.31b
, 百拇医药
2.48±0.19b
组Ⅳ
0.51±0.10
1.99±0.82b
1.63±0.38bdf
2.15±0.69bdf
2.18±0.51bdf
组Ⅴ
0.51±0.10
1.62±0.22b
, 百拇医药
1.50±0.54bdf
2.07±0.71bdf
1.79±0.61abdf
aP<0.05，vs 组Ⅳ；bP<0.01，vs T0；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
表3 ASP猪血和组织细菌培养结果 〔x±s,108 CFU/L (kg)〕 组别
静脉血
肺组织
肺门淋巴结
, 百拇医药
胰腺
门脉血
小肠淋巴结
大肠淋巴结
组Ⅰ
0
0
0
0
0
0
0
组Ⅱ
11.37±6.31b
, 百拇医药
45.06±20.40b
31.68±37.49b
66.00±12.43b
14.94±4.25b
48.67±10.78b
36.34±22.37b
组Ⅲ
10.51±7.54b
25.50±20.20b
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29.33±25.77b
58.36±34.19b
14.09±2.65b
49.72±8.73b
34.67±21.19b
组Ⅳ
0.01±0.01df
2.01±3.09adf
0.30±0.38adf
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25.03±26.70bdf
0.41±0.30adf
0.57±0.89adf
0.05±0.03df
组Ⅴ
0.07±0.10df
8.73±9.03bdf
8.86±12.52bdf
5.83±1.29bdf
, 百拇医药
0.11±0.10df
0.22±0.23adf
0.26±0.21adf
aP<0.05，bP<0.01，vs 组Ⅰ；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
3 讨论
近年研究显示，胰腺炎后肠道功能受损、肠道屏障功能下降、肠道内微生态环境和正常菌群失调，引起肠道内细菌和内毒素向邻近组织和肠道外组织易位，导致肠源性菌血症和内毒素血症甚至脓毒症是造成重症胰腺炎死亡率和后期并发症如SIRS，ARDS，MODS居高不下的重要原因[1,8-10]. Runkel et al[1]观察结果显示，诱导AP后48，96h肠系膜淋巴结细菌易位发生率均为100%，提示诱导AP 48h之内早有肠源性细菌易位的发生. 本结果证实ASP可诱发肠源性细菌的易位，且ASP后72h易位至肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺脏器和肺门淋巴结的细菌数量均很大. 已有资料表明Gln支持(无论是肠道内还是肠道外)在肠粘膜屏障功能、改善肠道内微生态环境和预防肠源性细菌和内毒素易位起着非常重要的作用[6,7,10,11].
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本结果显示，ASP可引起血浆Gln水平明显下降，组Ⅱ和组Ⅲ猪血浆Gln水平在ASP后3d均明显低于ASP诱导前或假手术对照组同时点Gln水平，约为ASP诱导前的45%～55%. 而Gln不仅是快速生长和分化的肠粘膜上皮细胞的重要氧化燃料和能量合成底物，也是维持肠粘膜结构、粘膜屏障功能、肠道免疫功能和微生态环境的重要调节因子. 如果体内Gln缺乏，则可引起肠粘膜萎缩，屏障功能减弱，sIgA分泌减少，肠道内菌群失调，导致肠道内细菌/内毒素易位. 我们推测ASP后早期就出现细菌/内毒素易位不仅与ASP后中性粒细胞、炎性递质、细胞因子、蛋白水解酶如弹性蛋白酶、磷脂酶A2、缺血/再灌注损伤等介导肠粘膜结构和屏障功能损伤有关，可能与ASP后血浆Gln水平低下也密切相关. 本结果发现，静脉内输注Gln不仅可显著提高血浆Gln水平，而且使血浆内毒素水平明显下降、易位至门脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量显著降低，证实ASP后血浆Gln水平下降是ASP后细菌/内毒素易位的重要原因之一. 我们将自己研制的Gln粉剂成功地应用于小肠移植患者，也取得了较为满意的疗效[12]. 结果提示Gln在减轻胰腺炎后的肠道粘膜损伤、维持胰腺炎后的肠道正常内菌群、降低胰腺炎后的肠道内细菌和内毒素易位、减少ASP期间肠源性菌血症、内毒素血症、脓毒症甚至ARDS和MODS发生率中可能起着积极的作用.
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Sulkowski et al[13]和Tarpila et al[2]均在1993年分别报道了早期盲肠造口和结肠灌洗在预防鼠ASP后早期肠源性细菌易位的作用，结果显示早期盲肠造口和结肠灌洗不仅可使ASP后高浓度的血浆内毒素水平明显下降，易位至肠系膜淋巴结、血液和远离脏器肠源性细菌阳性率明显下降，而且ASP鼠的晚期死亡率亦呈明显下降，提示盲肠造口和结肠灌洗在改善鼠ASP的预后，降低肠源性细菌易位、菌血症甚至脓毒症及死亡率起着积极的作用. 因此，我们在静脉内输注Gln同时，观察了盲肠造口/结肠灌洗对ASP后细菌/内毒素易位的影响，结果显示，Gln+盲肠造口/结肠灌洗降低血浆内毒素水平和减少易位至门脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量又要明显好于单纯静脉内输注Gln组，这对临床上成功救治ASP患者、预防和减少ASP后感染并发症和多脏器功能障碍具有极为重要的理论指导意义.
作者简介:屠伟峰，男，1961-04-22生，浙江省余姚市人，汉族. 1984年南京军区军医学校医疗大专毕业，1991年南京医科大学硕士，1997年第二军医大学博士，现在第三军医大学西南医院全军烧伤研究所博士后流动站作博士后研究工作，主治医师，主要从事麻醉学、复苏和危重医学的临床和研究，发表论文20篇.
, 百拇医药
通讯作者 屠伟峰，400038，重庆市高滩岩第三军医大学西南医院全军烧伤研究所.
Correspondence to:TU Wei-Feng, M.D. & Ph.D. Institute of Burn Research, Southwestern Hospital, the Third Military Medical University, Gao Tan Yan, Chongqing, 400038, China
Tel. +86.23.68754125, Fax. +86.23.68754125
E-mail. Wftuyx@public. cta. cq. cn
4 参考文献
, 百拇医药
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收稿日期 1998-08-04 修回日期 1998-11-17, http://www.100md.com
单位：屠伟峰 黎介寿 朱维铭 李珍大 刘放南 陈永明 徐建国1 邵海峰 南京军区南京总医院； 屠伟峰 黎 鳌 肖光夏 三军医大学西南医院全军烧伤研究所 重庆市 400038
关键词：胰腺炎；谷氨酰胺；内毒素；细菌易位
世界华人消化杂志990216 中国图书资料分类号 R576
摘 要
目的 观察静脉内滴注谷氨酰胺(Gln)对急性重症胰腺炎(ASP)后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用.
方法 选健康长白种猪27头，体重17kg～22kg，雌雄不限，随机分为5组. 组Ⅰ：假手术对照组(n=5)；组Ⅱ：ASP对照组(n=5)；组Ⅲ：ASP+甘氨酸(Gly)组(n=5)；组Ⅳ：ASP+Gln组(n=6)；组Ⅴ：ASP+Gln+盲肠造口、结肠灌洗组(n=6). 在麻醉状态下，进腹向胰总管内注入1mL/kg 50g/L牛磺胆酸钠混合液〔内含胰蛋白酶(8～10)×106 BAEEU/L，pH 7.6〕诱导ASP. 以9g/L NaCl磷酸盐缓冲液取代50g/L牛磺胆酸钠混合液即为假手术对照组. 采集腔静脉血作内毒素测定(鲎试剂法). ASP后72h，采集门、腔静脉血作系列细菌定量培养和细菌鉴定. 然后推注100g/L氯化钾20mL处死后立即进胸腹取大小肠系膜淋巴结、肺组织、肺门淋巴结、胰腺组织，称重后研磨成组织匀浆，并作细菌定量培养和细菌鉴定.
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结果 静脉内直接输注Gln后可使血浆中Gln浓度较组Ⅰ、组Ⅱ明显升高(P均<0.01). 静脉内Gln支持或Gln+盲肠造口、结肠灌洗均可明显降低血浆内毒素水平，且使血液和组织器官中易位的细菌数量均出现非常显著的下降.
结论 静脉内Gln支持可显著地升高血浆Gln水平. 同时可显著地减轻ASP后肠源性细菌/内毒素易位.
Influence of glutamine and
caecostomy/colonic irrigation on
gut bacteria/endotoxin translocation
in acute severe pancreatitis in pigs
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TU Wei-Feng1,2， LI Jie-Sou1, ZHU Wei-Ming1, LI Zheng-Da1, LIU Fang-Nan1, CHEN Yong-Ming1, XU Jian-Guo1, SHAO Hai-Feng1, XIAO Guang-Xia2 and LI Ao2
Subject headings pancreatitis; glutamine; endotoxins; bacterial translocation
Abstract
AIM To observe the protection of intravenous glutamine (Gln) on gut-originated bacteria/endotoxin translocation following acute severe pancreatitis (ASP) induced by sodium taurocholate.
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METHODS Twenty seven pigs weighing 17kg-22kg, were divided into five groups. Group Ⅰ (n=5): sham-control; Group Ⅱ (n=5): ASP-control; Group Ⅲ (n=5): ASP+glycine (Gly); Group Ⅳ (n=6): ASP+Gln; Group Ⅴ (n=6): ASP+Gln+caecostomy/colonic irrigation. Anesthesized pigs were infected with 1mL/kg of combined solution of 50g/L sodium taurocholate and (8-10)×106 BAEE units trypsin/L by injection via pancreatic duct. Plasma glutamine were measured by the high performance liquid-phase technique (the product of Waters, U.S.). Systemic plasma endotoxin levels was quantitated by the chromogenic limulus amebocyte lysate (LAL) technique. Both portal and systemic blood samples were obtained before and 72 hours following ASP and cultured for aerobic as well as anaerobic bacterial growth. Subsequently, All pigs were sacrificed by injecting 20mL of 100g/L KCl intravenously. Tissue specimens from mesenteriolum and mesocolon lymph nodes, lung, pulmonary portal lymph nodes and pancreas were removed, weighed and homogenized in grinding tubes. Aliquots of the homogenate were cultured as mentioned above. Positive specimens were subcultured and the bacteria identified by standard procedure.
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RESULTS Intravenous glutamine could effectively prevent the decrease of plasma glutamine levels following acute severe pancreatitis. Both intravenous glutamine and intravenous glutamine + caecostomy/colonic irrigation reduced significantly the levels of plasma endotoxin and the magnitude of bacteria translocation to the portal and systemic blood and remote organs.
CONCLUSION Intravenous glutamine support can enhance plasma glutamine concentrations. Both intravenous glutamine and intravenous glutamine + caecostomy/colonic irrigation can effectively decrease gut-originated bacteria/endotoxin translocation.
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0 引言
肠道细菌和内毒素易位是导致急性重症胰腺炎(ASP)并发感染和脓毒症致死亡率居高不下的重要原因[1-3]. 肠道内外给予谷氨酰胺(Gln)具有增加肠粘膜厚度和蛋白质、增强粘膜屏障功能、降低肠道内细菌/内毒素易位的作用，从而明显降低和减轻大面积烧伤、重症胰腺炎、重症监护患者继发感染的发生率和严重程度[4-7]. 但由于Gln极不稳定，遇热易降解并释放聚谷氨酸等毒性物质，难以常规配制在TPN制剂中供临床使用. 我们使用日本进口的高纯度(99.0%) Gln粉制备成粉剂供猪试用，以观察Gln对ASP后肠源性细菌/内毒素易位的保护作用.
1 材料和方法
1.1 动物分组 ①健康长白种猪27头(由南京军区动物实验中心提供)，体重17kg～22kg，雌雄不限，随机分为5组：组Ⅰ：假手术对照组(n=5)，组Ⅱ：胰腺炎组(n=5)；组Ⅲ：胰腺炎+甘氨酸(Gly)组(n=5)，组Ⅳ：胰腺炎+Gln组(n=6)，组Ⅴ：胰腺炎+Gln+盲肠造口/结肠灌洗组(n=6). ②Gln粉剂的制备、鉴定和投给方法：日本进口的高纯度(99.0%)Gln粉在无菌条件下分装成0.5g,1g,2g,2.5g，经60Co辐照后备用. 随机取5份60Co辐照后的Gln经系列真菌、细菌培养和致热原试验证实均为阴性，可供静脉内使用(此项工作由我院药剂制剂科和微生物科协助完成). Gln用量按总氮量0.56g.kg-1.d-1的25%提供，即0.74g.kg-1.d-1. Gln或Gly在成功诱导ASP后6h开始使用. Gln在临用前15min以9g/L NaCl溶解并配成20g/L浓度，经上腔静脉均匀输入(约需1h左右，1次/8h). 以等氮量Gly作为Gln对照组.
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1.2 方法 ①急性重症胰腺炎的诱导：无菌条件下，正中腹直肌切口进腹，暴露胰十二指肠，在胰管开口对侧切一纵型小切口(约1.5cm～ 2.5cm). 仔细暴露胰管开口处，并放置直径为1mm的聚氯乙烯导管，深约3cm～5cm，并暂时结扎胰管，逆行在4kPa压力下缓慢地注入50g/L牛磺胆酸钠混合液〔内含胰蛋白酶(8～10)×106 BAEE U/L，pH 7.6,牛磺胆酸钠和胰蛋白酶均为Sigma产品〕. 10min后拔除胰管内导管. 以9g/L缓冲生理盐水(pH 7.6)取代50g/L牛磺胆酸钠混合液即为对照组. 然后，依次缝合胰十二指肠和腹壁. 液体在手术期间及手术后8h以内按250mL/kg输入，以后按(125±25)mL/kg，交替使用100g/L葡萄糖注射液和复方乳酸林格氏液. ②Gln+盲肠造口/结肠灌洗组：先在诱导ASP前，取右下腹斜切口，进腹后取出盲肠，周围用盐水纱布保护，用1号线在盲肠前结肠带处做两个同心荷包缝合，彼此相距1cm，在荷包缝合中央切一小口，并插入一根蕈状导管，结扎第1荷包缝线，剪去线尾，作第2荷包缝合时，使盲肠壁内翻. 再将线尾穿过腹膜后打结，使盲壁固定于腹膜上，造口管从腹壁切口引出，逐层缝合腹壁切口，并将导管固定于皮肤上. 在诱导ASP后6h静脉内输注Gln同时，开始进行结肠灌洗，逆向自盲肠造口导管灌入(重力法)生理盐水2000mL，1次/2h，直至结肠流出液澄清无残渣后，改为1次/8h，每次500mL～1000mL，以洗去自小肠流入结肠的肠内容物，来确保结肠灌洗的效果. ③观察指标和方法：每日注意猪的全身情况，包括血压、脉搏、呼吸、体温、动静脉血气分析、白细胞计数，以及厌食、嗜睡或烦燥和留置导尿管记24h尿量等. 分别于ASP诱导前30min(T0)，ASP诱导后、6h(T1)，24h(T2)，48h(T3)，72h(T4)采集腔静脉血样本以测定血浆内毒素(采用上海医化所内毒素定量测定试剂盒)和Gln水平(采用美国Waters公司生产的高效液相色谱仪测定). 72h时点同时采集门静脉血作细菌定量培养，并按常规作细菌学鉴定. ASP后72h，存活的猪用100g/L KCl处死(0.1～0.2)g/kg，在无菌条件下剖胸腹取肺组织、肺门淋巴结、大小肠系膜淋巴结、胰腺组织作细菌学定量培养和常规细菌学鉴定. 在上述采样过程中所涉及到的任何器具均经去热原处理和高压灭菌消毒.
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统计学处理 所列计量资料均采用均数±标准差表示，应用统计软件包stat 5.0作方差分析、Newman-Keuls'检验和t检验.
2 结果
2.1 血浆Gln 组Ⅱ和组Ⅲ血浆Gln在诱导ASP后均出现较明显的下降，ASP后24，48和72h时点血浆Gln与正常对照组比较均有非常显著的统计学差别(P均<0.01). 静脉内Gln支持后，在ASP后24，48，72h个时点血浆Gln均较组Ⅱ和组Ⅲ有非常显著的上升(表1和图1)，但组Ⅳ和组Ⅴ两组间无明显统计学差别.
2.2 血浆内毒素的变化 组Ⅲ血浆内毒素的变化与组Ⅱ基本一致，两组间比较无明显统计学差别. 静脉内Gln支持或Gln支持+结肠灌洗均可使血浆内毒素水平大幅度降低，T2，T3和T4三个时点的血浆内毒素水平较组Ⅱ和组Ⅲ均有非常显著的统计学差别(P<0.01，表2). 组Ⅴ在治疗72h后的血浆内毒素水平又要明显低于组Ⅳ(P<0.01).
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2.3 血和组织细菌培养结果 ASP诱导后72h，在小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结均可培养出致病菌，以革氏阴性杆菌为主，绝大部分为肠道常驻菌. 静脉内给予Gln支持或Gln支持+盲肠造口/结肠灌洗均可大幅度减少小肠系膜淋巴结、大肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺组织和肺门淋巴结等部位易位细菌的数量(表3).
表1 ASP猪血浆谷氨酰胺的变化 (±s，μmol/L) 组别
T0
T2
T3
T4
组Ⅰ
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396±58
286±46
316±45
303±52
组Ⅱ
363±101
181±73b
205±53b
183±21b
组Ⅲ
378±99
179±61b
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188±48b
176±24b
组Ⅳ
364±65
337±77adf
378±96adf
323±85df
组Ⅴ
370±119
339±65adf
369±10adf
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324±95df
aP<0.05，bP<0.01，vs 组Ⅰ；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
表2 ASP猪血浆内毒素的变化 (±s，EU/L) 组别
T0
T1
T2
T3
T4
组Ⅱ
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0.48±0.12
1.88±0.74b
2.69±0.91b
3.91±1.21b
2.61±0.25b
组Ⅲ
0.54±0.12
1.80±0.86b
2.52±0.65b
3.47±0.31b
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2.48±0.19b
组Ⅳ
0.51±0.10
1.99±0.82b
1.63±0.38bdf
2.15±0.69bdf
2.18±0.51bdf
组Ⅴ
0.51±0.10
1.62±0.22b
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1.50±0.54bdf
2.07±0.71bdf
1.79±0.61abdf
aP<0.05，vs 组Ⅳ；bP<0.01，vs T0；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
表3 ASP猪血和组织细菌培养结果 〔x±s,108 CFU/L (kg)〕 组别
静脉血
肺组织
肺门淋巴结
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胰腺
门脉血
小肠淋巴结
大肠淋巴结
组Ⅰ
0
0
0
0
0
0
0
组Ⅱ
11.37±6.31b
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45.06±20.40b
31.68±37.49b
66.00±12.43b
14.94±4.25b
48.67±10.78b
36.34±22.37b
组Ⅲ
10.51±7.54b
25.50±20.20b
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29.33±25.77b
58.36±34.19b
14.09±2.65b
49.72±8.73b
34.67±21.19b
组Ⅳ
0.01±0.01df
2.01±3.09adf
0.30±0.38adf
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25.03±26.70bdf
0.41±0.30adf
0.57±0.89adf
0.05±0.03df
组Ⅴ
0.07±0.10df
8.73±9.03bdf
8.86±12.52bdf
5.83±1.29bdf
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0.11±0.10df
0.22±0.23adf
0.26±0.21adf
aP<0.05，bP<0.01，vs 组Ⅰ；dP<0.01，vs 组Ⅱ；fP<0.01，vs 组Ⅲ.
3 讨论
近年研究显示，胰腺炎后肠道功能受损、肠道屏障功能下降、肠道内微生态环境和正常菌群失调，引起肠道内细菌和内毒素向邻近组织和肠道外组织易位，导致肠源性菌血症和内毒素血症甚至脓毒症是造成重症胰腺炎死亡率和后期并发症如SIRS，ARDS，MODS居高不下的重要原因[1,8-10]. Runkel et al[1]观察结果显示，诱导AP后48，96h肠系膜淋巴结细菌易位发生率均为100%，提示诱导AP 48h之内早有肠源性细菌易位的发生. 本结果证实ASP可诱发肠源性细菌的易位，且ASP后72h易位至肠系膜淋巴结、门脉血、腔静脉血、肺脏器和肺门淋巴结的细菌数量均很大. 已有资料表明Gln支持(无论是肠道内还是肠道外)在肠粘膜屏障功能、改善肠道内微生态环境和预防肠源性细菌和内毒素易位起着非常重要的作用[6,7,10,11].
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本结果显示，ASP可引起血浆Gln水平明显下降，组Ⅱ和组Ⅲ猪血浆Gln水平在ASP后3d均明显低于ASP诱导前或假手术对照组同时点Gln水平，约为ASP诱导前的45%～55%. 而Gln不仅是快速生长和分化的肠粘膜上皮细胞的重要氧化燃料和能量合成底物，也是维持肠粘膜结构、粘膜屏障功能、肠道免疫功能和微生态环境的重要调节因子. 如果体内Gln缺乏，则可引起肠粘膜萎缩，屏障功能减弱，sIgA分泌减少，肠道内菌群失调，导致肠道内细菌/内毒素易位. 我们推测ASP后早期就出现细菌/内毒素易位不仅与ASP后中性粒细胞、炎性递质、细胞因子、蛋白水解酶如弹性蛋白酶、磷脂酶A2、缺血/再灌注损伤等介导肠粘膜结构和屏障功能损伤有关，可能与ASP后血浆Gln水平低下也密切相关. 本结果发现，静脉内输注Gln不仅可显著提高血浆Gln水平，而且使血浆内毒素水平明显下降、易位至门脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量显著降低，证实ASP后血浆Gln水平下降是ASP后细菌/内毒素易位的重要原因之一. 我们将自己研制的Gln粉剂成功地应用于小肠移植患者，也取得了较为满意的疗效[12]. 结果提示Gln在减轻胰腺炎后的肠道粘膜损伤、维持胰腺炎后的肠道正常内菌群、降低胰腺炎后的肠道内细菌和内毒素易位、减少ASP期间肠源性菌血症、内毒素血症、脓毒症甚至ARDS和MODS发生率中可能起着积极的作用.
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Sulkowski et al[13]和Tarpila et al[2]均在1993年分别报道了早期盲肠造口和结肠灌洗在预防鼠ASP后早期肠源性细菌易位的作用，结果显示早期盲肠造口和结肠灌洗不仅可使ASP后高浓度的血浆内毒素水平明显下降，易位至肠系膜淋巴结、血液和远离脏器肠源性细菌阳性率明显下降，而且ASP鼠的晚期死亡率亦呈明显下降，提示盲肠造口和结肠灌洗在改善鼠ASP的预后，降低肠源性细菌易位、菌血症甚至脓毒症及死亡率起着积极的作用. 因此，我们在静脉内输注Gln同时，观察了盲肠造口/结肠灌洗对ASP后细菌/内毒素易位的影响，结果显示，Gln+盲肠造口/结肠灌洗降低血浆内毒素水平和减少易位至门脉血、腔静脉血和远离组织器官的细菌数量又要明显好于单纯静脉内输注Gln组，这对临床上成功救治ASP患者、预防和减少ASP后感染并发症和多脏器功能障碍具有极为重要的理论指导意义.
作者简介:屠伟峰，男，1961-04-22生，浙江省余姚市人，汉族. 1984年南京军区军医学校医疗大专毕业，1991年南京医科大学硕士，1997年第二军医大学博士，现在第三军医大学西南医院全军烧伤研究所博士后流动站作博士后研究工作，主治医师，主要从事麻醉学、复苏和危重医学的临床和研究，发表论文20篇.
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通讯作者 屠伟峰，400038，重庆市高滩岩第三军医大学西南医院全军烧伤研究所.
Correspondence to:TU Wei-Feng, M.D. & Ph.D. Institute of Burn Research, Southwestern Hospital, the Third Military Medical University, Gao Tan Yan, Chongqing, 400038, China
Tel. +86.23.68754125, Fax. +86.23.68754125
E-mail. Wftuyx@public. cta. cq. cn
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收稿日期 1998-08-04 修回日期 1998-11-17, http://www.100md.com