脆性X综合征的PCR筛查与诊断*
作者：陈敬春 杨爱德 费洪宝 金润铭 何美娟 王碧玉
单位：同济医科大学附属协和医院儿科，武汉 430022
关键词：脆性X染色体综合征；聚合酶链反应；筛查；诊断
同济医科大学学报990311 摘要 采用多聚酶链反应(PCR)技术结合变性序列胶银染方法对169例智力低下(简称智低)疑诊病例及6个脆性X综合征家系中33名成员的FMR1基因(CGG)n重复序列进行了分析，结果发现：(1)智低疑诊病例中3例男性未检出PCR阳性产物；(2)脆性X综合征家系内，5例男性先证者亦未检出PCR扩增带；(3)对上述PCR结果为阴性的8例男性智低患者(此8例均经Southern印迹杂交证实为全突变患者)，设立FRAXE位点引物作内对照，结果仅获得FRAXE位点的正常扩增产物，故而可排除FRAXA位点PCR产物为假阴性的可能。结果表明，PCR分析FMR1基因(CGG)n重复序列可有效检出前突变携带者，若男性智低患者的PCR结果为阴性，在设立内对照基本排除假阴性的前提下，对本病也有提示作用。该方法快速、简便、稳定、可靠，适合于脆性X综合征的大量群体筛查。
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Screening and Diagnosis of Fragile X Syndrome by PCR
Chen Jingchun, Yang Aide, Fei Hongbao et al
Department of Pediatrics, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract Polymerase chain reaction (PCR) technique combined with direct detection by silver staining on denaturing DNA sequencing gel was applied to analyze the (CGG)n repeats within the FMR1 gene on 169 suspected patients with mental retardation and 33 kindreds of 6 fragile X families. The results were shown as follows: (1) No PCR products were detected in 3 males in the suspected group. (2) In the fragile X syndrome family studies, the 5 male probands failed to show any PCR products. (3) Diplex PCR with the primers flanking the FRAXE locus was used to serve as an internal control for the above negative results in the 8 males. Only normal products of the FRAXE locus were detected, and so the possibility of false negative results in the FRAXA locus could be ruled out. These findings suggested that analysis of (CGG)n repeat within the FMR1 gene by PCR technique could efficiently detect premutation carriers and that negative PCR products in mentally retarded males might hint the diagnosis of fragile X syndrome after the false negative results had been excluded by the diplex PCR. The PCR assay was suitable for the screening of fragile X syndrome in a large number of populations due to its rapidity, simplicity, stability and reliability.
, 百拇医药
Key words fragile X syndrome; polymerase chain reaction; screening; diagnosis
脆性X综合征〔fragile X syndrome, Fra(X)〕是最常见的遗传性智力低下性疾病之一。在先天性智力低下原因中仅次于先天愚型。国外报道[1]男性发病率为1/1250，女性为1/2500，临床上本病主要表现为智力低下(简称智低)、招风耳、下颌突出及面中部发育不良等。90%以上的男性患者青春期后出现大睾丸[2]。细胞遗传学方法检查Xq27.3处存在FRAXA脆性位点曾是诊断该病的主要依据[3]，但该方法容易造成漏诊及误诊。1991年Verkerk等[4]分离出Fra(X)相关致病基因FMR1，并揭示出FMR1基因内(CGG)n重复序列的不稳定性扩增及其上游CpG岛的异常甲基化是导致该病的分子基础。从此基因诊断即代替了传统的细胞遗传学方法逐渐成为诊断该病的主要方法。本文旨在采用PCR技术分析 FMR1基因(CGG)n重复序列并评判其临床应用价值。
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1 材料与方法
1.1 研究对象及标本
169例智低疑诊病例取自武汉市5所弱智学校的先天性智低患者及本院儿科门诊疑诊病例，其中男93例，女76例 ；6个Fra(X)家系(已经细胞遗传学方法确诊)共33名成员。标本取自外周血，按苯酚/氯仿抽提法提取DNA。
1.2 PCR扩增
引物Ⅰ、Ⅲ参照文献[5]合成，分别相应于FMR1基因第1外显子第1～21碱基对的正向序列及152～132碱基对的反向序列。序列如下：
Ⅰ：5’-GAC GGA GGC GCC GCT GCC AGG-3’
Ⅲ：5’-GTG GGC TGC GGG CGC TCG AGG-3’。
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内对照引物RB134/RB135为FRAXE位点的一对引物，其序列参见文献[6]。 PCR反应体系为25 μl，含1×buffer，1 U Taq DNA聚合酶，100 g/L二甲亚砜，12.5 pmol/L引物，d(A、T、C)TP(Pharmacia产品)及 7-deaza-dGTP(Boehringer Mannhein 公司)各 100 μmol/L，50～500 ng基因组DNA，MgCl2终浓度调至0.75 mmol/L。反应程序为：95 ℃变性3 min，后行35个循环扩增，每一循环包括95 ℃变性 45 s，61 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，循环结束后再于72 ℃延伸5 min。
1.3 PCR产物的序列胶银染检测
取PCR产物10 μl加入点样缓冲液，100 ℃变性2 min，趁热加样于60 g/L聚丙烯酰胺(含7.6 mol/L尿素)的变性序列胶中，300 V电泳2 h。电泳完毕取出凝胶先后行乙酸固定、AgNO3溶液染色及 Na2CO3显示等步骤显示DNA扩增带。
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1.4 Southern 印迹杂交
基因组DNA 10～15 μg经EcoRI/EagI充分酶切后于8.0 g/L琼脂糖凝胶电泳过夜，常规 Southern印迹转膜，用随机引物法以α-32P-dCTP标记探针StB12.3，于65 ℃杂交20 h，充分洗膜后常规压片，-70 ℃放射自显影。
2 结果
169例智低疑诊病例经引物Ⅰ/Ⅲ PCR扩增，结果166例获得正常范围扩增带，3例男性未见阳性扩增带。见图1中P1、P7及P17。
图1 部分智低疑诊病例引物Ⅰ/Ⅲ的PCR产物银染检测结果
P1、P7及P17无阳性扩增带，余均获正常扩增带，M为PBR322/HaeⅢ分子量标准
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33名Fra(X)家系成员引物Ⅰ/Ⅲ PCR结果显示，5例男性先证者(A10、B1、C1、E1及 F1)均未见扩增带；1例女性先证者(D1)、6例先证者的母亲(A9、B3、C3、D2、E3及F4)及家系A先证者之大妹(A11)均检出正常扩增带及前突变扩增带，除D1及D2经Southern印迹杂交证实为前突变/全突变嵌合体外，其余均为前突变携带者；家系B中先证者的外祖父(B4)检测到一条前突变扩增带，与其女儿(B3)的前突变带相同， B4为一例正常男性传递者(NTM)；余19名成员PCR产物均在正常范围内，亦无临床症状及体征，判断为正常个体，家系A、C及D检测结果见图2，家系B、E及F结果从略。
图2 家系A、C及D引物Ⅰ/Ⅲ的PCR检测结果
A10及C1无阳性扩增带，A9、A11、C3、D1 及D2 检出前突变扩增带(M同前)
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上述8例男性智低患者用Ⅰ/Ⅲ引物PCR扩增结果未检出扩增带。对该组患者设立FRAXE位点内对照引物RB134/RB135，与FRAXA位点引物Ⅰ/Ⅲ进行双重PCR扩增，并同时设立空白对照及正常阳性对照。双重PCR结果均仅获得FRAXE位点的正常扩增带(图3)，据此可排除实验因素所造成的假阴性，结合临床特点，此8例应高度怀疑为全突变患者，经Southern 印迹杂交分析，均显示有甲基化和(CGG)n扩增带，为全突变，如图4，先证者A10、B1、C1及F1均检出大于5.2 kb的杂交带。
图3 Ⅰ/Ⅲ引物及内对照引物双重PCR的扩增结果
图中1～6分别为P7、A10、B1、C1、E1及F1双重 PCR 结果，7为空白对照，8为正常男性内对照引 物扩增结果，9为正常男性Ⅰ/Ⅲ引物扩增结果， 10为正常男性双重PCR扩增结果，(M同前)
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图4 4例先证者(A10、B1、C1及F1)经EcoRI/EagI双酶切与StB12.3结果
3 讨论
Fra(X)最基本的分子改变是FMR1基因内(CGG)n重复序列的扩增及其上游 CpG岛的异常甲基化。前突变中(CGG)n重复数处于50～200，不伴有 CpG岛异常甲基化，而当(CGG)n重复数超过200时，则常伴有CpG岛异常甲基化，此时称为全突变。直接检测(CGG)n重复数可以间接了解CpG岛甲基化状态。常规PCR方法能有效扩增(CGG)n重复数小于200的正常及前突变等位基因，而对(CGG)n重复数大于200的全突变等位基因则往往不能进行有效扩增而呈阴性，因此，PCR可用于诊断及筛查Fra(X)前突变携带者，对全突变患者则不能作出明确诊断。
本文169例智低疑诊病例及6个Fra(X)家系FMR1基因(CGG)n 重复序列的PCR检测结果表明,该方法对正常及前突变等位基因均能检出清晰的扩增带，而在8例男性智低患者中均未获得PCR扩增产物，此8例后均经Southern印迹杂交证实其基因型为全突变；1例女性先证者及其母用PCR检出前突变带，Southern印迹杂交证实二者均为前突变/全突变嵌合体，这些结果表明全突变等位基因不能经PCR方法有效检出。国外不少作者同样也观察到全突变男性患者PCR结果阴性或呈涂抹状带，全突变女性则仅见正常带[5，7，8]，其原因可能由于全突变等位基因中(CGG)n重复序列的显著扩增，极大程度上增加了模板DNA中的CG含量，亦大大延长了模板DNA的长度，因而加剧了PCR扩增的难度以致不易获得清晰的扩增条带；其次，序列胶对大分子量DNA分辨能力有限，或常规电泳时间未能使大片段PCR产物泳入凝胶，而导致扩增产物检测失败；另外，在全突变或前突变/全突变嵌合型女性中全突变等位基因的扩增还可能受到正常或前突 变等位基因的竞争性抑制，因而仅检出正常带和(或)前突变带。为了排除因实验方面所造成的假阴性，我们采取了以下措施，如操作时除DNA不同外，其余反应物均先混匀再分装以保证反应条件的一致性；设立内对照、空白对照及正常对照等。本组对引物Ⅰ/Ⅲ 扩增阴性的8例男性智低患者，应用双重PCR扩增时，均获得正常范围的FRAXE位点扩增产物，故基本上可排除假阴性，从而对本病有明显的提示作用。以FRAXE位点引物作内对照的依据在于：扩增位点均位于Xq末端，且二者相距600 kb[9]；二者扩增的正常PCR产物分子量无交叉重叠现象[5，10]，且在同一块序列胶上均可得到很好的分辨效果；在PCR条件严格控制的情况下，除非标本DNA质量有问题，否则双重PCR扩增产物仍为阴性的情况极为罕见，迄今尚未见报道同一男性既为Fra(X)患者又为FRAXE病患者。另外，二者PCR反应条件及所用试剂相同，也为双重PCR及内对照提供了可能。该方法对Fra(X)的大量群体筛查以及进一步确诊均具有广泛的临床应用价值，值得推广应用。
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* 湖北省自然科学基金资助项目(No.95J36)
作者简介:陈敬春，女，1967年生，博士，主治医师
参考文献
1 Rousseau F,Rehel R, Rouillard P et al. Mutational prevalence of fragile X premutations in 10624 females from the general population by Southern bloting. Am J Hum Genet, 1993, 53(suppl):A3
2 Butler M G, Brunswig A, Miller L K et al. Standards for selected antropogenetic measurements in males with fragile X syndrome. Pediatrics, 1992,89:1059
, http://www.100md.com
3 Sutherland G R. Heritable fragile sites on human chromosomes,I:factors expression in lymphocyte culture. Am J Med Genet, 1979,31:125
4 Verkerk A J M H, Pieretti M, Suteliffe J S et al. Identification a gene (FMR1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell, 1991, 65:905
5 Brown W T,Houck G E Jeziorowska A et al. Rapid fragile X carrier screening and prenatal diagnose using a nonradioactive PCR test. JAMA,1993,270:1569
, 百拇医药
6 陈敬春，杨爱德，费洪宝等. PCR检测FRAXE 位点(GCC)n 重复序列的正常分布及其临床应用.中国优生与遗传杂志，1997，5(3)：15
7 Fu Y H, Kuhl D P A, Pizzuti A et al. Variation of the CGG repeat at the Fragile X site results in genetic instability resolution of the Sherman paradox. Cell, 1991,67:1047
8 Taylor A K, Safanda J F, Fall M Z et al. Molecular predictors of cognitive involvement in female carriers of fragile X syndrome. JAMA,1994,271:507
, 百拇医药 9 Flynn G A, Hirst M C,Knight J L et al. Identifica- tion of the FRAXE fragile site in two families ascertained for X linked mental retardation. J Med Genet,1993,30:97
10 Knight S J L,Flannery A V, Hirst M C et al. Trinucleotide repeat amplification and hypermethylation of a CpG island in FRAXE mental retardation. Cell,1993,4: 127
(1998-06-04 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院儿科，武汉 430022
关键词：脆性X染色体综合征；聚合酶链反应；筛查；诊断
同济医科大学学报990311 摘要 采用多聚酶链反应(PCR)技术结合变性序列胶银染方法对169例智力低下(简称智低)疑诊病例及6个脆性X综合征家系中33名成员的FMR1基因(CGG)n重复序列进行了分析，结果发现：(1)智低疑诊病例中3例男性未检出PCR阳性产物；(2)脆性X综合征家系内，5例男性先证者亦未检出PCR扩增带；(3)对上述PCR结果为阴性的8例男性智低患者(此8例均经Southern印迹杂交证实为全突变患者)，设立FRAXE位点引物作内对照，结果仅获得FRAXE位点的正常扩增产物，故而可排除FRAXA位点PCR产物为假阴性的可能。结果表明，PCR分析FMR1基因(CGG)n重复序列可有效检出前突变携带者，若男性智低患者的PCR结果为阴性，在设立内对照基本排除假阴性的前提下，对本病也有提示作用。该方法快速、简便、稳定、可靠，适合于脆性X综合征的大量群体筛查。
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Screening and Diagnosis of Fragile X Syndrome by PCR
Chen Jingchun, Yang Aide, Fei Hongbao et al
Department of Pediatrics, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract Polymerase chain reaction (PCR) technique combined with direct detection by silver staining on denaturing DNA sequencing gel was applied to analyze the (CGG)n repeats within the FMR1 gene on 169 suspected patients with mental retardation and 33 kindreds of 6 fragile X families. The results were shown as follows: (1) No PCR products were detected in 3 males in the suspected group. (2) In the fragile X syndrome family studies, the 5 male probands failed to show any PCR products. (3) Diplex PCR with the primers flanking the FRAXE locus was used to serve as an internal control for the above negative results in the 8 males. Only normal products of the FRAXE locus were detected, and so the possibility of false negative results in the FRAXA locus could be ruled out. These findings suggested that analysis of (CGG)n repeat within the FMR1 gene by PCR technique could efficiently detect premutation carriers and that negative PCR products in mentally retarded males might hint the diagnosis of fragile X syndrome after the false negative results had been excluded by the diplex PCR. The PCR assay was suitable for the screening of fragile X syndrome in a large number of populations due to its rapidity, simplicity, stability and reliability.
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Key words fragile X syndrome; polymerase chain reaction; screening; diagnosis
脆性X综合征〔fragile X syndrome, Fra(X)〕是最常见的遗传性智力低下性疾病之一。在先天性智力低下原因中仅次于先天愚型。国外报道[1]男性发病率为1/1250，女性为1/2500，临床上本病主要表现为智力低下(简称智低)、招风耳、下颌突出及面中部发育不良等。90%以上的男性患者青春期后出现大睾丸[2]。细胞遗传学方法检查Xq27.3处存在FRAXA脆性位点曾是诊断该病的主要依据[3]，但该方法容易造成漏诊及误诊。1991年Verkerk等[4]分离出Fra(X)相关致病基因FMR1，并揭示出FMR1基因内(CGG)n重复序列的不稳定性扩增及其上游CpG岛的异常甲基化是导致该病的分子基础。从此基因诊断即代替了传统的细胞遗传学方法逐渐成为诊断该病的主要方法。本文旨在采用PCR技术分析 FMR1基因(CGG)n重复序列并评判其临床应用价值。
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1 材料与方法
1.1 研究对象及标本
169例智低疑诊病例取自武汉市5所弱智学校的先天性智低患者及本院儿科门诊疑诊病例，其中男93例，女76例 ；6个Fra(X)家系(已经细胞遗传学方法确诊)共33名成员。标本取自外周血，按苯酚/氯仿抽提法提取DNA。
1.2 PCR扩增
引物Ⅰ、Ⅲ参照文献[5]合成，分别相应于FMR1基因第1外显子第1～21碱基对的正向序列及152～132碱基对的反向序列。序列如下：
Ⅰ：5’-GAC GGA GGC GCC GCT GCC AGG-3’
Ⅲ：5’-GTG GGC TGC GGG CGC TCG AGG-3’。
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内对照引物RB134/RB135为FRAXE位点的一对引物，其序列参见文献[6]。 PCR反应体系为25 μl，含1×buffer，1 U Taq DNA聚合酶，100 g/L二甲亚砜，12.5 pmol/L引物，d(A、T、C)TP(Pharmacia产品)及 7-deaza-dGTP(Boehringer Mannhein 公司)各 100 μmol/L，50～500 ng基因组DNA，MgCl2终浓度调至0.75 mmol/L。反应程序为：95 ℃变性3 min，后行35个循环扩增，每一循环包括95 ℃变性 45 s，61 ℃退火60 s，72 ℃延伸120 s，循环结束后再于72 ℃延伸5 min。
1.3 PCR产物的序列胶银染检测
取PCR产物10 μl加入点样缓冲液，100 ℃变性2 min，趁热加样于60 g/L聚丙烯酰胺(含7.6 mol/L尿素)的变性序列胶中，300 V电泳2 h。电泳完毕取出凝胶先后行乙酸固定、AgNO3溶液染色及 Na2CO3显示等步骤显示DNA扩增带。
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1.4 Southern 印迹杂交
基因组DNA 10～15 μg经EcoRI/EagI充分酶切后于8.0 g/L琼脂糖凝胶电泳过夜，常规 Southern印迹转膜，用随机引物法以α-32P-dCTP标记探针StB12.3，于65 ℃杂交20 h，充分洗膜后常规压片，-70 ℃放射自显影。
2 结果
169例智低疑诊病例经引物Ⅰ/Ⅲ PCR扩增，结果166例获得正常范围扩增带，3例男性未见阳性扩增带。见图1中P1、P7及P17。
图1 部分智低疑诊病例引物Ⅰ/Ⅲ的PCR产物银染检测结果
P1、P7及P17无阳性扩增带，余均获正常扩增带，M为PBR322/HaeⅢ分子量标准
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33名Fra(X)家系成员引物Ⅰ/Ⅲ PCR结果显示，5例男性先证者(A10、B1、C1、E1及 F1)均未见扩增带；1例女性先证者(D1)、6例先证者的母亲(A9、B3、C3、D2、E3及F4)及家系A先证者之大妹(A11)均检出正常扩增带及前突变扩增带，除D1及D2经Southern印迹杂交证实为前突变/全突变嵌合体外，其余均为前突变携带者；家系B中先证者的外祖父(B4)检测到一条前突变扩增带，与其女儿(B3)的前突变带相同， B4为一例正常男性传递者(NTM)；余19名成员PCR产物均在正常范围内，亦无临床症状及体征，判断为正常个体，家系A、C及D检测结果见图2，家系B、E及F结果从略。
图2 家系A、C及D引物Ⅰ/Ⅲ的PCR检测结果
A10及C1无阳性扩增带，A9、A11、C3、D1 及D2 检出前突变扩增带(M同前)
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上述8例男性智低患者用Ⅰ/Ⅲ引物PCR扩增结果未检出扩增带。对该组患者设立FRAXE位点内对照引物RB134/RB135，与FRAXA位点引物Ⅰ/Ⅲ进行双重PCR扩增，并同时设立空白对照及正常阳性对照。双重PCR结果均仅获得FRAXE位点的正常扩增带(图3)，据此可排除实验因素所造成的假阴性，结合临床特点，此8例应高度怀疑为全突变患者，经Southern 印迹杂交分析，均显示有甲基化和(CGG)n扩增带，为全突变，如图4，先证者A10、B1、C1及F1均检出大于5.2 kb的杂交带。
图3 Ⅰ/Ⅲ引物及内对照引物双重PCR的扩增结果
图中1～6分别为P7、A10、B1、C1、E1及F1双重 PCR 结果，7为空白对照，8为正常男性内对照引 物扩增结果，9为正常男性Ⅰ/Ⅲ引物扩增结果， 10为正常男性双重PCR扩增结果，(M同前)
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图4 4例先证者(A10、B1、C1及F1)经EcoRI/EagI双酶切与StB12.3结果
3 讨论
Fra(X)最基本的分子改变是FMR1基因内(CGG)n重复序列的扩增及其上游 CpG岛的异常甲基化。前突变中(CGG)n重复数处于50～200，不伴有 CpG岛异常甲基化，而当(CGG)n重复数超过200时，则常伴有CpG岛异常甲基化，此时称为全突变。直接检测(CGG)n重复数可以间接了解CpG岛甲基化状态。常规PCR方法能有效扩增(CGG)n重复数小于200的正常及前突变等位基因，而对(CGG)n重复数大于200的全突变等位基因则往往不能进行有效扩增而呈阴性，因此，PCR可用于诊断及筛查Fra(X)前突变携带者，对全突变患者则不能作出明确诊断。
本文169例智低疑诊病例及6个Fra(X)家系FMR1基因(CGG)n 重复序列的PCR检测结果表明,该方法对正常及前突变等位基因均能检出清晰的扩增带，而在8例男性智低患者中均未获得PCR扩增产物，此8例后均经Southern印迹杂交证实其基因型为全突变；1例女性先证者及其母用PCR检出前突变带，Southern印迹杂交证实二者均为前突变/全突变嵌合体，这些结果表明全突变等位基因不能经PCR方法有效检出。国外不少作者同样也观察到全突变男性患者PCR结果阴性或呈涂抹状带，全突变女性则仅见正常带[5，7，8]，其原因可能由于全突变等位基因中(CGG)n重复序列的显著扩增，极大程度上增加了模板DNA中的CG含量，亦大大延长了模板DNA的长度，因而加剧了PCR扩增的难度以致不易获得清晰的扩增条带；其次，序列胶对大分子量DNA分辨能力有限，或常规电泳时间未能使大片段PCR产物泳入凝胶，而导致扩增产物检测失败；另外，在全突变或前突变/全突变嵌合型女性中全突变等位基因的扩增还可能受到正常或前突 变等位基因的竞争性抑制，因而仅检出正常带和(或)前突变带。为了排除因实验方面所造成的假阴性，我们采取了以下措施，如操作时除DNA不同外，其余反应物均先混匀再分装以保证反应条件的一致性；设立内对照、空白对照及正常对照等。本组对引物Ⅰ/Ⅲ 扩增阴性的8例男性智低患者，应用双重PCR扩增时，均获得正常范围的FRAXE位点扩增产物，故基本上可排除假阴性，从而对本病有明显的提示作用。以FRAXE位点引物作内对照的依据在于：扩增位点均位于Xq末端，且二者相距600 kb[9]；二者扩增的正常PCR产物分子量无交叉重叠现象[5，10]，且在同一块序列胶上均可得到很好的分辨效果；在PCR条件严格控制的情况下，除非标本DNA质量有问题，否则双重PCR扩增产物仍为阴性的情况极为罕见，迄今尚未见报道同一男性既为Fra(X)患者又为FRAXE病患者。另外，二者PCR反应条件及所用试剂相同，也为双重PCR及内对照提供了可能。该方法对Fra(X)的大量群体筛查以及进一步确诊均具有广泛的临床应用价值，值得推广应用。
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作者简介:陈敬春，女，1967年生，博士，主治医师
参考文献
1 Rousseau F,Rehel R, Rouillard P et al. Mutational prevalence of fragile X premutations in 10624 females from the general population by Southern bloting. Am J Hum Genet, 1993, 53(suppl):A3
2 Butler M G, Brunswig A, Miller L K et al. Standards for selected antropogenetic measurements in males with fragile X syndrome. Pediatrics, 1992,89:1059
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3 Sutherland G R. Heritable fragile sites on human chromosomes,I:factors expression in lymphocyte culture. Am J Med Genet, 1979,31:125
4 Verkerk A J M H, Pieretti M, Suteliffe J S et al. Identification a gene (FMR1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell, 1991, 65:905
5 Brown W T,Houck G E Jeziorowska A et al. Rapid fragile X carrier screening and prenatal diagnose using a nonradioactive PCR test. JAMA,1993,270:1569
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6 陈敬春，杨爱德，费洪宝等. PCR检测FRAXE 位点(GCC)n 重复序列的正常分布及其临床应用.中国优生与遗传杂志，1997，5(3)：15
7 Fu Y H, Kuhl D P A, Pizzuti A et al. Variation of the CGG repeat at the Fragile X site results in genetic instability resolution of the Sherman paradox. Cell, 1991,67:1047
8 Taylor A K, Safanda J F, Fall M Z et al. Molecular predictors of cognitive involvement in female carriers of fragile X syndrome. JAMA,1994,271:507
, 百拇医药 9 Flynn G A, Hirst M C,Knight J L et al. Identifica- tion of the FRAXE fragile site in two families ascertained for X linked mental retardation. J Med Genet,1993,30:97
10 Knight S J L,Flannery A V, Hirst M C et al. Trinucleotide repeat amplification and hypermethylation of a CpG island in FRAXE mental retardation. Cell,1993,4: 127
(1998-06-04 收稿), 百拇医药