新城鸡瘟病毒弱毒株对BT325细胞系多细胞球体的作用
作者：李爱华 潘李珍 马鸿儒
单位：李爱华 首都医科大学生化教研室；潘李珍 马鸿儒首都医科大学实验中心
关键词：新城鸡瘟病毒；BT325多细胞球体；抑制作用
首都医科大学学报/990302 提要： 为研究新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus， NDV)的抗肿瘤作用，观察了NDV Losota-4弱毒株对人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325多细胞球体的杀伤效应。发现：随着培养时间延长，与对照组球体直径相比，各滴度试验组球体平均直径增长数明显减少(P <0.01)；克隆率分析结果进一步证明，NDV Losota-4弱毒株能有效杀伤BT325肿瘤细胞(P <0.01)。
中图分类号： R329.28
Effect of Newcastle Disease Virus Losota-4
, 百拇医药
on BT325 Multicellular Spheroids
Li Aihua
Department of Biochemistry, Capital University of Medical Sciences
Pan Lizhen, Ma Hongru
Laboratory Center, Capital University of Medical Sciences
Abstract:The cytotoxic effects of NDV vaccine Losota-4 on multicellular spheroids model of human glioblastoma multiform BT325 were investigated. The results indicated that the diameter of spheroid decreased in all NDV titer (P<0.01). Survival assay showed that NDV could effectively kill glioblastoma cell (P<0.01).
, 百拇医药
Key words: Newcastle disease virus; BT325 spheroid; inhibition action
自1965年Cassel报告新城鸡瘟病毒(NDV)作为一种抗肿瘤制剂，对人体多种肿瘤疾病的治疗具有潜力以来[1]，至今国外对这方面的研究方兴未艾[2]。1994年，Lorence证明应用简单局部注射方法能使人体成神经细胞瘤(neuroblastoma)及人体纤维肉瘤(fibrosarcoma)移植鼠肿块完全消退[2，3]。1993年，Castary报告，用喷雾吸入法吸入NDV-MTH68弱毒株病毒稀释液治疗多种肿瘤病人，有55%(18/33)病人的肿瘤消退，而吸入安慰剂的对照组病人无一好转[4]。1997年，我国学者白莲花等人报告NDV-L能诱导巨噬细胞TNF基因表达并能继承抗肺癌的转移作用[5]。同年，潘李珍报告NDV-L能抑制人肺腺癌A549细胞系球体的生长[6]。本研究报告NDV Losota-4弱毒株对人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325多细胞球体的作用结果。
, 百拇医药
1 材料和方法
BT325细胞系引自北京市神经外科研究所。培养液为IMDM，其中含有5%小牛血清，1 000 U/L青霉素，80 mg/L链霉素，30 mmol/L Hepes，pH 7.4，每隔2～3 d传代1次。
制备BT325多细胞球体的方法：取对数期单层细胞，去旧液加入0.5%胰蛋白酶消化，加入培养液用滴管吹散细胞制成单细胞悬浮液，计数后稀释成5×105 L-1接种于硅化过的圆底小试管，6 mL/管，小试管插入旋转培养器，在37 ℃，5% CO2培养箱中转动培养，转速17 r/min。从培养24 h起，每天定期取各管的样品0.5 mL，在倒置显微镜下观察球体形成，并测量每个球体纵向、横向2个直径平均值(X和Y互为垂直，以平均直径计算球体的大小)，计算50个球体的平均直径。连续测定8 d，所得每天50个球体平均数输入计算机绘制球体的生长曲线。
, 百拇医药
新城鸡瘟病毒NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体生长的抑制作用：实验用NDV Losota-4弱毒株(北京兽医生物药品中央监察所冻干疫苗种毒)接种于鸡胚尿囊腔复壮，转代3次，血球凝集实验测定的毒价为1∶1 280。按上述方法制备BT325多细胞球体，培养至48 h取样随机计算50个球体平均直径达325 μm时进行球体抑制实验。方法如下：取培养球体的5个小试管直立片刻让球体下沉，除去上清，加入不同滴度病毒稀释液于4个小试管中，每管6 mL。用培养液将病毒稀释成100、10-1、10-2、10-3 4个滴度，另1个小试管加入培养液作对照。小试管全部放回旋转培养器，在原条件下继续培养3 d。病毒作用后，按前法用新鲜培养液洗涤2次，在放大镜下用滴管选出含球体悬浮液中直径约320 μm的球体，分别接种于24孔盘。每孔1个球体，12个球体为1个实验组。所用24孔盘事先用1% Noble琼脂封孔底，每孔加入培养液1 mL，然后放在5%CO2培养箱(37 ℃)中培养，每隔3 d观察1次，并按前述方法测量每个球体的平均直径，连续12 d。将每个滴度球体平均直径与对照组比较，统计并绘制曲线。
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对BT325多细胞球体克隆率的测定：取上述不同滴度实验试管培养球体悬浮液2 mL，吸入尖底离心管，经培养液洗涤后加入5%胰蛋白酶作用10 min，去上清加适量培养液吹散细胞成单细胞悬液，计数，稀释成1×104 L-1，接种于体积相同的大培养瓶中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。20 d后计每个滴度球体细胞形成集落数目。对照组亦在相同条件下进行培养和计数。比较实验组与对照组集落数，统计其差异。
2 结果
2.1 BT325多细胞球体生长曲线
球体的生长曲线如图1。实验证明培养24 h便可见很多球体形成，48 h平均直径多数达300 μm以上，培养第8天球体平均直径相当于24 h球体平均直径的2.5倍，图2为BT325 多细胞球体的各种形态。
, http://www.100md.com 图1 BT325多细胞球体生长曲线
图2 BT325多细胞球体的形态
上图：培养24 h球体；下图：培养48 h球体
2.2 NDV Losota-4 弱毒株对BT325多细胞球体的作用
NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体生长抑制作用见表1。
由表1看出，各实验组平均直径随培养时间的延长而明显减少，而对照组平均直径随时间延长而增加。实验组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。从表1还可以看出10-2滴度对球体生长的抑制作用最强。
NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体克隆率的测定见表2。
, 百拇医药
克隆率的测定目的在于了解NDV Losota-4弱毒株作用后对BT325的杀伤力。实验发现：实验组克隆率明显低于对照组(P<0.05，P<0.01)，尤以10-2滴度对BT325球体细胞杀伤力最大，克隆率只有1.3%。
表1 各组细胞球体直径变化情况 μm 组别
t(培养)/d
3
6
9
12
对照组
382.5±69
428.3±53
, 百拇医药
435.0±59
450.0±50
NDV/100
306.6±61
363.3±67*
293.3±35* *
265.0±51* *
NDV/10-1
313.0±30
348.3±63*
, http://www.100md.com
256.7±25* *
230.7±70* *
NDV/10-2
308.3±76
307.5±67* *
252.5±62* *
226.7±25* *
NDV/10-3
330.8±96
317.5±91* *
, http://www.100md.com
275.0±38* *
275.5±50* *
各组n=12；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01表2 各组细胞球体克隆率的比较 分组
克隆率/%
对照组
17.5±3.4
NDV/100
10.5±5.8*
NDV/10-1
5.0±3.6* *
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NDV/10-2
1.3±1.3* *
NDV/10-3
3.0±1.8* *
各组n=4；与对照组比较*P<0.05，**P<0.013 讨论
研究表明无论是简单吸入或直接注射NDV都能使肿块消退[2，3]。NDV能选择性地在肿瘤细胞中繁殖，产生蚀斑进而杀伤肿瘤细胞[4]。目前认为3种机制能解释NDV的作用：①病毒蛋白与相关肿瘤细胞膜或整体细胞相结合，促进肿瘤抗原的免疫原性，因而增加宿主细胞与体液介质对肿瘤细胞的损害；②病毒可促进宿主细胞产生细胞因子，如TNF、ITF、IL-1及IL-6；以上2种机制要求宿主免疫系统参加；③病毒能直接对肿瘤组织发挥专一的特异性细胞毒作用[6]。这些研究在临床上无疑具有很大价值，本实验证明了NDV Losota-4弱毒株能抑制BT325多细胞球体生长，克隆效应实验证实此株病毒具有杀伤BT325肿瘤细胞的能力。
, 百拇医药
参考文献
1.Cassel W A, Garren R E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent. Cancer,1965,18:863～867
2.Lorence R M, Reichard K W, Katubig B B. Complete regression of human neuroblastoma xenograftsin athymic mice after local newcastle disease virus therapy. J Natl Cancer Inst, 1994,86:1228～1233
3.Lorence R M, Katubig B B, Reichard K W. Complete regression of human fibrosarcoma xenografts after local Newcastle disease virus therapy. Cancer Res,1994,54:6017～6021
, 百拇医药
4.Castary L K. Attenuated veterinnary virus vaccine for treatment of cancer. Cancer Detcet Pre, 1993,17(6):619～621
5.白莲花,钱振超.新城鸡瘟病毒诱导巨噬细胞TNF基因表达及继承性抗肺转移作用的实验研究.中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4(2):121～124
6.潘李珍.新城疫弱病毒对人肺腺癌细胞系A549多细胞球体的作用.首都医科大学学报,1997,18(3):209～211
收稿日期：1998-09-25
, 百拇医药
单位：李爱华 首都医科大学生化教研室；潘李珍 马鸿儒首都医科大学实验中心
关键词：新城鸡瘟病毒；BT325多细胞球体；抑制作用
首都医科大学学报/990302 提要： 为研究新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus， NDV)的抗肿瘤作用，观察了NDV Losota-4弱毒株对人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325多细胞球体的杀伤效应。发现：随着培养时间延长，与对照组球体直径相比，各滴度试验组球体平均直径增长数明显减少(P <0.01)；克隆率分析结果进一步证明，NDV Losota-4弱毒株能有效杀伤BT325肿瘤细胞(P <0.01)。
中图分类号： R329.28
Effect of Newcastle Disease Virus Losota-4
, 百拇医药
on BT325 Multicellular Spheroids
Li Aihua
Department of Biochemistry, Capital University of Medical Sciences
Pan Lizhen, Ma Hongru
Laboratory Center, Capital University of Medical Sciences
Abstract:The cytotoxic effects of NDV vaccine Losota-4 on multicellular spheroids model of human glioblastoma multiform BT325 were investigated. The results indicated that the diameter of spheroid decreased in all NDV titer (P<0.01). Survival assay showed that NDV could effectively kill glioblastoma cell (P<0.01).
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Key words: Newcastle disease virus; BT325 spheroid; inhibition action
自1965年Cassel报告新城鸡瘟病毒(NDV)作为一种抗肿瘤制剂，对人体多种肿瘤疾病的治疗具有潜力以来[1]，至今国外对这方面的研究方兴未艾[2]。1994年，Lorence证明应用简单局部注射方法能使人体成神经细胞瘤(neuroblastoma)及人体纤维肉瘤(fibrosarcoma)移植鼠肿块完全消退[2，3]。1993年，Castary报告，用喷雾吸入法吸入NDV-MTH68弱毒株病毒稀释液治疗多种肿瘤病人，有55%(18/33)病人的肿瘤消退，而吸入安慰剂的对照组病人无一好转[4]。1997年，我国学者白莲花等人报告NDV-L能诱导巨噬细胞TNF基因表达并能继承抗肺癌的转移作用[5]。同年，潘李珍报告NDV-L能抑制人肺腺癌A549细胞系球体的生长[6]。本研究报告NDV Losota-4弱毒株对人脑多形胶质母细胞瘤细胞系BT325多细胞球体的作用结果。
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1 材料和方法
BT325细胞系引自北京市神经外科研究所。培养液为IMDM，其中含有5%小牛血清，1 000 U/L青霉素，80 mg/L链霉素，30 mmol/L Hepes，pH 7.4，每隔2～3 d传代1次。
制备BT325多细胞球体的方法：取对数期单层细胞，去旧液加入0.5%胰蛋白酶消化，加入培养液用滴管吹散细胞制成单细胞悬浮液，计数后稀释成5×105 L-1接种于硅化过的圆底小试管，6 mL/管，小试管插入旋转培养器，在37 ℃，5% CO2培养箱中转动培养，转速17 r/min。从培养24 h起，每天定期取各管的样品0.5 mL，在倒置显微镜下观察球体形成，并测量每个球体纵向、横向2个直径平均值(X和Y互为垂直，以平均直径计算球体的大小)，计算50个球体的平均直径。连续测定8 d，所得每天50个球体平均数输入计算机绘制球体的生长曲线。
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新城鸡瘟病毒NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体生长的抑制作用：实验用NDV Losota-4弱毒株(北京兽医生物药品中央监察所冻干疫苗种毒)接种于鸡胚尿囊腔复壮，转代3次，血球凝集实验测定的毒价为1∶1 280。按上述方法制备BT325多细胞球体，培养至48 h取样随机计算50个球体平均直径达325 μm时进行球体抑制实验。方法如下：取培养球体的5个小试管直立片刻让球体下沉，除去上清，加入不同滴度病毒稀释液于4个小试管中，每管6 mL。用培养液将病毒稀释成100、10-1、10-2、10-3 4个滴度，另1个小试管加入培养液作对照。小试管全部放回旋转培养器，在原条件下继续培养3 d。病毒作用后，按前法用新鲜培养液洗涤2次，在放大镜下用滴管选出含球体悬浮液中直径约320 μm的球体，分别接种于24孔盘。每孔1个球体，12个球体为1个实验组。所用24孔盘事先用1% Noble琼脂封孔底，每孔加入培养液1 mL，然后放在5%CO2培养箱(37 ℃)中培养，每隔3 d观察1次，并按前述方法测量每个球体的平均直径，连续12 d。将每个滴度球体平均直径与对照组比较，统计并绘制曲线。
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对BT325多细胞球体克隆率的测定：取上述不同滴度实验试管培养球体悬浮液2 mL，吸入尖底离心管，经培养液洗涤后加入5%胰蛋白酶作用10 min，去上清加适量培养液吹散细胞成单细胞悬液，计数，稀释成1×104 L-1，接种于体积相同的大培养瓶中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。20 d后计每个滴度球体细胞形成集落数目。对照组亦在相同条件下进行培养和计数。比较实验组与对照组集落数，统计其差异。
2 结果
2.1 BT325多细胞球体生长曲线
球体的生长曲线如图1。实验证明培养24 h便可见很多球体形成，48 h平均直径多数达300 μm以上，培养第8天球体平均直径相当于24 h球体平均直径的2.5倍，图2为BT325 多细胞球体的各种形态。
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图2 BT325多细胞球体的形态
上图：培养24 h球体；下图：培养48 h球体
2.2 NDV Losota-4 弱毒株对BT325多细胞球体的作用
NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体生长抑制作用见表1。
由表1看出，各实验组平均直径随培养时间的延长而明显减少，而对照组平均直径随时间延长而增加。实验组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。从表1还可以看出10-2滴度对球体生长的抑制作用最强。
NDV Losota-4弱毒株对BT325多细胞球体克隆率的测定见表2。
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克隆率的测定目的在于了解NDV Losota-4弱毒株作用后对BT325的杀伤力。实验发现：实验组克隆率明显低于对照组(P<0.05，P<0.01)，尤以10-2滴度对BT325球体细胞杀伤力最大，克隆率只有1.3%。
表1 各组细胞球体直径变化情况 μm 组别
t(培养)/d
3
6
9
12
对照组
382.5±69
428.3±53
, 百拇医药
435.0±59
450.0±50
NDV/100
306.6±61
363.3±67*
293.3±35* *
265.0±51* *
NDV/10-1
313.0±30
348.3±63*
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256.7±25* *
230.7±70* *
NDV/10-2
308.3±76
307.5±67* *
252.5±62* *
226.7±25* *
NDV/10-3
330.8±96
317.5±91* *
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275.0±38* *
275.5±50* *
各组n=12；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01表2 各组细胞球体克隆率的比较 分组
克隆率/%
对照组
17.5±3.4
NDV/100
10.5±5.8*
NDV/10-1
5.0±3.6* *
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NDV/10-2
1.3±1.3* *
NDV/10-3
3.0±1.8* *
各组n=4；与对照组比较*P<0.05，**P<0.013 讨论
研究表明无论是简单吸入或直接注射NDV都能使肿块消退[2，3]。NDV能选择性地在肿瘤细胞中繁殖，产生蚀斑进而杀伤肿瘤细胞[4]。目前认为3种机制能解释NDV的作用：①病毒蛋白与相关肿瘤细胞膜或整体细胞相结合，促进肿瘤抗原的免疫原性，因而增加宿主细胞与体液介质对肿瘤细胞的损害；②病毒可促进宿主细胞产生细胞因子，如TNF、ITF、IL-1及IL-6；以上2种机制要求宿主免疫系统参加；③病毒能直接对肿瘤组织发挥专一的特异性细胞毒作用[6]。这些研究在临床上无疑具有很大价值，本实验证明了NDV Losota-4弱毒株能抑制BT325多细胞球体生长，克隆效应实验证实此株病毒具有杀伤BT325肿瘤细胞的能力。
, 百拇医药
参考文献
1.Cassel W A, Garren R E. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent. Cancer,1965,18:863～867
2.Lorence R M, Reichard K W, Katubig B B. Complete regression of human neuroblastoma xenograftsin athymic mice after local newcastle disease virus therapy. J Natl Cancer Inst, 1994,86:1228～1233
3.Lorence R M, Katubig B B, Reichard K W. Complete regression of human fibrosarcoma xenografts after local Newcastle disease virus therapy. Cancer Res,1994,54:6017～6021
, 百拇医药
4.Castary L K. Attenuated veterinnary virus vaccine for treatment of cancer. Cancer Detcet Pre, 1993,17(6):619～621
5.白莲花,钱振超.新城鸡瘟病毒诱导巨噬细胞TNF基因表达及继承性抗肺转移作用的实验研究.中国肿瘤生物治疗杂志,1997,4(2):121～124
6.潘李珍.新城疫弱病毒对人肺腺癌细胞系A549多细胞球体的作用.首都医科大学学报,1997,18(3):209～211
收稿日期：1998-09-25
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