胆囊收缩素cDNA探针制备及其在癫痫发病机制研究中的应用
作者：倪宏 唐明 徐珞 吕振华
单位：青岛医学院(青岛 266021)倪宏 唐明 徐珞 生理学教研室；吕振华 附属医院骨科研究室
关键词：缩胆囊素；DNA；探针；原位杂交；地高辛精；大鼠
青岛医学院学报990302 【摘要】 ①目的 制备胆囊收缩素(CCK)cDNA探针，并以此探针检测遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内CCK-mRNA表达。②方法 将含0.5kbp Rat CCK-mRNA的质粒PUC13扩增、回收和纯化，用随机引物标记法，得到地高辛精(Dig)标记CCK-cDNA探针。用原位杂交技术,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层CCK-mRNA表达进行研究。③结果 CCK-cDNA探针标记效率为50mg/L；遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内CCK-mRNA表达显著增加。④结论 本实验制备的Dig-CCK-cDNA探针，具有较好的特异性和灵敏度；原位杂交实验证实，CCK参与了癫痫发作过程。
, 百拇医药
中国图书馆分类法分类号 R338
PURIFICATION OF CHOLECYSTOKININ cDNA PROBE AND ITS APPLICATION IN THE MECHANISM STUDY OF EPILEPSY
Ni Hong, Tang Ming, Xu Luo, et al
Department of Physiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To prepare cholecystokinin(CCK) cDNA probe and to explore CCK-mRNA expression with the probe in hereditary audiogenic epilepsy susceptible rat brain after epilepsy seizure. Methods Plasmid PUC13 containing 0.5 kbp Rat CCK-mRNA was amplified, retrieved and purified. CCK-cDNA probe was labelled with digoxigenin by random priming. CCK-mRNA expressions in rat hippocampus and cerebral cortex after epilepsy seizure were studied by in situ hybridization. Results The labelling rate of CCK-cDNA probe was 50mg/L. The CCK-mRNA expression was significantly increased after epilepsy seizure in hereditary audiogenic epilepsy susceptible rat. Conclusion Dig-CCK-cDNA probe obtained in this study had good specificity and sensitivity. In situ hybridization study proved that CCK was involved in the process of epilepsy seizure.
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【KEY WORDS】 cholecystokinin; DNA probes; in situ hybridization; digoxingenin; rat
胆囊收缩素(CCK)是脑内一种重要的神经肽，具有胃肠道激素和中枢调节双重作用〔1〕。CCK参与机体多种生理机能的调控，主要有摄食、镇痛、情绪、学习记忆和锥体外系的躯体运动等。CCK与某些神经精神性疾病如癫痫、帕金森病、焦虑、抑郁、精神分裂症等的发病也有密切关系。近年来，随着分子生物学技术的建立和发展，人们对CCK生理作用的分子机制进行了大量研究。近10年来,我室对CCK调节摄食和胃运动的机制作了电生理和放射免疫等方面的系列研究工作，但是，由于探针价格昂贵，限制了我们对CCK生物作用的分子机制进行更加深入的探讨。本实验通过对PUC13质粒(含有577bp的CCK-cDNA)的转化、扩增、提取及检测，得到地高辛精标记CCK-cDNA探针，并用原位杂交方法,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层CCK-mRNA表达进行研究，从而使我们对CCK的系列研究工作达到分子水平。
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1 材料与方法
1.1 CCK-cDNA 探针的制备〔2〕
1.1.1 质粒的转化 质粒PUC13来自Jack ED实验室，含有0.5kbp Rat CCK-cDNA的质粒，其中第34～381核苷酸序列编码为CCK前体，169～225核苷酸序列编码为CCK58，226～243核苷酸序列编码为CCK39，244～306核苷酸序列编码为CCK33，307～318核苷酸序列编码为CCK12，319～378核苷酸序列编码为CCK8，重组位点分别为EcoRⅠ和Hind Ⅲ.采用氯化钙法进行质粒的转化，转化所用工程菌为HB101.
1.1.2 质粒PUC13的制备 采用碱裂解法大量制备质粒,以紫外分光光度计测定A260/A280，得质粒DNA，含量约为300mg/L.于-20℃储存。
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1.1.3 插入片段的酶切 ①取PUC13质粒DNA 250μL(约31μg)，10×Buffer B 30μL,EcoRⅠ20U(16μL), Hind Ⅲ 28U(4μL),加三蒸水至300μL,混匀后于37℃放置3h；②取反应体系液5μL，加6×上样缓冲液1μL，微电泳，紫外法检测酶切完全,得约0.5kbp和2.7kbp两个片段。
1.1.4 酶切CCK-cDNA片段的回收 ①酶反应体系中加入6×上样缓冲液，7g/L琼脂糖电泳，300nm波长紫外灯下小心切取含有插入片段的琼脂糖凝胶块。②置于“Ⅴ”型电泳槽的凹槽，凹槽中加入高盐缓冲液,其组成为:7.5mol/L乙酸铵,体积分数0.01的甘油,1mol/L Tris(pH 7.8)和少量溴酚蓝。③100V电泳1h，紫外灯下观察，凝胶块上DNA全部移出，停止电泳，回收高盐缓冲液。④高盐缓冲液以等量水饱和酚抽提，水相加两倍体积的无水乙醇，-70℃下30min.⑤4℃下12 000r/min离心10min，15.2mol/L乙醇洗涤2次，空气中干燥，加TE 50μL溶解DNA，微电泳检测定量。
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1.1.5 cDNA探针的标记(Dig-随机引物标记)参照Boehringer公司使用手册:①以上述回收的CCK-cDNA片段约1.5μg作为模板，稀释至15μL，煮沸10min，迅速置于含0.86mol/L氯化钠的冰浴中冷却。②在冰浴中加入随机六核苷酸引物2μL，dNTP 2μL,Klenow酶1μL.③充分混合，以1 000r/min离心5s，37℃孵育20h.④加入0.2mol/L EDTA(pH 8.0)2μL终止标记反应。⑤加入4mol/L 氯化锂和75μL乙醇(-20℃预冷)，充分混合沉淀标记DNA.⑥-70℃下放置1h.⑦微量离心机离心15min，以预冷的体积分数0.7的乙醇50μL洗涤沉淀。⑧空气中干燥，溶于50μL的TE缓冲液中。
1.1.6 探针标记效率的检测 ①将标记反应物稀释至大约1mg/L.②以1∶5(V∶V)稀释标记的标准DNA至1mg/L.③将上述反应物(V∶V)系列稀释,分别为1∶5,1∶10,1∶20,1∶40.④以加样器将上述系列稀释液(0.1～10.0μg/L)于硝酸纤维素膜上点样(每点1μL)。⑤空气中晾干后，80℃烤膜2h，缓冲液Ⅰ浸膜5min，缓冲液Ⅱ孵育30min.⑥以缓冲液Ⅱ稀释地高辛抗体(1∶10 000,V∶V)，37℃孵育30min.⑦以缓冲液Ⅰ洗膜2×15min，以缓冲液Ⅲ平衡5min.⑧加入显色剂，避光显色2h，显色满意后，双蒸水洗涤5min.⑨以标准DNA标记系列稀释度估算cDNA，标记效率约为50mg/L.
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1.2 大鼠听源性癫痫模型的建立
1.2.1 实验分组 实验选用遗传性听源性癫痫易感大鼠(P77PMC，雄性，由北京医科大学实验动物部提供)。随机分为两组：①癫痫未发作组(5只,做对照)，不给予铃声刺激；②癫痫发作1次组(5只)。
1.2.2 模型建立 将大鼠置于80cm×60cm×60cm的透明隔音箱内，以100dB铃声刺激60s，诱发癫痫。表现为狂奔20～30s，经10～20s间歇期，再次狂奔10～20s，继之全身抽搐，角弓反张，40～60s后抽搐停止。
1.3 CCK-cDNA探针原位杂交步骤〔3〕
1.3.1 取材和切片 所有实验大鼠于癫痫发作结束后,均以300mg/kg体质量水合氯醛麻醉。开胸主动脉插管，剪开右心房，首先灌流50mL灭菌生理盐水，然后灌流体积分数分别为0.04和0.003的多聚甲醛饱和苦味酸混合液250mL.灌流维持20min，之后取出大脑，在同一固定液中再固定6h.然后浸入0.58mol/L蔗糖PBS至组织块下沉。脑组织以OCT包埋，冰冻切片机切片，切片厚20μm，置PBS缓冲的体积分数为0.04的多聚甲醛中固定10min，37℃恒温箱干燥4h，-70℃保存。
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1.3.2 杂交、杂交后冲洗及显色 ①预杂交液配制：0.1g/L聚蔗糖、0.1g/L BSA,0.1g/L聚乙烯吡咯烷酮、2×SSC,100g/L硫酸葡聚糖、50mmol/L Tris-HCl(pH7.2),0.4g/L鲑鱼精子DNA和11.1mol/L甲酰胺配成预杂交液，42℃孵育2h.②杂交:杂交液中加入Dig-标记的cDNA探针(终质量浓度为2mg/L)，探针杂交液煮沸10min，迅速置冰中，小心吸除切片上的预杂交液，立即加入30μL探针杂交液，小心覆以盖玻片，封口膜封闭，42℃杂交16h.试剂均以DEPC处理的双蒸水配制。③杂交后的洗涤与显色：2×SSC，40℃，5min×4；0.1×SSC，40℃，30min×2；缓冲液Ⅰ，25℃，水平振荡5min；缓冲液Ⅱ，25℃，水平振荡30min；地高辛抗体(1∶500,V∶V)37℃孵育2h；缓冲液Ⅰ洗涤，15min×2；缓冲液Ⅲ洗涤3min；NBT/BCIP避光显色2min；缓冲液Ⅰ中5min；缓冲液Ⅳ中2min中止显色；体积分数为1的乙醇脱水15min×2；二甲苯透明15min×3；中性树胶封片。
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2 结果
2.1 癫痫未发作组大鼠脑内CCK-mRNA的表达
癫痫未发作组大鼠脑内CCK-mRNA表达较低，阳性细胞仅见于额顶叶皮层及背海马本部，数量较少，胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物量少，着色浅，与背景反差小，胞体直径约10～30μm；细胞以椭圆形为主，偶见圆形和锥体形细胞。
2.2 癫痫发作组大鼠脑内CCK-mRNA的表达
癫痫发作1次的大鼠，大脑皮层和边缘系统CCK-mRNA表达较癫痫未发作组显著增高。大脑皮层的颞叶、额顶叶、枕叶，海马的CA1～CA4区、齿状回以及杏仁核内均可见大量的CCK-mRNA阳性细胞，细胞着色深，轮廓清楚，与背景对比清晰，反差明显。胞质内充满蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物，胞核常被密集的酶反应产物所掩盖。细胞形态以圆形或卵圆形为主，部分呈锥体形。胞体大小不等，直径约10～50μm.皮层内CCK-mRNA阳性胞体主要分布在Ⅱ～Ⅲ层和Ⅴ～Ⅵ层，并以颞叶CCK-mRNA表达最为显著。海马内CCK-mRNA阳性胞体在CA1～CA4区及齿状回都有明显的分布，以多形层、颗粒层、锥体层含量较多。
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3 讨论
大鼠CCK前体的互补DNA是由Robert等〔4〕1984年首先克隆并完成测序工作。他们从含有高水平CCK的大鼠甲状腺癌髓质中分离出多聚RNA，并以此为模板合成双链cDNA，插入到pBR322的PstⅠ位点，得到含有CCK-cDNA的重组克隆。根据猪CCK-8的氨基酸序列Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2,制成杂交用探针d(T-C-C-A-T-C-C-A-N-C-C-C-A-T-G-T-A-G-T-C)，通过杂交证实此克隆含有CCK-cDNA，与CCK前体mRNA互补。此cDNA的5′端含有33个核苷酸的非编码区，3′端含有199个核苷酸的非编码区，另外345个核苷酸编码CCK前体(115个氨基酸)。本实验所用质粒PUC13即由Jack实验室提供，酶切后得到的cDNA片段经与DNA标准分子相对质量参照物电泳对比，与预计的相同，说明本实验得到的CCK-cDNA是可靠的。
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本实验为CCK的研究提供了一种经济实用的探针制备方法。对CCK-mRNA进行核酸杂交研究，国内外最常用的是同位素标记探针，其优越性是检测灵敏度高，但其放射性对实验者的危害大。随后出现了生物素标记探针，但其灵敏性和特异性都较差〔5，6〕。本实验使用一种新的非同位素标记技术，即地高辛精标记DNA探针。地高辛精是一种甾族半抗原复合物，借助于一交联臂连接到dUTP上，带有地高辛精标记的dUTP可作为酶的底物渗入DNA，从而合成地高辛精标记探针。在与靶DNA进行碱基互补同源系列结合形成杂交产物后，通过酶联免疫法与抗体复合物(抗地高辛精碱性磷酸酶复合物：Dig-AP)结合，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)及硝基氮蓝四唑盐(NBT)的存在下，进行酶促显色反应达到检测目的。地高辛精标记的核酸探针具有省时，无放射性污染，探针稳定，保存期长，灵敏度不低于放射性同位素等优点。本实验所制探针Dig-CCK-cDNA，灵敏度达50 mg/L，且重复性好。
经原位杂交显示,遗传性听源性癫痫易感大鼠在癫痫未发作时，大脑皮层和海马中CCK-mRNA阳性神经元数量少,着色浅,而在1次癫痫发作后的较短时间内(<10min)，大脑皮层和边缘系统内的CCK-mRNA表达就显著增加,表现为CCK-mRNA阳性神经元数量明显增多,着色加深,且体积增大,表明CCK参与了癫痫发作过程。
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总之，本实验应用随机引物标记法得到Dig-CCK-cDNA探针，该探针具有较好的特异性和灵敏度，为CCK分子机制研究提供了有力工具。原位杂交实验证实，大脑皮层及海马CCK-mRNA阳性神经元参与了癫痫发作过程。
本文为山东省科委科研基金资助课题〔鲁卫科教字(1994)第20号文〕
参考文献
1 Crawley JN,Corwin RL.Biological actions of cholecystokinin.Peptides,1994，15(4):731
2 王申五.DNA的制备、回收与标记.见:王申五主编.基因诊断技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992.36
3 苏慧慈.组织切片上的原位杂交步骤.见：苏慧慈主编. 原位杂交. 北京:科学出版社，1994.31
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4 Robert J, Lori J, Randy S, et al. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat preprocholecystokinin. Proc Natl Acad Sci USA,1984，81(2):726
5 Beinfeld MC. Cholecystokinin in the central nervous system:a mimireview. Neuropeptides, 1983,3:411
6 Iadarola MJ, Narango JR, Duchemin AM, et al. Expression of cholecystokinin and encephalin mRNA in discrete brain regions. Peptides,1989,10:687
(1998-12-22收稿 1999-06-30修回), 百拇医药
单位：青岛医学院(青岛 266021)倪宏 唐明 徐珞 生理学教研室；吕振华 附属医院骨科研究室
关键词：缩胆囊素；DNA；探针；原位杂交；地高辛精；大鼠
青岛医学院学报990302 【摘要】 ①目的 制备胆囊收缩素(CCK)cDNA探针，并以此探针检测遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内CCK-mRNA表达。②方法 将含0.5kbp Rat CCK-mRNA的质粒PUC13扩增、回收和纯化，用随机引物标记法，得到地高辛精(Dig)标记CCK-cDNA探针。用原位杂交技术,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层CCK-mRNA表达进行研究。③结果 CCK-cDNA探针标记效率为50mg/L；遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内CCK-mRNA表达显著增加。④结论 本实验制备的Dig-CCK-cDNA探针，具有较好的特异性和灵敏度；原位杂交实验证实，CCK参与了癫痫发作过程。
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PURIFICATION OF CHOLECYSTOKININ cDNA PROBE AND ITS APPLICATION IN THE MECHANISM STUDY OF EPILEPSY
Ni Hong, Tang Ming, Xu Luo, et al
Department of Physiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To prepare cholecystokinin(CCK) cDNA probe and to explore CCK-mRNA expression with the probe in hereditary audiogenic epilepsy susceptible rat brain after epilepsy seizure. Methods Plasmid PUC13 containing 0.5 kbp Rat CCK-mRNA was amplified, retrieved and purified. CCK-cDNA probe was labelled with digoxigenin by random priming. CCK-mRNA expressions in rat hippocampus and cerebral cortex after epilepsy seizure were studied by in situ hybridization. Results The labelling rate of CCK-cDNA probe was 50mg/L. The CCK-mRNA expression was significantly increased after epilepsy seizure in hereditary audiogenic epilepsy susceptible rat. Conclusion Dig-CCK-cDNA probe obtained in this study had good specificity and sensitivity. In situ hybridization study proved that CCK was involved in the process of epilepsy seizure.
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【KEY WORDS】 cholecystokinin; DNA probes; in situ hybridization; digoxingenin; rat
胆囊收缩素(CCK)是脑内一种重要的神经肽，具有胃肠道激素和中枢调节双重作用〔1〕。CCK参与机体多种生理机能的调控，主要有摄食、镇痛、情绪、学习记忆和锥体外系的躯体运动等。CCK与某些神经精神性疾病如癫痫、帕金森病、焦虑、抑郁、精神分裂症等的发病也有密切关系。近年来，随着分子生物学技术的建立和发展，人们对CCK生理作用的分子机制进行了大量研究。近10年来,我室对CCK调节摄食和胃运动的机制作了电生理和放射免疫等方面的系列研究工作，但是，由于探针价格昂贵，限制了我们对CCK生物作用的分子机制进行更加深入的探讨。本实验通过对PUC13质粒(含有577bp的CCK-cDNA)的转化、扩增、提取及检测，得到地高辛精标记CCK-cDNA探针，并用原位杂交方法,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层CCK-mRNA表达进行研究，从而使我们对CCK的系列研究工作达到分子水平。
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1 材料与方法
1.1 CCK-cDNA 探针的制备〔2〕
1.1.1 质粒的转化 质粒PUC13来自Jack ED实验室，含有0.5kbp Rat CCK-cDNA的质粒，其中第34～381核苷酸序列编码为CCK前体，169～225核苷酸序列编码为CCK58，226～243核苷酸序列编码为CCK39，244～306核苷酸序列编码为CCK33，307～318核苷酸序列编码为CCK12，319～378核苷酸序列编码为CCK8，重组位点分别为EcoRⅠ和Hind Ⅲ.采用氯化钙法进行质粒的转化，转化所用工程菌为HB101.
1.1.2 质粒PUC13的制备 采用碱裂解法大量制备质粒,以紫外分光光度计测定A260/A280，得质粒DNA，含量约为300mg/L.于-20℃储存。
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1.1.3 插入片段的酶切 ①取PUC13质粒DNA 250μL(约31μg)，10×Buffer B 30μL,EcoRⅠ20U(16μL), Hind Ⅲ 28U(4μL),加三蒸水至300μL,混匀后于37℃放置3h；②取反应体系液5μL，加6×上样缓冲液1μL，微电泳，紫外法检测酶切完全,得约0.5kbp和2.7kbp两个片段。
1.1.4 酶切CCK-cDNA片段的回收 ①酶反应体系中加入6×上样缓冲液，7g/L琼脂糖电泳，300nm波长紫外灯下小心切取含有插入片段的琼脂糖凝胶块。②置于“Ⅴ”型电泳槽的凹槽，凹槽中加入高盐缓冲液,其组成为:7.5mol/L乙酸铵,体积分数0.01的甘油,1mol/L Tris(pH 7.8)和少量溴酚蓝。③100V电泳1h，紫外灯下观察，凝胶块上DNA全部移出，停止电泳，回收高盐缓冲液。④高盐缓冲液以等量水饱和酚抽提，水相加两倍体积的无水乙醇，-70℃下30min.⑤4℃下12 000r/min离心10min，15.2mol/L乙醇洗涤2次，空气中干燥，加TE 50μL溶解DNA，微电泳检测定量。
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1.1.5 cDNA探针的标记(Dig-随机引物标记)参照Boehringer公司使用手册:①以上述回收的CCK-cDNA片段约1.5μg作为模板，稀释至15μL，煮沸10min，迅速置于含0.86mol/L氯化钠的冰浴中冷却。②在冰浴中加入随机六核苷酸引物2μL，dNTP 2μL,Klenow酶1μL.③充分混合，以1 000r/min离心5s，37℃孵育20h.④加入0.2mol/L EDTA(pH 8.0)2μL终止标记反应。⑤加入4mol/L 氯化锂和75μL乙醇(-20℃预冷)，充分混合沉淀标记DNA.⑥-70℃下放置1h.⑦微量离心机离心15min，以预冷的体积分数0.7的乙醇50μL洗涤沉淀。⑧空气中干燥，溶于50μL的TE缓冲液中。
1.1.6 探针标记效率的检测 ①将标记反应物稀释至大约1mg/L.②以1∶5(V∶V)稀释标记的标准DNA至1mg/L.③将上述反应物(V∶V)系列稀释,分别为1∶5,1∶10,1∶20,1∶40.④以加样器将上述系列稀释液(0.1～10.0μg/L)于硝酸纤维素膜上点样(每点1μL)。⑤空气中晾干后，80℃烤膜2h，缓冲液Ⅰ浸膜5min，缓冲液Ⅱ孵育30min.⑥以缓冲液Ⅱ稀释地高辛抗体(1∶10 000,V∶V)，37℃孵育30min.⑦以缓冲液Ⅰ洗膜2×15min，以缓冲液Ⅲ平衡5min.⑧加入显色剂，避光显色2h，显色满意后，双蒸水洗涤5min.⑨以标准DNA标记系列稀释度估算cDNA，标记效率约为50mg/L.
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1.2 大鼠听源性癫痫模型的建立
1.2.1 实验分组 实验选用遗传性听源性癫痫易感大鼠(P77PMC，雄性，由北京医科大学实验动物部提供)。随机分为两组：①癫痫未发作组(5只,做对照)，不给予铃声刺激；②癫痫发作1次组(5只)。
1.2.2 模型建立 将大鼠置于80cm×60cm×60cm的透明隔音箱内，以100dB铃声刺激60s，诱发癫痫。表现为狂奔20～30s，经10～20s间歇期，再次狂奔10～20s，继之全身抽搐，角弓反张，40～60s后抽搐停止。
1.3 CCK-cDNA探针原位杂交步骤〔3〕
1.3.1 取材和切片 所有实验大鼠于癫痫发作结束后,均以300mg/kg体质量水合氯醛麻醉。开胸主动脉插管，剪开右心房，首先灌流50mL灭菌生理盐水，然后灌流体积分数分别为0.04和0.003的多聚甲醛饱和苦味酸混合液250mL.灌流维持20min，之后取出大脑，在同一固定液中再固定6h.然后浸入0.58mol/L蔗糖PBS至组织块下沉。脑组织以OCT包埋，冰冻切片机切片，切片厚20μm，置PBS缓冲的体积分数为0.04的多聚甲醛中固定10min，37℃恒温箱干燥4h，-70℃保存。
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1.3.2 杂交、杂交后冲洗及显色 ①预杂交液配制：0.1g/L聚蔗糖、0.1g/L BSA,0.1g/L聚乙烯吡咯烷酮、2×SSC,100g/L硫酸葡聚糖、50mmol/L Tris-HCl(pH7.2),0.4g/L鲑鱼精子DNA和11.1mol/L甲酰胺配成预杂交液，42℃孵育2h.②杂交:杂交液中加入Dig-标记的cDNA探针(终质量浓度为2mg/L)，探针杂交液煮沸10min，迅速置冰中，小心吸除切片上的预杂交液，立即加入30μL探针杂交液，小心覆以盖玻片，封口膜封闭，42℃杂交16h.试剂均以DEPC处理的双蒸水配制。③杂交后的洗涤与显色：2×SSC，40℃，5min×4；0.1×SSC，40℃，30min×2；缓冲液Ⅰ，25℃，水平振荡5min；缓冲液Ⅱ，25℃，水平振荡30min；地高辛抗体(1∶500,V∶V)37℃孵育2h；缓冲液Ⅰ洗涤，15min×2；缓冲液Ⅲ洗涤3min；NBT/BCIP避光显色2min；缓冲液Ⅰ中5min；缓冲液Ⅳ中2min中止显色；体积分数为1的乙醇脱水15min×2；二甲苯透明15min×3；中性树胶封片。
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2 结果
2.1 癫痫未发作组大鼠脑内CCK-mRNA的表达
癫痫未发作组大鼠脑内CCK-mRNA表达较低，阳性细胞仅见于额顶叶皮层及背海马本部，数量较少，胞质内蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物量少，着色浅，与背景反差小，胞体直径约10～30μm；细胞以椭圆形为主，偶见圆形和锥体形细胞。
2.2 癫痫发作组大鼠脑内CCK-mRNA的表达
癫痫发作1次的大鼠，大脑皮层和边缘系统CCK-mRNA表达较癫痫未发作组显著增高。大脑皮层的颞叶、额顶叶、枕叶，海马的CA1～CA4区、齿状回以及杏仁核内均可见大量的CCK-mRNA阳性细胞，细胞着色深，轮廓清楚，与背景对比清晰，反差明显。胞质内充满蓝黑色斑块状碱性磷酸酶反应产物，胞核常被密集的酶反应产物所掩盖。细胞形态以圆形或卵圆形为主，部分呈锥体形。胞体大小不等，直径约10～50μm.皮层内CCK-mRNA阳性胞体主要分布在Ⅱ～Ⅲ层和Ⅴ～Ⅵ层，并以颞叶CCK-mRNA表达最为显著。海马内CCK-mRNA阳性胞体在CA1～CA4区及齿状回都有明显的分布，以多形层、颗粒层、锥体层含量较多。
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3 讨论
大鼠CCK前体的互补DNA是由Robert等〔4〕1984年首先克隆并完成测序工作。他们从含有高水平CCK的大鼠甲状腺癌髓质中分离出多聚RNA，并以此为模板合成双链cDNA，插入到pBR322的PstⅠ位点，得到含有CCK-cDNA的重组克隆。根据猪CCK-8的氨基酸序列Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2,制成杂交用探针d(T-C-C-A-T-C-C-A-N-C-C-C-A-T-G-T-A-G-T-C)，通过杂交证实此克隆含有CCK-cDNA，与CCK前体mRNA互补。此cDNA的5′端含有33个核苷酸的非编码区，3′端含有199个核苷酸的非编码区，另外345个核苷酸编码CCK前体(115个氨基酸)。本实验所用质粒PUC13即由Jack实验室提供，酶切后得到的cDNA片段经与DNA标准分子相对质量参照物电泳对比，与预计的相同，说明本实验得到的CCK-cDNA是可靠的。
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本实验为CCK的研究提供了一种经济实用的探针制备方法。对CCK-mRNA进行核酸杂交研究，国内外最常用的是同位素标记探针，其优越性是检测灵敏度高，但其放射性对实验者的危害大。随后出现了生物素标记探针，但其灵敏性和特异性都较差〔5，6〕。本实验使用一种新的非同位素标记技术，即地高辛精标记DNA探针。地高辛精是一种甾族半抗原复合物，借助于一交联臂连接到dUTP上，带有地高辛精标记的dUTP可作为酶的底物渗入DNA，从而合成地高辛精标记探针。在与靶DNA进行碱基互补同源系列结合形成杂交产物后，通过酶联免疫法与抗体复合物(抗地高辛精碱性磷酸酶复合物：Dig-AP)结合，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)及硝基氮蓝四唑盐(NBT)的存在下，进行酶促显色反应达到检测目的。地高辛精标记的核酸探针具有省时，无放射性污染，探针稳定，保存期长，灵敏度不低于放射性同位素等优点。本实验所制探针Dig-CCK-cDNA，灵敏度达50 mg/L，且重复性好。
经原位杂交显示,遗传性听源性癫痫易感大鼠在癫痫未发作时，大脑皮层和海马中CCK-mRNA阳性神经元数量少,着色浅,而在1次癫痫发作后的较短时间内(<10min)，大脑皮层和边缘系统内的CCK-mRNA表达就显著增加,表现为CCK-mRNA阳性神经元数量明显增多,着色加深,且体积增大,表明CCK参与了癫痫发作过程。
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总之，本实验应用随机引物标记法得到Dig-CCK-cDNA探针，该探针具有较好的特异性和灵敏度，为CCK分子机制研究提供了有力工具。原位杂交实验证实，大脑皮层及海马CCK-mRNA阳性神经元参与了癫痫发作过程。
本文为山东省科委科研基金资助课题〔鲁卫科教字(1994)第20号文〕
参考文献
1 Crawley JN,Corwin RL.Biological actions of cholecystokinin.Peptides,1994，15(4):731
2 王申五.DNA的制备、回收与标记.见:王申五主编.基因诊断技术.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992.36
3 苏慧慈.组织切片上的原位杂交步骤.见：苏慧慈主编. 原位杂交. 北京:科学出版社，1994.31
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4 Robert J, Lori J, Randy S, et al. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat preprocholecystokinin. Proc Natl Acad Sci USA,1984，81(2):726
5 Beinfeld MC. Cholecystokinin in the central nervous system:a mimireview. Neuropeptides, 1983,3:411
6 Iadarola MJ, Narango JR, Duchemin AM, et al. Expression of cholecystokinin and encephalin mRNA in discrete brain regions. Peptides,1989,10:687
(1998-12-22收稿 1999-06-30修回), 百拇医药