肽核酸研究进展
作者：李 英 刘克良 恽榴红
单位：李 英, 刘克良, 恽榴红(军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850
关键词：寡核苷酸；结构修饰；肽核酸；基因治疗药物
药学学报990319 PROGRESS IN THE STUDIES ON PEPTIDE NUCLEIC ACID
Li Ying(Li Y), Liu Keliang(Liu KL) and Yun Liuhong(Yun LH)
(Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850)
, 百拇医药 KEY WORDS oligonuleotides; structure modification; peptide nucleic acids; antisense and antigene drug
序列选择性作用于核酸的试剂在分子生物学和药物化学领域有重要意义，因为它们有望成为定靶于基因的诊断和治疗药物。其中，寡核苷酸(ONs)有最好的识别特异性和亲和性，它通过Watson-Crick碱基配对与含互补序列的单链核酸结合形成双螺旋结构，或以Hoogsteen或反Hoogsteen氢键结合到有特定序列的双链DNA(dsDNA)大沟处，形成三股螺旋，从而干扰基因的表达。随着人们对各种致病基因的了解，原则上人们可以设计出针对某个致病基因的寡核苷酸序列，利用它来抑制该基因的表达，达到诊断和治疗疾病的目的。但天然ONs在实际应用上仍存在缺陷，主要是生物稳定性差，易被核酶降解。因此，必须对天然ONs进行结构修饰，过去20年人们合成了大量修饰结构的寡核苷酸，这些修饰方法包括磷酸二酯骨架修饰、碱基修饰、核糖环修饰以及将一些嵌入分子共价连接在寡聚核酸的末端。但就生物稳定性、溶解度、药代动力学性质及合成的难易程度等因素综合衡量，这些寡聚核酸类似物仍不够理想[1]。
, 百拇医药
1991年，Nielsen[2]等人设计并合成了一类新的核酸模拟物—肽核酸(PNA)，与以往的核酸类似物不同，PNA以化学性质与核糖磷酸结构完全不同的(2-氨基乙基)甘氨酸结构单元作为骨架，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架。PNA在结构上很好的模拟了DNA(图1)，碱基与骨架间隔3个键，相邻碱基间隔6个键，空间大小与天然核酸相近，加上结构上其它一些特性，使得PNA保持了对核酸的特异性识别能力。与ONs相比，PNA有很多特点[2]，首先，整个分子不带电荷，这样就避免了与核酸杂交时的静电排斥；其次，PNA的结构单元是修饰氨基酸，因此可用多肽合成法大量制备，还可用化学合成法在N端或C端连上配基或官能团。PNA的另一个优点[3]是它不同于核酸又区别于多肽的结构,使其在体内很稳定，不被核酸酶和蛋白酶降解。1991年以来，科学家对PNA的性质做了广泛而深入的研究。本文对PNA的合成及生化性质和PNA的应用前景做一综述。
图1 PNA与DNA的结构比较.
, 百拇医药
化学合成
寡聚PNA是由保护的PNA单体通过固相合成法制备的，其保护策略、缩合条件、脱保护法及纯化法都与多肽合成法相似。图2是据报道[4～9]的连有不同保护基的PNA单体。
Boc：叔丁氧羰基; Z：苄氧羰基; acyl：酰基; Fmoc：芴甲氧基三苯甲基; Mmt：对甲氧基三苯甲基
图2 PNA单体的四种保护体系.
1 PNA单体的制备
保护的N-(2-氨基乙基)甘氨酸酯和碱基乙酸经缩合、皂化反应后得到PNA单体。以胞嘧啶碱基的PNA单体为例，其合成路线见图3。
DCC：N,N′-环己基碳二亚胺; HOBt：1-羟基苯并三氮唑
, http://www.100md.com
图3 胞嘧啶单体的合成.
2 单体的缩合
寡聚PNA是由PNA单体经固相合成法得到，根据单体骨架和侧链保护基性质的差异，选择合适的固相反应条件，可得满意的缩合产率[4，5，8](不同保护体系PNA单体的缩合条件见表1)。从固相载体上裂解得到的PNA粗产物，经凝胶柱和液相色谱分离得到纯PNA。
表1 不同保护体系PNA单体的固相缩合条件[4～6，8，10]
R1
R2*
固相载体
缩合剂
, 百拇医药
R1脱除条件
中和试剂
从载体上裂解
及R2的脱除
Boc
Z
对甲基二苯甲胺树脂(MBHA)
DCC或N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)
50%三氟乙酸
二异丙基乙胺(DIEA)
氟化氢或三氟甲磺酸
, 百拇医药
Fmoc
acyl
功能化的玻璃珠(CPG)
[O-(7-氮杂苯并三唑)]-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)
20%哌啶
无
NH3/EtOH
Fmoc
Z
MBHA树脂
直接以单体的五氟苯酯缩合
, 百拇医药 30%哌啶
无
氟化氢
Mmt
acyl
功能化的CPG
苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸盐(Bop)或HATU
3%三氯乙酸
N-乙基吗啡啉
浓氨水
*碱基为胸腺嘧啶时，无保护基R2.杂交性质
, 百拇医药
PNA能与含互补靶序列的单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)，RNA及PNA序列特异性杂交。很多文献对杂交分子螺旋结构的形成及性质作了深入的研究，主要通过测量杂交分子的解链温度(Tm)及凝胶电泳实验来衡量杂交性质[2，11]，此外，核磁共振[12]、电喷雾质谱[13]、酶学及化学探针实验[14～16]、圆二色谱[17，18]等也是分析杂交复合物有用的工具。
1 与单链核酸的杂交
PNA与有互补序列的单链核酸杂交，形成的杂交复合物有很高的热稳定性[11]。纯嘧啶碱基序列的PNA与互补寡脱氧核糖核酸(ODN)杂交，形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA-DNA-PNA三螺旋结构[13，17，19]； 嘌呤嘧啶混合碱基序列PNA及纯嘌呤碱基序列PNA与含互补靶序列的ssDNA结合形成Watson-Crick碱基配对的PNA-DNA双螺旋结构[11，12]。实验表明PNA-DNA双螺旋的热稳定性低于(PNA)2-DNA三螺旋，但仍比相应的DNA-DNA双螺旋稳定，主要原因是后者的两条链间存在负电荷斥力[11]。
, http://www.100md.com
2 与双链核酸的杂交
PNA与dsDNA的杂交，因碱基组成的不同，杂交机理和形成的杂交复合物有所不同。
(PNA)2-DNA三螺旋 含高比例胸腺嘧啶的纯嘧啶型PNA通过链取代机制与含互补嘌呤序列的dsDNA形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA2DNA三螺旋结构[20～24]。所谓链取代，就是PNA遵循Watson-Crick碱基配对规则与dsDNA中的一条互补链结合，同时取代另一条非互补链，使之以单链形式游离。酶学和化学探针实验证实，杂交后dsDNA的非互补链有单链性质，易被单链特异的核酸酶S1降解[2，20]；链取代后游离的非互补链形成的P-loop也在电镜下被观察到[23，24]。文献报道链取代三螺旋只有在低离子强度下才能形成(<50 mM NaCl)，而一旦形成，在高离子强度(>500 mM NaCl)下是非常稳定的[22]，这是因为链取代的发生需要双链DNA部分解链，低离子强度有利于两条链间的静电排斥，使双链部分打开。
, http://www.100md.com
PNA-DNA双螺旋 Nielsen等[16]利用化学探针实验证实含纯嘌呤碱基序列的PNA10聚体AAAAGGAGAG与含有靶序列的dsDNA结合，形成PNA-DNA双螺旋。Wittung等[18]也证实纯嘌呤碱基序列和嘌呤嘧啶混合碱基序列PNA[PNA(A10), PNA(AG)5, PNA(TG)5]与dsDNA结合形成PNA-DNA双螺旋结构。
PNA-(DNA)2三螺旋 富含胞嘧啶的PNA如PNA(C10)和PNA(CT)5与含靶序列的dsDNA结合，形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA(pyr)-DNA(pu)-DNA(pyr)三螺旋结构[18]，进一步的研究发现，杂交过程不受离子强度影响，且此杂交反应的活化能小于形成链取代复合物的反应活化能，提示结合过程不包括碱基对的打开。
, 百拇医药
3 与核酸结合的特点
PNA的一个独特性质是以平行或反平行的方式与核酸结合[11]。所谓平行，就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸5′端，反平行，就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸3′端。PNA与DNA(或RNA)形成的双螺旋倾向于反平行结合[11]，而形成的三螺旋倾向于平行结合[14]。且两种结合方式都得到非常稳定的复合物[11]。
PNA在与核酸杂交时表现了高度的亲和性。而PNA-DNA及PNA-RNA杂交分子比相应的DNA-DNA及DNA-RNA杂交分子有更高的热稳定性，这说明PNA与DNA(RNA)之间比DNA与DNA(RNA)之间有更强的杂交亲和力。
PNA与核酸的结合还有序列特异性，就是PNA能区分正确配对和错误配对序列。这表现在含有错配碱基的PNA-DNA杂交分子比含有错配碱基的DNA-DNA杂交分子更加不稳定，例如在PNA-DNA双螺旋中的一个错配碱基至少使Tm下降8～20℃[25]，而在相应地DNA-DNA双螺旋中，一个错配碱基只能使Tm下降4～16℃；当用限制酶抑制实验检测PNA对dsDNA的序列区分能力时，这种效应就更明显了。10个碱基中有2个错配碱基时，PNA就完全不能与靶序列结合。10个碱基中有1个错配碱基时，与靶序列的结合比完全匹配的PNA减少了10倍[26]。
, http://www.100md.com
4 构效关系
为深入理解PNA的结构与杂交活性的关系，人们合成了一些修饰结构的PNA，并对它们的杂交性质进行了初步研究[27，28]，这些化合物的结构、合成及杂交性质的结果见表2。可见，改变骨架与碱基间及碱基与碱基间的距离，都会显著降低PNA的杂交活性，而保持以上距离不变，只是在甘氨酸的α位引入取代基，对杂交性质影响不大。
表2 PNA的结构及杂交性质比较[28，29]
X
Y
Z
ΔTm(℃)
CH2
, http://www.100md.com
CH2CH2
CH2
0
CH2CH2
CH2CH2
CH2
-21
CH2
CH2CH2CH2
CH2
, http://www.100md.com
-8
CH2
CH2CH2
CH2CH2
-10
CH2
CH2CH2(CH3)
CH2
not reported
CH2
, http://www.100md.com
CH2
CH2CH2
-8.5
CH2
CH2CH2
CH(CH3)
-1.0
CH2
CH2CH2
CH(CH2)4NH2
, 百拇医药
0
注：ΔTm是指10聚PNA(H-GTAGATCACT-NH2)中的3个单体被修饰单体所代替后， 与互补ODN形成杂交复合物的Tm改变值.生物化学性质及应用
1 反义性质
PNA的反义性质是指PNA与mRNA结合，从而阻断翻译，使蛋白质的合成不能进行。许多实验室对PNA的反义性质作了研究[21，30，31]，Hanvey等[21]将PNA(H-T3ACT2CT2-NH2)在兔网状细胞溶解物中与含互补序列的RNA孵育，对翻译产物的分析结果表明，随反应液中PNA浓度的增加，完整翻译产物36KD蛋白的生成减少，中止于PNA结合位点的部分翻译产物22KD蛋白的生成增加，以碱基组成相同而序列不同的PNA所作的对照实验未观察到明显的翻译抑制现象。因为PNA-RNA杂交复合物不是RNA酶H的底物，所以Hanvey认为PNA抑制翻译的机理在于通过立体效应阻碍翻译的进行。
, http://www.100md.com
因为PNA不易进入细胞，因此有关PNA反义活性的报道主要限于无细胞体系研究。无细胞抽提物实验[30]证实当PNA靶序列位于mRNA起始密码子的5′近端时，一个15聚嘌呤嘧啶混合型PNA(duplex-forming)剂量依赖性的阻断翻译，而当靶序列位于编码区时，10聚或15聚甚至20聚的混合型PNA都不影响翻译；而能够形成三螺旋的10聚PNA在靶序列与起始密码子重叠时，是有效而专一的反义试剂，在靶序列位于mRNA的编码区时，也能阻断翻译延伸。
用微注射法将PNA直接注射到培养细胞的核中来评价PNA在细胞中的反义性质，就回避了吸收差的问题[21，31]。将一个15聚同聚嘧啶PNA的互补序列克隆到SV40T抗原RNA的未翻译区(5′UTR)，此PNA就可特异抑制T抗原的表达。而当同样的PNA定靶于SV40T抗原mRNA编码区时，翻译也能被抑制，但没有定靶与5′UTR靶有效[31]。
总之，体外研究表明PNA是有效的反义试剂，综上结果可知：嘌呤嘧啶混合型PNA通过与其靶序列形成双螺旋而阻断翻译的开始，而阻断翻译的延伸需要纯嘧啶型PNA与其靶序列形成三股螺旋。
, 百拇医药
2 反基因性质
反基因策略的作用靶是DNA，通过在每个基因组中形成PNA-DNA复合物，理论上就可抑制转录。而当作用靶是mRNA时，PNA必须与细胞中大量mRNA结合才可抑制翻译，所以反基因策略更有吸引力。
纯胸腺嘧啶PNA与双链DNA结合形成很稳定的链取代复合物，因此它们是很好的反基因试剂。已有实验证实这种PNA2-dsDNA复合物在体外能阻断原核及真核RNA聚合酶的延伸[21，32]。其中的一个实验[32]研究了PNA对噬菌体RNA聚合酶T3及T7参与的转录的影响，靶序列位于bluescript KS+质粒上T3或T7启动子的下游。实验所用PNA为T10，T5CT4及T2CT2CT4。当靶序列位于dsDNA的模板链时，转录被PNA阻断；当靶序列位于非模板链时，转录无明显影响。以RNA聚合酶T3参与的转录为例，PNA(T10)使转录在靶序列的第一残基处阻断；PNA(T5CT4)使转录在靶序列的第2～3个核苷酸处阻断；PNA(T2CT2CT4)使转录在靶序列的倒数第1～3个核苷酸处阻断。可见，随胞嘧啶含量的增加，阻断转录的能力降低。作者认为，原因在于胞嘧啶必须质子化才能形成三螺旋，在实验条件下，不能保证全部质子化。
, http://www.100md.com
因此PNA有可能发展成为反基因药物，但要充分理解PNA的反基因性质，还需进行更多的体内外研究。
3 抑制逆转录性质
Koppelhus等[33]研究了体外实验中PNA对HIV-1 gag 基因逆转录的抑制作用，首先设计了与RNA的纯嘌呤序列AAAGAAAAAA平行互补的PNA，反平行互补PNA及将这两种PNA连接起来的bis-PNA，并考察了分别加入不同浓度的PNA对逆转录的影响。当PNA浓度是RNA的60倍时，逆转录完全被阻断，无任何逆转录产物产生；当PNA浓度是RNA的6倍时，前两种PNA部分阻断逆转录，得到完整的逆转录产物及部分逆转录产物(逆转录至靶序列处)，而bis-PNA能完全抑制逆转录，只得到部分逆转录产物；当PNA浓度是RNA的0.6倍时，前两种PNA几乎不能阻断逆转录，得到的是完整的逆转录产物，bis-PNA部分阻断逆转录，得到完整的逆转录产物及部分逆转录产物。可见，与RNA形成三螺旋的PNA能有效的阻断逆转录。
, 百拇医药
此外作者[33]还设计合成了定靶于模板RNA 54-69位的15聚PNA (H-TGGCCTTAACCGAAT-LysNH2)，考察与靶序列形成双螺旋的PNA对逆转录的抑制，结果表明当PNA与RNA的摩尔比大于10时，PNA能完全抑制逆转录；当PNA与RNA摩尔比为1时，大约抑制70%逆转录。
研究数据还表明，在一定的浓度范围内，PNA能选择性的抑制逆转录而不影响翻译，这就意味着如果选择合适的PNA浓度，就能做到专一抑制逆转录活性，而无其他毒性。
4 其他性质及用途
利用PNA-DNA复合物的高度稳定性和序列选择性可检测DNA在PCR扩充时单碱基对的变异[34]。所设计的PNA的靶序列可与引物位点重叠、相邻或相间。当PNA靶序列与引物位点重叠时，引物和PNA竞争与引物位点结合，因为PNA不具备引物对DNA聚合酶的功能，所以PNA与引物位点的结合导致扩充减少；当靶序列与引物位点相邻或相间时，PNA的结合使得聚合酶延伸受阻，DNA增殖减少。如果PCR反应液中加入PNA后，增殖不受影响，表明待测DNA中存在突变碱基。
, http://www.100md.com
富含胸腺嘧啶的纯嘧啶型PNA通过链取代机制与dsDNA杂交，使被取代的DNA链有单链性质，能被单链核酶S1降解。特别是当dsDNA上有两个相邻的PNA靶序列时(可在同一条链，也可在不同链上)，这种断裂更有效。这样，利用与靶序列互补的PNA片段，就可使核酶S1选择性的断裂dsDNA，起到限制性内切酶的作用，可用于DNA分析、染色体图谱、基因克隆及基因诊断等方面[15]。
PNA可通过与dsDNA的结合而阻止该DNA序列识别蛋白与DNA的结合。例如，当PNA的作用靶点与限制性内切酶的识别序列相近时，限制性内切酶对DNA切割作用完全被抑制。因此，PNA可用作序列识别蛋白的特异阻断剂[35]。
PNA还有转录调节因子的作用，它对转录的调节可从两方面来理解。一方面，当PNA通过链取代机制与dsDNA结合后，产生的P-loop有单链性质，RNA聚合酶可以识别P-loop，以被取代链为模板，启动转录[36]。另一方面，对于正在转录的dsDNA，如果PNA的靶序列位于模板链，两者结合就会阻断转录的进行[37]。
, 百拇医药
有关PNA的用途，目前还处于理论研究阶段，可喜的是，已有文献报道[10]利用与衣原体的一段基因互补的PNA来检测被衣原体感染的尿样获得成功。
结语
PNA能与天然核酸杂交形成稳定的螺旋结构，说明核糖磷酸骨架对于DNA双螺旋结构不是必不可少的，这为新的核酸类似物的设计提供了思路。自PNA问世以来，很多新的结构被陆续报道，如PHONA[38](图4)，表现了较好的杂交性质。PNA在生物稳定性、与核酸结合的亲和力和特异性方面优于普通ONs，这无疑将使它成为一类新的分子生物学研究的有利工具。
尽管PNA表现了较好的反义和反基因性质，但它成为基因治疗药物的前景还不明确，主要是因为细胞对PNA摄入差。如何改善PNA的药代动力学性质，从而提高其生物利用度，还有待于人们的进一步研究。
, 百拇医药 图4 PHONA结构.
*联系人 Tel:(010)66931644，E-mail:Keliangliu@nic.bmi.ac.cn)
参考文献
1 Milligan JF, Matteucci MD, Martin JC. J Med Chem, 1993,36∶1923
2 Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, et al. Science, 1991,254∶1497
3 Demidov VV, Potaman VN, Frank-Kamenetskii MD, et al. Biochem Pharmacol, 1994,48∶1310
, 百拇医药
4 Dueholm KL, Egholm M, Behrens C, et al. J Org Chem, 1994,59∶5767
5 Thomson SA, Josey JA, Cadilla R, et al. Tetrahedron, 1995,51∶6179
6 Bergmann F, Bannwarth W, Tam S, et al. Tetrahedron Lett, 1995,36∶6823
7 Breipohl G, Knolle J, Langner D, et al. Bioorgan Med Chem Lett, 1996,6∶665
8 Will DW, Breipohl G, Langner D, et al. Tetrahedron, 1995,51∶12069
, http://www.100md.com
9 Uhlmann E, Will DW, Breipohol G, et al. Nuclesides and Nucleotides, 1997,16∶603
10 Koch T, Borre MB, Naesby M, et al. Nucleosides and Nucleotides, 1997,16∶1771
11 Egholm M, Buchardt O, Christensen L. Nature, 1993,365∶566
12 Leijon M, Graslund A, Nielsen PE. Biochemstry, 1994,33∶9820
13 Griffth MC, Risen LM, Greig MJ, et al. J Am Chem Soc, 1995,117∶831
, http://www.100md.com
14 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. Bioconjugate Chem, 1994,5∶3
15 Demidov V, Frank-Kamenetskii MD, Egholm M, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶2103
16 Nielsen PE, Christensen L. J Am Chem Soc, 1996,118∶2287
17 Kim SK, Nielsen PE, Egholm M, et al. J Am Chem Soc, 1993,115∶6477
18 Wittung P, Nielsen PE, Norden B. Biochemistry, 1997,36∶7973
, 百拇医药
19 Egholm M, Nielsen PE, Buchardt O, et al. J Am Chem Soc, 1992,114∶9677
20 Peffer NJ, Hanvey JC, Bisi JE, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90∶10648
21 Hanvey JC, Peffer NJ, Bisi JE, et al. Science, 1992,258∶1481
22 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. J Mol Rec, 1994,7∶165
23 Cherny DY, Belotserkovskii BP, Frank Kamenetskii MD, et al. Proc Natl Acad USA, 1993,90∶1667
, http://www.100md.com
24 Demidov VV, Cherny DI, Kurakin AV, et al. Nucleic Acids Res, 1994,22∶5218
25 Egholm M, Buchardt O, Nielsen PE, et al. J Am Chem Soc, 1992,114∶1895
26 Buchardt O, Egholm M, Berg RH, et al. Trends Biotechnol, 1993,11∶384
27 Dueholm KL, Nielsen PE. New J Chem, 1997,21∶19
28 Nielsen PE. Peptide nucleic acid(PNA): A lead for gene therapeutic drugs. in Trainer GL ed. Antisense Therapeutics, SECOM Science Publishers B.V., Leiden, 1996,4∶76
, http://www.100md.com
29 Lesnic E, Hassman F, Barbeau J, et al. Nucleosides and Nucleotides, 1997,16∶1775
30 Knudsen H, Nielsen PE. Nucleic Acids Res, 1996,24∶494
31 Bonham MA, Brown S, Boyd AL, et al. Nucleic Acids Res, 1995,23∶1197
32 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. Gene, 1994,149∶139
33 Koppelhus U, Zachar V, Nielsen PE, et al. Nucleic Acids Res, 1997,25∶2167
, 百拇医药
34 Φ rum H, Nielsen PE, Egholm M, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶5332
35 Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶197
36 Mollegaard NE, Buchardt O, Egholm M, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91∶3892
37 Larsen JK, Nielsen PE. Nucleic Acids Res, 1996,24∶458
38 Peyman A, Uhlman E, Wagner K, et al. Angew Chem, 1996,108∶277
收稿日期: 1998-05-05, http://www.100md.com
单位：李 英, 刘克良, 恽榴红(军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850
关键词：寡核苷酸；结构修饰；肽核酸；基因治疗药物
药学学报990319 PROGRESS IN THE STUDIES ON PEPTIDE NUCLEIC ACID
Li Ying(Li Y), Liu Keliang(Liu KL) and Yun Liuhong(Yun LH)
(Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850)
, 百拇医药 KEY WORDS oligonuleotides; structure modification; peptide nucleic acids; antisense and antigene drug
序列选择性作用于核酸的试剂在分子生物学和药物化学领域有重要意义，因为它们有望成为定靶于基因的诊断和治疗药物。其中，寡核苷酸(ONs)有最好的识别特异性和亲和性，它通过Watson-Crick碱基配对与含互补序列的单链核酸结合形成双螺旋结构，或以Hoogsteen或反Hoogsteen氢键结合到有特定序列的双链DNA(dsDNA)大沟处，形成三股螺旋，从而干扰基因的表达。随着人们对各种致病基因的了解，原则上人们可以设计出针对某个致病基因的寡核苷酸序列，利用它来抑制该基因的表达，达到诊断和治疗疾病的目的。但天然ONs在实际应用上仍存在缺陷，主要是生物稳定性差，易被核酶降解。因此，必须对天然ONs进行结构修饰，过去20年人们合成了大量修饰结构的寡核苷酸，这些修饰方法包括磷酸二酯骨架修饰、碱基修饰、核糖环修饰以及将一些嵌入分子共价连接在寡聚核酸的末端。但就生物稳定性、溶解度、药代动力学性质及合成的难易程度等因素综合衡量，这些寡聚核酸类似物仍不够理想[1]。
, 百拇医药
1991年，Nielsen[2]等人设计并合成了一类新的核酸模拟物—肽核酸(PNA)，与以往的核酸类似物不同，PNA以化学性质与核糖磷酸结构完全不同的(2-氨基乙基)甘氨酸结构单元作为骨架，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架。PNA在结构上很好的模拟了DNA(图1)，碱基与骨架间隔3个键，相邻碱基间隔6个键，空间大小与天然核酸相近，加上结构上其它一些特性，使得PNA保持了对核酸的特异性识别能力。与ONs相比，PNA有很多特点[2]，首先，整个分子不带电荷，这样就避免了与核酸杂交时的静电排斥；其次，PNA的结构单元是修饰氨基酸，因此可用多肽合成法大量制备，还可用化学合成法在N端或C端连上配基或官能团。PNA的另一个优点[3]是它不同于核酸又区别于多肽的结构,使其在体内很稳定，不被核酸酶和蛋白酶降解。1991年以来，科学家对PNA的性质做了广泛而深入的研究。本文对PNA的合成及生化性质和PNA的应用前景做一综述。
图1 PNA与DNA的结构比较.
, 百拇医药
化学合成
寡聚PNA是由保护的PNA单体通过固相合成法制备的，其保护策略、缩合条件、脱保护法及纯化法都与多肽合成法相似。图2是据报道[4～9]的连有不同保护基的PNA单体。
Boc：叔丁氧羰基; Z：苄氧羰基; acyl：酰基; Fmoc：芴甲氧基三苯甲基; Mmt：对甲氧基三苯甲基
图2 PNA单体的四种保护体系.
1 PNA单体的制备
保护的N-(2-氨基乙基)甘氨酸酯和碱基乙酸经缩合、皂化反应后得到PNA单体。以胞嘧啶碱基的PNA单体为例，其合成路线见图3。
DCC：N,N′-环己基碳二亚胺; HOBt：1-羟基苯并三氮唑
, http://www.100md.com
图3 胞嘧啶单体的合成.
2 单体的缩合
寡聚PNA是由PNA单体经固相合成法得到，根据单体骨架和侧链保护基性质的差异，选择合适的固相反应条件，可得满意的缩合产率[4，5，8](不同保护体系PNA单体的缩合条件见表1)。从固相载体上裂解得到的PNA粗产物，经凝胶柱和液相色谱分离得到纯PNA。
表1 不同保护体系PNA单体的固相缩合条件[4～6，8，10]
R1
R2*
固相载体
缩合剂
, 百拇医药
R1脱除条件
中和试剂
从载体上裂解
及R2的脱除
Boc
Z
对甲基二苯甲胺树脂(MBHA)
DCC或N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)
50%三氟乙酸
二异丙基乙胺(DIEA)
氟化氢或三氟甲磺酸
, 百拇医药
Fmoc
acyl
功能化的玻璃珠(CPG)
[O-(7-氮杂苯并三唑)]-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)
20%哌啶
无
NH3/EtOH
Fmoc
Z
MBHA树脂
直接以单体的五氟苯酯缩合
, 百拇医药 30%哌啶
无
氟化氢
Mmt
acyl
功能化的CPG
苯并三唑-1-氧-三-(二甲胺基)膦六氟磷酸盐(Bop)或HATU
3%三氯乙酸
N-乙基吗啡啉
浓氨水
*碱基为胸腺嘧啶时，无保护基R2.杂交性质
, 百拇医药
PNA能与含互补靶序列的单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)，RNA及PNA序列特异性杂交。很多文献对杂交分子螺旋结构的形成及性质作了深入的研究，主要通过测量杂交分子的解链温度(Tm)及凝胶电泳实验来衡量杂交性质[2，11]，此外，核磁共振[12]、电喷雾质谱[13]、酶学及化学探针实验[14～16]、圆二色谱[17，18]等也是分析杂交复合物有用的工具。
1 与单链核酸的杂交
PNA与有互补序列的单链核酸杂交，形成的杂交复合物有很高的热稳定性[11]。纯嘧啶碱基序列的PNA与互补寡脱氧核糖核酸(ODN)杂交，形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA-DNA-PNA三螺旋结构[13，17，19]； 嘌呤嘧啶混合碱基序列PNA及纯嘌呤碱基序列PNA与含互补靶序列的ssDNA结合形成Watson-Crick碱基配对的PNA-DNA双螺旋结构[11，12]。实验表明PNA-DNA双螺旋的热稳定性低于(PNA)2-DNA三螺旋，但仍比相应的DNA-DNA双螺旋稳定，主要原因是后者的两条链间存在负电荷斥力[11]。
, http://www.100md.com
2 与双链核酸的杂交
PNA与dsDNA的杂交，因碱基组成的不同，杂交机理和形成的杂交复合物有所不同。
(PNA)2-DNA三螺旋 含高比例胸腺嘧啶的纯嘧啶型PNA通过链取代机制与含互补嘌呤序列的dsDNA形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA2DNA三螺旋结构[20～24]。所谓链取代，就是PNA遵循Watson-Crick碱基配对规则与dsDNA中的一条互补链结合，同时取代另一条非互补链，使之以单链形式游离。酶学和化学探针实验证实，杂交后dsDNA的非互补链有单链性质，易被单链特异的核酸酶S1降解[2，20]；链取代后游离的非互补链形成的P-loop也在电镜下被观察到[23，24]。文献报道链取代三螺旋只有在低离子强度下才能形成(<50 mM NaCl)，而一旦形成，在高离子强度(>500 mM NaCl)下是非常稳定的[22]，这是因为链取代的发生需要双链DNA部分解链，低离子强度有利于两条链间的静电排斥，使双链部分打开。
, http://www.100md.com
PNA-DNA双螺旋 Nielsen等[16]利用化学探针实验证实含纯嘌呤碱基序列的PNA10聚体AAAAGGAGAG与含有靶序列的dsDNA结合，形成PNA-DNA双螺旋。Wittung等[18]也证实纯嘌呤碱基序列和嘌呤嘧啶混合碱基序列PNA[PNA(A10), PNA(AG)5, PNA(TG)5]与dsDNA结合形成PNA-DNA双螺旋结构。
PNA-(DNA)2三螺旋 富含胞嘧啶的PNA如PNA(C10)和PNA(CT)5与含靶序列的dsDNA结合，形成Watson-Crick-Hoogsteen碱基配对的PNA(pyr)-DNA(pu)-DNA(pyr)三螺旋结构[18]，进一步的研究发现，杂交过程不受离子强度影响，且此杂交反应的活化能小于形成链取代复合物的反应活化能，提示结合过程不包括碱基对的打开。
, 百拇医药
3 与核酸结合的特点
PNA的一个独特性质是以平行或反平行的方式与核酸结合[11]。所谓平行，就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸5′端，反平行，就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸3′端。PNA与DNA(或RNA)形成的双螺旋倾向于反平行结合[11]，而形成的三螺旋倾向于平行结合[14]。且两种结合方式都得到非常稳定的复合物[11]。
PNA在与核酸杂交时表现了高度的亲和性。而PNA-DNA及PNA-RNA杂交分子比相应的DNA-DNA及DNA-RNA杂交分子有更高的热稳定性，这说明PNA与DNA(RNA)之间比DNA与DNA(RNA)之间有更强的杂交亲和力。
PNA与核酸的结合还有序列特异性，就是PNA能区分正确配对和错误配对序列。这表现在含有错配碱基的PNA-DNA杂交分子比含有错配碱基的DNA-DNA杂交分子更加不稳定，例如在PNA-DNA双螺旋中的一个错配碱基至少使Tm下降8～20℃[25]，而在相应地DNA-DNA双螺旋中，一个错配碱基只能使Tm下降4～16℃；当用限制酶抑制实验检测PNA对dsDNA的序列区分能力时，这种效应就更明显了。10个碱基中有2个错配碱基时，PNA就完全不能与靶序列结合。10个碱基中有1个错配碱基时，与靶序列的结合比完全匹配的PNA减少了10倍[26]。
, http://www.100md.com
4 构效关系
为深入理解PNA的结构与杂交活性的关系，人们合成了一些修饰结构的PNA，并对它们的杂交性质进行了初步研究[27，28]，这些化合物的结构、合成及杂交性质的结果见表2。可见，改变骨架与碱基间及碱基与碱基间的距离，都会显著降低PNA的杂交活性，而保持以上距离不变，只是在甘氨酸的α位引入取代基，对杂交性质影响不大。
表2 PNA的结构及杂交性质比较[28，29]
X
Y
Z
ΔTm(℃)
CH2
, http://www.100md.com
CH2CH2
CH2
0
CH2CH2
CH2CH2
CH2
-21
CH2
CH2CH2CH2
CH2
, http://www.100md.com
-8
CH2
CH2CH2
CH2CH2
-10
CH2
CH2CH2(CH3)
CH2
not reported
CH2
, http://www.100md.com
CH2
CH2CH2
-8.5
CH2
CH2CH2
CH(CH3)
-1.0
CH2
CH2CH2
CH(CH2)4NH2
, 百拇医药
0
注：ΔTm是指10聚PNA(H-GTAGATCACT-NH2)中的3个单体被修饰单体所代替后， 与互补ODN形成杂交复合物的Tm改变值.生物化学性质及应用
1 反义性质
PNA的反义性质是指PNA与mRNA结合，从而阻断翻译，使蛋白质的合成不能进行。许多实验室对PNA的反义性质作了研究[21，30，31]，Hanvey等[21]将PNA(H-T3ACT2CT2-NH2)在兔网状细胞溶解物中与含互补序列的RNA孵育，对翻译产物的分析结果表明，随反应液中PNA浓度的增加，完整翻译产物36KD蛋白的生成减少，中止于PNA结合位点的部分翻译产物22KD蛋白的生成增加，以碱基组成相同而序列不同的PNA所作的对照实验未观察到明显的翻译抑制现象。因为PNA-RNA杂交复合物不是RNA酶H的底物，所以Hanvey认为PNA抑制翻译的机理在于通过立体效应阻碍翻译的进行。
, http://www.100md.com
因为PNA不易进入细胞，因此有关PNA反义活性的报道主要限于无细胞体系研究。无细胞抽提物实验[30]证实当PNA靶序列位于mRNA起始密码子的5′近端时，一个15聚嘌呤嘧啶混合型PNA(duplex-forming)剂量依赖性的阻断翻译，而当靶序列位于编码区时，10聚或15聚甚至20聚的混合型PNA都不影响翻译；而能够形成三螺旋的10聚PNA在靶序列与起始密码子重叠时，是有效而专一的反义试剂，在靶序列位于mRNA的编码区时，也能阻断翻译延伸。
用微注射法将PNA直接注射到培养细胞的核中来评价PNA在细胞中的反义性质，就回避了吸收差的问题[21，31]。将一个15聚同聚嘧啶PNA的互补序列克隆到SV40T抗原RNA的未翻译区(5′UTR)，此PNA就可特异抑制T抗原的表达。而当同样的PNA定靶于SV40T抗原mRNA编码区时，翻译也能被抑制，但没有定靶与5′UTR靶有效[31]。
总之，体外研究表明PNA是有效的反义试剂，综上结果可知：嘌呤嘧啶混合型PNA通过与其靶序列形成双螺旋而阻断翻译的开始，而阻断翻译的延伸需要纯嘧啶型PNA与其靶序列形成三股螺旋。
, 百拇医药
2 反基因性质
反基因策略的作用靶是DNA，通过在每个基因组中形成PNA-DNA复合物，理论上就可抑制转录。而当作用靶是mRNA时，PNA必须与细胞中大量mRNA结合才可抑制翻译，所以反基因策略更有吸引力。
纯胸腺嘧啶PNA与双链DNA结合形成很稳定的链取代复合物，因此它们是很好的反基因试剂。已有实验证实这种PNA2-dsDNA复合物在体外能阻断原核及真核RNA聚合酶的延伸[21，32]。其中的一个实验[32]研究了PNA对噬菌体RNA聚合酶T3及T7参与的转录的影响，靶序列位于bluescript KS+质粒上T3或T7启动子的下游。实验所用PNA为T10，T5CT4及T2CT2CT4。当靶序列位于dsDNA的模板链时，转录被PNA阻断；当靶序列位于非模板链时，转录无明显影响。以RNA聚合酶T3参与的转录为例，PNA(T10)使转录在靶序列的第一残基处阻断；PNA(T5CT4)使转录在靶序列的第2～3个核苷酸处阻断；PNA(T2CT2CT4)使转录在靶序列的倒数第1～3个核苷酸处阻断。可见，随胞嘧啶含量的增加，阻断转录的能力降低。作者认为，原因在于胞嘧啶必须质子化才能形成三螺旋，在实验条件下，不能保证全部质子化。
, http://www.100md.com
因此PNA有可能发展成为反基因药物，但要充分理解PNA的反基因性质，还需进行更多的体内外研究。
3 抑制逆转录性质
Koppelhus等[33]研究了体外实验中PNA对HIV-1 gag 基因逆转录的抑制作用，首先设计了与RNA的纯嘌呤序列AAAGAAAAAA平行互补的PNA，反平行互补PNA及将这两种PNA连接起来的bis-PNA，并考察了分别加入不同浓度的PNA对逆转录的影响。当PNA浓度是RNA的60倍时，逆转录完全被阻断，无任何逆转录产物产生；当PNA浓度是RNA的6倍时，前两种PNA部分阻断逆转录，得到完整的逆转录产物及部分逆转录产物(逆转录至靶序列处)，而bis-PNA能完全抑制逆转录，只得到部分逆转录产物；当PNA浓度是RNA的0.6倍时，前两种PNA几乎不能阻断逆转录，得到的是完整的逆转录产物，bis-PNA部分阻断逆转录，得到完整的逆转录产物及部分逆转录产物。可见，与RNA形成三螺旋的PNA能有效的阻断逆转录。
, 百拇医药
此外作者[33]还设计合成了定靶于模板RNA 54-69位的15聚PNA (H-TGGCCTTAACCGAAT-LysNH2)，考察与靶序列形成双螺旋的PNA对逆转录的抑制，结果表明当PNA与RNA的摩尔比大于10时，PNA能完全抑制逆转录；当PNA与RNA摩尔比为1时，大约抑制70%逆转录。
研究数据还表明，在一定的浓度范围内，PNA能选择性的抑制逆转录而不影响翻译，这就意味着如果选择合适的PNA浓度，就能做到专一抑制逆转录活性，而无其他毒性。
4 其他性质及用途
利用PNA-DNA复合物的高度稳定性和序列选择性可检测DNA在PCR扩充时单碱基对的变异[34]。所设计的PNA的靶序列可与引物位点重叠、相邻或相间。当PNA靶序列与引物位点重叠时，引物和PNA竞争与引物位点结合，因为PNA不具备引物对DNA聚合酶的功能，所以PNA与引物位点的结合导致扩充减少；当靶序列与引物位点相邻或相间时，PNA的结合使得聚合酶延伸受阻，DNA增殖减少。如果PCR反应液中加入PNA后，增殖不受影响，表明待测DNA中存在突变碱基。
, http://www.100md.com
富含胸腺嘧啶的纯嘧啶型PNA通过链取代机制与dsDNA杂交，使被取代的DNA链有单链性质，能被单链核酶S1降解。特别是当dsDNA上有两个相邻的PNA靶序列时(可在同一条链，也可在不同链上)，这种断裂更有效。这样，利用与靶序列互补的PNA片段，就可使核酶S1选择性的断裂dsDNA，起到限制性内切酶的作用，可用于DNA分析、染色体图谱、基因克隆及基因诊断等方面[15]。
PNA可通过与dsDNA的结合而阻止该DNA序列识别蛋白与DNA的结合。例如，当PNA的作用靶点与限制性内切酶的识别序列相近时，限制性内切酶对DNA切割作用完全被抑制。因此，PNA可用作序列识别蛋白的特异阻断剂[35]。
PNA还有转录调节因子的作用，它对转录的调节可从两方面来理解。一方面，当PNA通过链取代机制与dsDNA结合后，产生的P-loop有单链性质，RNA聚合酶可以识别P-loop，以被取代链为模板，启动转录[36]。另一方面，对于正在转录的dsDNA，如果PNA的靶序列位于模板链，两者结合就会阻断转录的进行[37]。
, 百拇医药
有关PNA的用途，目前还处于理论研究阶段，可喜的是，已有文献报道[10]利用与衣原体的一段基因互补的PNA来检测被衣原体感染的尿样获得成功。
结语
PNA能与天然核酸杂交形成稳定的螺旋结构，说明核糖磷酸骨架对于DNA双螺旋结构不是必不可少的，这为新的核酸类似物的设计提供了思路。自PNA问世以来，很多新的结构被陆续报道，如PHONA[38](图4)，表现了较好的杂交性质。PNA在生物稳定性、与核酸结合的亲和力和特异性方面优于普通ONs，这无疑将使它成为一类新的分子生物学研究的有利工具。
尽管PNA表现了较好的反义和反基因性质，但它成为基因治疗药物的前景还不明确，主要是因为细胞对PNA摄入差。如何改善PNA的药代动力学性质，从而提高其生物利用度，还有待于人们的进一步研究。
, 百拇医药 图4 PHONA结构.
*联系人 Tel:(010)66931644，E-mail:Keliangliu@nic.bmi.ac.cn)
参考文献
1 Milligan JF, Matteucci MD, Martin JC. J Med Chem, 1993,36∶1923
2 Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, et al. Science, 1991,254∶1497
3 Demidov VV, Potaman VN, Frank-Kamenetskii MD, et al. Biochem Pharmacol, 1994,48∶1310
, 百拇医药
4 Dueholm KL, Egholm M, Behrens C, et al. J Org Chem, 1994,59∶5767
5 Thomson SA, Josey JA, Cadilla R, et al. Tetrahedron, 1995,51∶6179
6 Bergmann F, Bannwarth W, Tam S, et al. Tetrahedron Lett, 1995,36∶6823
7 Breipohl G, Knolle J, Langner D, et al. Bioorgan Med Chem Lett, 1996,6∶665
8 Will DW, Breipohl G, Langner D, et al. Tetrahedron, 1995,51∶12069
, http://www.100md.com
9 Uhlmann E, Will DW, Breipohol G, et al. Nuclesides and Nucleotides, 1997,16∶603
10 Koch T, Borre MB, Naesby M, et al. Nucleosides and Nucleotides, 1997,16∶1771
11 Egholm M, Buchardt O, Christensen L. Nature, 1993,365∶566
12 Leijon M, Graslund A, Nielsen PE. Biochemstry, 1994,33∶9820
13 Griffth MC, Risen LM, Greig MJ, et al. J Am Chem Soc, 1995,117∶831
, http://www.100md.com
14 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. Bioconjugate Chem, 1994,5∶3
15 Demidov V, Frank-Kamenetskii MD, Egholm M, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶2103
16 Nielsen PE, Christensen L. J Am Chem Soc, 1996,118∶2287
17 Kim SK, Nielsen PE, Egholm M, et al. J Am Chem Soc, 1993,115∶6477
18 Wittung P, Nielsen PE, Norden B. Biochemistry, 1997,36∶7973
, 百拇医药
19 Egholm M, Nielsen PE, Buchardt O, et al. J Am Chem Soc, 1992,114∶9677
20 Peffer NJ, Hanvey JC, Bisi JE, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90∶10648
21 Hanvey JC, Peffer NJ, Bisi JE, et al. Science, 1992,258∶1481
22 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. J Mol Rec, 1994,7∶165
23 Cherny DY, Belotserkovskii BP, Frank Kamenetskii MD, et al. Proc Natl Acad USA, 1993,90∶1667
, http://www.100md.com
24 Demidov VV, Cherny DI, Kurakin AV, et al. Nucleic Acids Res, 1994,22∶5218
25 Egholm M, Buchardt O, Nielsen PE, et al. J Am Chem Soc, 1992,114∶1895
26 Buchardt O, Egholm M, Berg RH, et al. Trends Biotechnol, 1993,11∶384
27 Dueholm KL, Nielsen PE. New J Chem, 1997,21∶19
28 Nielsen PE. Peptide nucleic acid(PNA): A lead for gene therapeutic drugs. in Trainer GL ed. Antisense Therapeutics, SECOM Science Publishers B.V., Leiden, 1996,4∶76
, http://www.100md.com
29 Lesnic E, Hassman F, Barbeau J, et al. Nucleosides and Nucleotides, 1997,16∶1775
30 Knudsen H, Nielsen PE. Nucleic Acids Res, 1996,24∶494
31 Bonham MA, Brown S, Boyd AL, et al. Nucleic Acids Res, 1995,23∶1197
32 Nielsen PE, Egholm M, Buchardt O. Gene, 1994,149∶139
33 Koppelhus U, Zachar V, Nielsen PE, et al. Nucleic Acids Res, 1997,25∶2167
, 百拇医药
34 Φ rum H, Nielsen PE, Egholm M, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶5332
35 Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, et al. Nucleic Acids Res, 1993,21∶197
36 Mollegaard NE, Buchardt O, Egholm M, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91∶3892
37 Larsen JK, Nielsen PE. Nucleic Acids Res, 1996,24∶458
38 Peyman A, Uhlman E, Wagner K, et al. Angew Chem, 1996,108∶277
收稿日期: 1998-05-05, http://www.100md.com