重组人红细胞生成素中N-连接糖的毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光测定法
作者：周国华 罗国安 张晓丹
单位：张晓丹(清华大学化学系，北京 100084; 1南京军区药品检验所，南京 210002
关键词：
药学学报990317 CHARACTERIZATION OF N-GLYCANS FROM RECOMBINANT
HUMAN ERYTHROPOIETIN BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
WITH LASER-INDUCED FLUORESCENCE
Zhou Guohua (Zhou GH), Luo Guoan (Luo GA) and Zhang Xiaodan (Zhang XD)
, 百拇医药
(Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084;
1Nanjing Military Area Institute for Drug Control, Nanjing 210002)
ABSTRACT AIM: To characterize the profiles of N-glycans in highly glycosylated protein recombinant human erythropoietin (rHuEPO). METHODS: Capillary gel electrophoresis (CGE) of sugars in recombinant human erythorpoietin derivatized by reductive amination with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate(APTS) and detected by laser-induced fluorescence (LIF) has been performed to study the relationships between structure and bioactivities of rHuEPO. RESULTS: The results showed that the CGE-LIF profiles of N-glycans in rHuEPO from the same cell-line were almost identical, but clear different profiles emerged when the sample was from different expression vector. Significant differences in CGE-LIF mappings of rHuEPO with different in vivo bioactivities were also observed. CONCLUSION: The approach developed in this article can be used to control the first order structure of rHuEPO by combining with peptide mapping.
, 百拇医药
KEY WORDS capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence; recombinant human erythropoietin; N-glycans
摘要 目的：表征重组人红细胞生成素中影响体内生物学活性的N-连接糖谱。方法：以毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法(CGE-LIF)测定了重组人红细胞生成素(rHuEPO)中N-连接的多个糖基化形式，并以此为基础研究结构与活性的关系。结果：同一生产线上的样品，其N-连接糖的CGE-LIF图谱基本一致；不同表达载体所表达的rHuEPO，其N-连接糖的形式不同；活性不同的样品，各N-连接糖组分的相对含量存在很大差异。结论：建立的方法可用于判断产品的来源及批间差异，与肽图相结合可测定rHuEPO的一级结构。
关键词 毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法；重组人红细胞生成素；N-连接糖
, 百拇医药
由真核细胞表达的生物大分子通常是糖蛋白，其中糖的成分可能对蛋白的生物活性起调节作用，糖蛋白中糖的结构改变或结合位点的变化常常会导致糖蛋白的生物活性的改变，所以有效地表征糖的结构及量的变化，对表征糖蛋白的结构与活性的关系有重要意义。
重组人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin, rHuEPO)是一种高度糖基化的糖蛋白。其分子骨架为165个氨基酸组成的肽链，具3个N-连接的糖基化位点和1个O-连接的糖基化位点[1]，其中糖基部分的重量约占40%。与自然界存在的激素一样，rHuEPO由于蛋白上糖基部分的多样性而显示出微观不均一性。其中影响r-HuEPO生物学活性的部分主要是糖基上的唾液酸，它是rHuEPO的活性成分[2]。唾液酸的含量不同使rHuEPO的活性不同。在rHuEPO活性检测时，体内外方法测定结果不一致，脱去末端唾液酸后会丧失体内生物学活性，但其体外活性会高于完整的rHuEPO[3]。另外，不同表达载体、不同生产工艺和不同批次的rHuEPO，其唾液酸化程度也存在差异，故rHuEPO糖基化程度的测定是质量控制的关键。本文以毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法测定了rHuEPO中N-连接的多种寡糖形式，并以此为基础研究了结构与活性的关系。
, 百拇医药
原理
以毛细管凝胶电泳模式分离糖蛋白中释放出的完整寡糖，由于糖蛋白中各糖的形态含量低、成分复杂，所以必须采用灵敏的荧光标记试剂与糖形成复合物，利用高灵敏度的激光诱导荧光技术作检测[4～7]。本法由3步构成：
1 糖蛋白中与天冬酰胺连接(N-连接)的寡糖的释放
为了使肽糖苷酶F(PNGase F)能完全消化糖蛋白中的糖，先用SDS和β-巯基丙醇使蛋白变性，二硫键打开，然后用PNGase F酶释放N-连接寡糖，最后用乙醇使蛋白沉淀，寡糖存在于上清液中,离心即得。
2 荧光标记
用离子型荧光标记物标记上述释放的糖，理想的糖衍生化试剂必须具有强的紫外吸收和量子产率，与不同的中性糖形成衍生物后必须有可变的电泳淌度，以达到高效高选择性的分离目的。APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸)具有4个苯环、3个磺酸基团和一个氨基团，所以是一种高度芳香化的离子型化合物，其结构上的3个带负电荷的基团给分离结构极其相似的糖提供了一种可能，该试剂的糖衍生物在很宽的pH范围内均带负电荷，上面的氨基很难质子化(pKa≤3)。N-连接的糖与APTS标记反应如图1所示。
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Fig 1 Illustration of the derivatization of aminated sugar with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS).
根据反应式，1 mol APTS与1 mol寡糖分子反应。该试剂的标记效率很高，在55℃的条件下标记效率最好。但因rHuEPO是高度唾液酸化的糖蛋白，高温(55℃)标记可能会脱唾液酸，因此最好在37℃的条件下标记，为延长标记反应时间，我们采用标记过夜的方法，同样可以使标记效率达95%以上(以麦芽糖试验)。
3 分离检测
经APTS标记的寡糖带负电荷，采用中性涂层柱分离，其电极应反向。LIF检测的优点是灵敏度高、线性范围宽(可达6～7个数量级)、专一性强，但基体和环境对测定的影响大，如温度、pH、离子强度和溶解氧等，当温度增加时，荧光强度下降，因为高温能产生碰撞灭活，所以分析中必须严格控温。另外，温度会影响凝胶的粘度，粘度的改变会使分离效率下降。本实验将温度控制在20℃。
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材料和方法
材料 rHuEPO由南京军区联勤部药品检验所提供；肽糖苷酶F(PNGase-F)及其释放缓冲液、标记染料APTS和7.5% Nonidet P40由Beckman公司提供；麦芽糖、核糖核酸酶-B、氰基硼氢化钠(NaBH3 CN),Sigma公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，99.99%, Boehringer Ingelheim公司；β-羟基丙醇，化学纯，上海试剂四厂；乙醇，分析纯，南京化学试剂厂；乙酸，优级纯，南京化学试剂厂；CGE分离介质为含0.4%聚环氧乙烷的25 mmol.L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.25)。
仪器 P/ACE 5000毛细管电泳仪，488 nm激光诱导荧光检测器，P/ACE LIF专用卡盒和eCAPTMN-CHO中性涂层毛细管柱均为Beckman公司产品。
, http://www.100md.com 糖蛋白中N-连接寡糖的释放 取经纯化的糖蛋白样品60～120 μg，置0.5 ml微型浓缩管(microcon,Amicon,USA) 中脱去其中的Tris和盐，冷冻干燥。加入经稀释1倍的PNGase-F酶释放缓冲液45 μl，混匀，加入5% SDS溶液1 μl和1.44 mol.L-1 β-巯基丙醇1.5 μl，煮沸5 min，冷却至室温后加入7.5% Nonidet P40 5 μl，混匀。加PNGase-F酶2.0 μl于上述混合液中，在37℃水浴中保温2 h，加入3倍量的-20℃无水乙醇沉淀蛋白，使样品保持在冰块上10 min，离心5 min，使蛋白沉淀,仔细将上清液转移至0.5 ml样品管中，真空干燥，置-20℃保存备用。
荧光标记反应 取标记染料APTS 5 mg，加15%乙酸48 μl，混合至全部溶解，离心5 s，置暗处和-20℃保存备用(可稳定2周)。在含上述样品的0.5 ml试管中，加入以上标记试剂2 μl，彻底混匀溶解，加入1 mol*L-1 NaBH3CN四氢呋喃溶液2 μl，混匀离心5 s，在37℃水浴中保温18 h，加入纯水46 μl至以上反应混合物中中止反应。取20 μl加水40 μl稀释后置P/ACE样品管中测定。
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CE-LIF测定步骤 取47 cm长(有效长度40 cm)eCAPTMN-CHO中性涂层毛细管，置P/ACE LIF卡盒中，用分离介质高压冲洗10 min，气压进样10 s，分离电压23.5 kV，电流13 μA，激光检测器激发波长488 nm，发射波长520 nm，温度20℃。
结果与讨论
1 核糖核酸酶B中糖的测定
核糖核酸酶B是一种仅有1个糖基化位点的糖蛋白，有5个高度甘露糖化的寡糖形式[8]，主要的糖是(GlcNAc)2-Man5，另外还有(GlcNAc)2-Manx(x=6，7，8和9)4种糖的形式。为了考察方法的准确性和灵敏度，本文以已知N-连接糖结构的牛核糖核酸酶B为标准样品进行了测定，结果见图2，根据各寡糖纯组分的对照试验确定了各峰的归属。为了证明APTS与单糖反应产生一个峰，采用不同量的麦芽糖与APTS反应，结果表明LIF响应信号与麦芽糖的量有好的线性关系，且当麦芽糖的量超过线性范围时，也未观察到其它吸收峰，说明反应不完全也不会产生额外的组分。进一步采用寡聚葡萄糖混合物试验，每一个组分也仅出一峰。说明本文的实验条件具有较好的选择性和灵敏度，结果是可靠的，能有效地分离结构不同的寡糖组分。
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Fig 2 Capillary gel elctrophoresis with laser-induced fluorescence (CGE-LIF) separation of the APTS-labeled high-mannose type N-linked oligosaccharides released from bovine ribonuclease B. M5=GLcNAc-(Man)5； M6=GLcNAc-(Man)6； M7=GLcNAc-(Man)7； M8=GLcNAc-(Man)8； M9=GLcNAc-(Man)9.
为了考察方法的重复性，同样以核糖核酸酶B为对照品，分别于3 d内(第2次与第1次相隔1 d，第3次与第2次相隔1个月)测定核糖核酸酶B中N-连接糖的CGE-LIF图谱，每次测定均从配制溶液开始，并在同一根毛细管柱和同一台仪器上进行，结果见图3，由图可知a，b，c中各峰的保留时间基本一致，无显著性差异，说明本法具有较好的重复性。
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Fig 3 Reproducibility of CGE-LIF separation on different days. Tested sample and separation conditions were the same as Fig 2. The date of determination of spectra (b) and (c) were one day and one month later than spectrum (a), respectively.
图2的结果表明：随着甘露糖残基数目的增加，保留时间增加，所以当用毛细管凝胶电泳分离寡糖时，糖的空间结构是淌度改变完成分离的主要原因。糖的体积越大，在凝胶中泳动的阻力就越大。根据报道[6，7]，在毛细管凝胶电泳中分离，与凝胶的筛分效应无关，而主要是基于糖的APTS衍生物的动态体积和分离介质的粘度。
2 重组人红细胞生成素(rHuEPO)N-连接糖的测定及与体内外活性的关系
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与以上牛核糖核酸酶B不同，rHuEPO含有3个N-连接的糖基化位点，糖的组成和结构也很复杂，并且末端唾液酸化，由中国仓鼠卵巢细胞表达的rHuEPO所含N-连接寡糖的糖基化形式很多，本文采用上述CGE-LIF法实测了表1中6种不同来源的rHuEPO样品，结果见图4。rHuEPO的体内活性与唾液酸的含量有关，如果失去末端唾液酸，则半乳糖暴露，容易被肝脏凝血酶结合，迅速代谢，失去生理活性，此时基于ELISA法的体外活性结果却增加，因为ELISA法是测定抗原抗体反应，如失去糖，则更易于蛋白之间的作用。表1表明各批号的体内外结果不一致，体内活性(以比活表示)低，说明末端唾液酸有可能失去。由表1和图4可知：(1) 同一生产线上的样品II和III，其N-连接糖的CGE-LIF图谱基本一致，说明同一生产线不同批号的样品，其糖的形式基本一致；(2)不同生产线上的样品，其N-连接糖的形式和含量有很大差别，从I，II，III和IV批样品的CGE-LIF图谱可看出，11 min之后各峰的保留时间相差较大，11 min前却极为相似，说明不同的生产工艺对最终产品的糖基化程度会产生不同的影响，但主要的糖基化形式相同。(3) BHK细胞(baby hamster kidney cells)表达的样品V和CHO细胞(chinese hamster ovary cells)表达的样品VI，分别具有不同的N-连接糖的形式，并且各组分的相对含量也有很大的差异，说明不同的表达载体所表达的rHuEPO，其糖基化形式不同；(4) 体内活性较高的批号II，III和IV在12 min以后有很多峰；而活性较低的批号VI，在11 min以后仅有一小峰，活性最低的批号I在保留时间12 min以后无流出峰。另外发现，体内外活性相差越大，其CGE-LIF图谱的差别也越大，如I和VI批样品与II，III和IV批样品。说明活性不同和体内外活性相差较大的样品，其N-连接糖的形式有很大差异，所以CGE-LIF图谱可用于判断rHuEPO中N-连接糖的含量、形式及其唾液酸的完整性。
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Tab 1 Bioactivities of six batches of bulk rHuEPO (reocmbinant human erythropoitin) sample Batch
No.
Manufacturer
Content of proteina
/mg.ml-1
In vitro activityb
/u.ml-1(protein)
In vivo activityc
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/u.ml-1(protein)
Expression
vector
I
A
0.554
184837
73742
CHO
II
B
0.972
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140329
94137
CHO
III
B
1.03
141165
95294
CHO
IV
C
0.473
175475
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82293
CHO
V
D
0.571
164273
95047
BHK
VI
E
1.05
196571
74494
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CHO
aDetermined by Lowry method； bDetermined by ELISA method； cDetermined by 59Fe incorporation method； CHO: Chinese hamster ovary cells; BHK: Baby hamster kidney cells.
Fig 4 CGE-LIF separation of the APTS-labeled N-linked oligosaccharides released from recombinant human erythropoietin (rHuEPO) in Table 1.
rHuEPO中糖的形式较多，很难将其完全基线分离，V和VI样品的图谱分辨率比前4批样品好，由于所有实验条件均一致，而且每个样品平行做3次，均是交叉进行，所以不是不同实验条件造成的；另外从图4看出：APTS产生的系统峰其出峰时间和分辨率在各批样品中均一致，表明毛细管柱性能良好，涂层没有脱落。未基线分离的原因可能是由于样品本身含糖形式过多。
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实验研究还发现，不同的进样量会使CGE-LIF图谱发生微小的变化。图5为同一生产线上两批样品的CGE-LIF图谱，其中谱图a和c的进样时间为5 s，b和d为10 s，由图可知4图谱除标记为“*”的峰以外，均在同一位置出峰，当进样量增加时，峰*的保留时间减小，当进样量相同时，峰*的保留时间基本一致，如图5中的a和c，b和d。以其余4批rHuEPO 为测定对象时，也发现了同样的规律。因此在比较不同批号rHuEPO的CGE-LIF图谱时，应排除峰*对测定的干扰，着重比较峰*以外的其它峰是否一致。
Fig 5 Effect of injected sample volume on CGE-LIF separations. Separation conditions were the same as Fig 4 except for the injection time of 5 s for spectra a (sample II) and c (sample III), 10 s for spectra b (sample II) and d (sample III).
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以上结果表明：体内外活性不同的样品具有不同的CGE-LIF图谱，这一结果可用于判断产品的来源及批间差异，与肽图相结合可用于常规质控中rHuEPO一级结构的测定，因此具有广泛的应用前景。
基金项目： 国家自然科学基金重点资助项目(692350220)、国家新药博士基金资助项目(96-901-06-07)
联系人 Tel:(010)62784764, Fax:(010)62784764,E-mail:Luoga@sam.chem.tsinghua.edu.cn)
参考文献
1 Lai PH, Everett R, Wang FF, et al. Structural characterization of human erythorpoietin. J Biol Chem, 1988,261∶3116
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2 Higuchi M, Oh-eda M, Kuboniwa H, et al. Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin. J Biol Chem, 1992,267∶7703
3 Tusuda E, Kawanishi G, Ueda M, et al. The role of carbohydrate in recombinant human erythropoietin. Eur J Biochem, 1990,188∶405
4 El Rassi Z. Capillary electrophoresis of carbohydrates. Adv Chromatogr, 1994,34∶117
5 Hermentin P, Doeuges R, Witzel R, et al. A strategy for the mapping of N-glycans by high-performance capillary electrophoresis. Anal Biochem, 1994,221∶29
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6 Chen F, Evangelista RA. Analysis of mono and oligosaccharide isomers derivatized with 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonate by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. Anal Biochem, 1995,230∶273
7 Evangelista RA, Lin M, Chen F. Characterization of 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonate-derivatized sugars by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Anal Chem, 1995,67∶2239
8 Chiesa C, D'Neill RA. Capillary zone electrophoresis of oligosaccharides derivatized with various aminonaphthalene sulfonic acids. Electrophoresis, 1994,15∶1132
收稿日期: 1998-07-14, http://www.100md.com
单位：张晓丹(清华大学化学系，北京 100084; 1南京军区药品检验所，南京 210002
关键词：
药学学报990317 CHARACTERIZATION OF N-GLYCANS FROM RECOMBINANT
HUMAN ERYTHROPOIETIN BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
WITH LASER-INDUCED FLUORESCENCE
Zhou Guohua (Zhou GH), Luo Guoan (Luo GA) and Zhang Xiaodan (Zhang XD)
, 百拇医药
(Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084;
1Nanjing Military Area Institute for Drug Control, Nanjing 210002)
ABSTRACT AIM: To characterize the profiles of N-glycans in highly glycosylated protein recombinant human erythropoietin (rHuEPO). METHODS: Capillary gel electrophoresis (CGE) of sugars in recombinant human erythorpoietin derivatized by reductive amination with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate(APTS) and detected by laser-induced fluorescence (LIF) has been performed to study the relationships between structure and bioactivities of rHuEPO. RESULTS: The results showed that the CGE-LIF profiles of N-glycans in rHuEPO from the same cell-line were almost identical, but clear different profiles emerged when the sample was from different expression vector. Significant differences in CGE-LIF mappings of rHuEPO with different in vivo bioactivities were also observed. CONCLUSION: The approach developed in this article can be used to control the first order structure of rHuEPO by combining with peptide mapping.
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KEY WORDS capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence; recombinant human erythropoietin; N-glycans
摘要 目的：表征重组人红细胞生成素中影响体内生物学活性的N-连接糖谱。方法：以毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法(CGE-LIF)测定了重组人红细胞生成素(rHuEPO)中N-连接的多个糖基化形式，并以此为基础研究结构与活性的关系。结果：同一生产线上的样品，其N-连接糖的CGE-LIF图谱基本一致；不同表达载体所表达的rHuEPO，其N-连接糖的形式不同；活性不同的样品，各N-连接糖组分的相对含量存在很大差异。结论：建立的方法可用于判断产品的来源及批间差异，与肽图相结合可测定rHuEPO的一级结构。
关键词 毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法；重组人红细胞生成素；N-连接糖
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由真核细胞表达的生物大分子通常是糖蛋白，其中糖的成分可能对蛋白的生物活性起调节作用，糖蛋白中糖的结构改变或结合位点的变化常常会导致糖蛋白的生物活性的改变，所以有效地表征糖的结构及量的变化，对表征糖蛋白的结构与活性的关系有重要意义。
重组人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin, rHuEPO)是一种高度糖基化的糖蛋白。其分子骨架为165个氨基酸组成的肽链，具3个N-连接的糖基化位点和1个O-连接的糖基化位点[1]，其中糖基部分的重量约占40%。与自然界存在的激素一样，rHuEPO由于蛋白上糖基部分的多样性而显示出微观不均一性。其中影响r-HuEPO生物学活性的部分主要是糖基上的唾液酸，它是rHuEPO的活性成分[2]。唾液酸的含量不同使rHuEPO的活性不同。在rHuEPO活性检测时，体内外方法测定结果不一致，脱去末端唾液酸后会丧失体内生物学活性，但其体外活性会高于完整的rHuEPO[3]。另外，不同表达载体、不同生产工艺和不同批次的rHuEPO，其唾液酸化程度也存在差异，故rHuEPO糖基化程度的测定是质量控制的关键。本文以毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法测定了rHuEPO中N-连接的多种寡糖形式，并以此为基础研究了结构与活性的关系。
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原理
以毛细管凝胶电泳模式分离糖蛋白中释放出的完整寡糖，由于糖蛋白中各糖的形态含量低、成分复杂，所以必须采用灵敏的荧光标记试剂与糖形成复合物，利用高灵敏度的激光诱导荧光技术作检测[4～7]。本法由3步构成：
1 糖蛋白中与天冬酰胺连接(N-连接)的寡糖的释放
为了使肽糖苷酶F(PNGase F)能完全消化糖蛋白中的糖，先用SDS和β-巯基丙醇使蛋白变性，二硫键打开，然后用PNGase F酶释放N-连接寡糖，最后用乙醇使蛋白沉淀，寡糖存在于上清液中,离心即得。
2 荧光标记
用离子型荧光标记物标记上述释放的糖，理想的糖衍生化试剂必须具有强的紫外吸收和量子产率，与不同的中性糖形成衍生物后必须有可变的电泳淌度，以达到高效高选择性的分离目的。APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸)具有4个苯环、3个磺酸基团和一个氨基团，所以是一种高度芳香化的离子型化合物，其结构上的3个带负电荷的基团给分离结构极其相似的糖提供了一种可能，该试剂的糖衍生物在很宽的pH范围内均带负电荷，上面的氨基很难质子化(pKa≤3)。N-连接的糖与APTS标记反应如图1所示。
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Fig 1 Illustration of the derivatization of aminated sugar with 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS).
根据反应式，1 mol APTS与1 mol寡糖分子反应。该试剂的标记效率很高，在55℃的条件下标记效率最好。但因rHuEPO是高度唾液酸化的糖蛋白，高温(55℃)标记可能会脱唾液酸，因此最好在37℃的条件下标记，为延长标记反应时间，我们采用标记过夜的方法，同样可以使标记效率达95%以上(以麦芽糖试验)。
3 分离检测
经APTS标记的寡糖带负电荷，采用中性涂层柱分离，其电极应反向。LIF检测的优点是灵敏度高、线性范围宽(可达6～7个数量级)、专一性强，但基体和环境对测定的影响大，如温度、pH、离子强度和溶解氧等，当温度增加时，荧光强度下降，因为高温能产生碰撞灭活，所以分析中必须严格控温。另外，温度会影响凝胶的粘度，粘度的改变会使分离效率下降。本实验将温度控制在20℃。
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材料和方法
材料 rHuEPO由南京军区联勤部药品检验所提供；肽糖苷酶F(PNGase-F)及其释放缓冲液、标记染料APTS和7.5% Nonidet P40由Beckman公司提供；麦芽糖、核糖核酸酶-B、氰基硼氢化钠(NaBH3 CN),Sigma公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，99.99%, Boehringer Ingelheim公司；β-羟基丙醇，化学纯，上海试剂四厂；乙醇，分析纯，南京化学试剂厂；乙酸，优级纯，南京化学试剂厂；CGE分离介质为含0.4%聚环氧乙烷的25 mmol.L-1醋酸盐缓冲液(pH 4.25)。
仪器 P/ACE 5000毛细管电泳仪，488 nm激光诱导荧光检测器，P/ACE LIF专用卡盒和eCAPTMN-CHO中性涂层毛细管柱均为Beckman公司产品。
, http://www.100md.com 糖蛋白中N-连接寡糖的释放 取经纯化的糖蛋白样品60～120 μg，置0.5 ml微型浓缩管(microcon,Amicon,USA) 中脱去其中的Tris和盐，冷冻干燥。加入经稀释1倍的PNGase-F酶释放缓冲液45 μl，混匀，加入5% SDS溶液1 μl和1.44 mol.L-1 β-巯基丙醇1.5 μl，煮沸5 min，冷却至室温后加入7.5% Nonidet P40 5 μl，混匀。加PNGase-F酶2.0 μl于上述混合液中，在37℃水浴中保温2 h，加入3倍量的-20℃无水乙醇沉淀蛋白，使样品保持在冰块上10 min，离心5 min，使蛋白沉淀,仔细将上清液转移至0.5 ml样品管中，真空干燥，置-20℃保存备用。
荧光标记反应 取标记染料APTS 5 mg，加15%乙酸48 μl，混合至全部溶解，离心5 s，置暗处和-20℃保存备用(可稳定2周)。在含上述样品的0.5 ml试管中，加入以上标记试剂2 μl，彻底混匀溶解，加入1 mol*L-1 NaBH3CN四氢呋喃溶液2 μl，混匀离心5 s，在37℃水浴中保温18 h，加入纯水46 μl至以上反应混合物中中止反应。取20 μl加水40 μl稀释后置P/ACE样品管中测定。
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CE-LIF测定步骤 取47 cm长(有效长度40 cm)eCAPTMN-CHO中性涂层毛细管，置P/ACE LIF卡盒中，用分离介质高压冲洗10 min，气压进样10 s，分离电压23.5 kV，电流13 μA，激光检测器激发波长488 nm，发射波长520 nm，温度20℃。
结果与讨论
1 核糖核酸酶B中糖的测定
核糖核酸酶B是一种仅有1个糖基化位点的糖蛋白，有5个高度甘露糖化的寡糖形式[8]，主要的糖是(GlcNAc)2-Man5，另外还有(GlcNAc)2-Manx(x=6，7，8和9)4种糖的形式。为了考察方法的准确性和灵敏度，本文以已知N-连接糖结构的牛核糖核酸酶B为标准样品进行了测定，结果见图2，根据各寡糖纯组分的对照试验确定了各峰的归属。为了证明APTS与单糖反应产生一个峰，采用不同量的麦芽糖与APTS反应，结果表明LIF响应信号与麦芽糖的量有好的线性关系，且当麦芽糖的量超过线性范围时，也未观察到其它吸收峰，说明反应不完全也不会产生额外的组分。进一步采用寡聚葡萄糖混合物试验，每一个组分也仅出一峰。说明本文的实验条件具有较好的选择性和灵敏度，结果是可靠的，能有效地分离结构不同的寡糖组分。
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Fig 2 Capillary gel elctrophoresis with laser-induced fluorescence (CGE-LIF) separation of the APTS-labeled high-mannose type N-linked oligosaccharides released from bovine ribonuclease B. M5=GLcNAc-(Man)5； M6=GLcNAc-(Man)6； M7=GLcNAc-(Man)7； M8=GLcNAc-(Man)8； M9=GLcNAc-(Man)9.
为了考察方法的重复性，同样以核糖核酸酶B为对照品，分别于3 d内(第2次与第1次相隔1 d，第3次与第2次相隔1个月)测定核糖核酸酶B中N-连接糖的CGE-LIF图谱，每次测定均从配制溶液开始，并在同一根毛细管柱和同一台仪器上进行，结果见图3，由图可知a，b，c中各峰的保留时间基本一致，无显著性差异，说明本法具有较好的重复性。
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Fig 3 Reproducibility of CGE-LIF separation on different days. Tested sample and separation conditions were the same as Fig 2. The date of determination of spectra (b) and (c) were one day and one month later than spectrum (a), respectively.
图2的结果表明：随着甘露糖残基数目的增加，保留时间增加，所以当用毛细管凝胶电泳分离寡糖时，糖的空间结构是淌度改变完成分离的主要原因。糖的体积越大，在凝胶中泳动的阻力就越大。根据报道[6，7]，在毛细管凝胶电泳中分离，与凝胶的筛分效应无关，而主要是基于糖的APTS衍生物的动态体积和分离介质的粘度。
2 重组人红细胞生成素(rHuEPO)N-连接糖的测定及与体内外活性的关系
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与以上牛核糖核酸酶B不同，rHuEPO含有3个N-连接的糖基化位点，糖的组成和结构也很复杂，并且末端唾液酸化，由中国仓鼠卵巢细胞表达的rHuEPO所含N-连接寡糖的糖基化形式很多，本文采用上述CGE-LIF法实测了表1中6种不同来源的rHuEPO样品，结果见图4。rHuEPO的体内活性与唾液酸的含量有关，如果失去末端唾液酸，则半乳糖暴露，容易被肝脏凝血酶结合，迅速代谢，失去生理活性，此时基于ELISA法的体外活性结果却增加，因为ELISA法是测定抗原抗体反应，如失去糖，则更易于蛋白之间的作用。表1表明各批号的体内外结果不一致，体内活性(以比活表示)低，说明末端唾液酸有可能失去。由表1和图4可知：(1) 同一生产线上的样品II和III，其N-连接糖的CGE-LIF图谱基本一致，说明同一生产线不同批号的样品，其糖的形式基本一致；(2)不同生产线上的样品，其N-连接糖的形式和含量有很大差别，从I，II，III和IV批样品的CGE-LIF图谱可看出，11 min之后各峰的保留时间相差较大，11 min前却极为相似，说明不同的生产工艺对最终产品的糖基化程度会产生不同的影响，但主要的糖基化形式相同。(3) BHK细胞(baby hamster kidney cells)表达的样品V和CHO细胞(chinese hamster ovary cells)表达的样品VI，分别具有不同的N-连接糖的形式，并且各组分的相对含量也有很大的差异，说明不同的表达载体所表达的rHuEPO，其糖基化形式不同；(4) 体内活性较高的批号II，III和IV在12 min以后有很多峰；而活性较低的批号VI，在11 min以后仅有一小峰，活性最低的批号I在保留时间12 min以后无流出峰。另外发现，体内外活性相差越大，其CGE-LIF图谱的差别也越大，如I和VI批样品与II，III和IV批样品。说明活性不同和体内外活性相差较大的样品，其N-连接糖的形式有很大差异，所以CGE-LIF图谱可用于判断rHuEPO中N-连接糖的含量、形式及其唾液酸的完整性。
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Tab 1 Bioactivities of six batches of bulk rHuEPO (reocmbinant human erythropoitin) sample Batch
No.
Manufacturer
Content of proteina
/mg.ml-1
In vitro activityb
/u.ml-1(protein)
In vivo activityc
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/u.ml-1(protein)
Expression
vector
I
A
0.554
184837
73742
CHO
II
B
0.972
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140329
94137
CHO
III
B
1.03
141165
95294
CHO
IV
C
0.473
175475
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82293
CHO
V
D
0.571
164273
95047
BHK
VI
E
1.05
196571
74494
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CHO
aDetermined by Lowry method； bDetermined by ELISA method； cDetermined by 59Fe incorporation method； CHO: Chinese hamster ovary cells; BHK: Baby hamster kidney cells.
Fig 4 CGE-LIF separation of the APTS-labeled N-linked oligosaccharides released from recombinant human erythropoietin (rHuEPO) in Table 1.
rHuEPO中糖的形式较多，很难将其完全基线分离，V和VI样品的图谱分辨率比前4批样品好，由于所有实验条件均一致，而且每个样品平行做3次，均是交叉进行，所以不是不同实验条件造成的；另外从图4看出：APTS产生的系统峰其出峰时间和分辨率在各批样品中均一致，表明毛细管柱性能良好，涂层没有脱落。未基线分离的原因可能是由于样品本身含糖形式过多。
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实验研究还发现，不同的进样量会使CGE-LIF图谱发生微小的变化。图5为同一生产线上两批样品的CGE-LIF图谱，其中谱图a和c的进样时间为5 s，b和d为10 s，由图可知4图谱除标记为“*”的峰以外，均在同一位置出峰，当进样量增加时，峰*的保留时间减小，当进样量相同时，峰*的保留时间基本一致，如图5中的a和c，b和d。以其余4批rHuEPO 为测定对象时，也发现了同样的规律。因此在比较不同批号rHuEPO的CGE-LIF图谱时，应排除峰*对测定的干扰，着重比较峰*以外的其它峰是否一致。
Fig 5 Effect of injected sample volume on CGE-LIF separations. Separation conditions were the same as Fig 4 except for the injection time of 5 s for spectra a (sample II) and c (sample III), 10 s for spectra b (sample II) and d (sample III).
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以上结果表明：体内外活性不同的样品具有不同的CGE-LIF图谱，这一结果可用于判断产品的来源及批间差异，与肽图相结合可用于常规质控中rHuEPO一级结构的测定，因此具有广泛的应用前景。
基金项目： 国家自然科学基金重点资助项目(692350220)、国家新药博士基金资助项目(96-901-06-07)
联系人 Tel:(010)62784764, Fax:(010)62784764,E-mail:Luoga@sam.chem.tsinghua.edu.cn)
参考文献
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2 Higuchi M, Oh-eda M, Kuboniwa H, et al. Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin. J Biol Chem, 1992,267∶7703
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4 El Rassi Z. Capillary electrophoresis of carbohydrates. Adv Chromatogr, 1994,34∶117
5 Hermentin P, Doeuges R, Witzel R, et al. A strategy for the mapping of N-glycans by high-performance capillary electrophoresis. Anal Biochem, 1994,221∶29
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6 Chen F, Evangelista RA. Analysis of mono and oligosaccharide isomers derivatized with 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonate by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence. Anal Biochem, 1995,230∶273
7 Evangelista RA, Lin M, Chen F. Characterization of 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonate-derivatized sugars by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Anal Chem, 1995,67∶2239
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收稿日期: 1998-07-14, http://www.100md.com