中药黄柏的光敏抗癌作用研究
作者：廖静 鄂征 宁涛 聂毓秀 陈玉兰
单位：廖静 首都医科大学病理解剖学教研室；鄂征 宁涛北京肿瘤研究所遗传室；聂毓秀 陈玉兰白求恩医科大学组胚教研室
关键词：中药黄柏；光敏抗癌；细胞学机制
首都医科大学学报/990301 提要： 以BGC823人胃癌细胞为实验材料，研究黄柏在480 nm和650 nm光照下对癌细胞的光敏作用。结果：黄柏加药照光组对癌细胞生长、癌细胞噻唑蓝代谢活力均有光敏抑制效应。同时，黄柏实验组癌细胞酸性磷酸酶含量明显减少(P<0.01)，癌细胞3H-TdR掺入量显著降低(P<0.01)，100 mL/L黄柏对染色体并无光敏致粘连畸变作用，但能延缓S期细胞周期过程(P<0.01)。透射电镜发现：10 mL/L和100 mL/L黄柏使实验组细胞线粒体、内质网广泛肿胀、扩张，细胞核糖体明显减少。提示黄柏对BGC823人胃癌细胞的确具有光敏抑制效应。
, http://www.100md.com
中图分类号： R730.52
中药黄柏临床上常用作抗癌药[1]。在对中草药抗癌光敏剂的筛选中，发现黄柏提取液具有较强荧光性[2]。本实验进一步探讨了黄柏对BGC823人胃癌细胞是否有光动力学杀伤效应及其细胞学机制，为中草药在肿瘤光动力学疗法(PDT)领域中的应用提供参考。
Photosensitive Anticancer Studies on
Chinese Medicine Cortex Phellodendri
Liao Jing
Department of Pathology, Capital University of Medical Sciences
, http://www.100md.com
E Zheng, Ning Tao
Beijing Institute for Cancer Research
Nie Yuxiu, Chen Yulan
Norman Bethune University of Medical Sciences
Abstract:BGC823 human stomach cancer cells were cultured for the identification of photodynamic effects of Cortex phellodendri with illumination of 480 nm and 650 nm wave length. In the test groups with illumination, the herb extract diminished cell growth curve and the metabolism of 3-(4,5-dimethylthiazo1-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT). Futhermore, the significant decrease of the acid phosphatase (P<0.01) and the incorporation of 3H-TdR into cells (P<0.01) were demonstrated in the test groups.The progression of cancer cell cycle was postponed in S-phase(P<0.01) by the herb of 100 mL/L,but no chromosome adhering aberration appeared. The ultrastructural appearances showed that in the test groups, the mitochondria and the rough endoplasmic reticula of the cells became swollen and vesiculate and the ribosomes decreased.The result showed that Chineses medicine Cortex phellodendri has photosensitive effects on the cancer cells.
, http://www.100md.com
Key words: Chinese medicine Cortex phellodendri; photosensitive anticancer; cytological mechanism
1 材料和方法
黄柏提取液的制备方法和浓度确定见文献[2]。
常规培养BGC823人胃癌细胞(由北京医科大学附属人民医院提供)。
光敏实验条件和实验处理：实验组：加药照光；对照组：加药不照光。染色体观察另设空白对照组。光波长：480 nm和650 nm，其他同参考文献[2]。
观察指标和取材：①噻唑蓝(MTT)代谢比色法[2，3]：以了解癌细胞代谢活力状态，细胞在光敏化后24 h和48 h分别取材检测。②癌细胞生长曲线：按常规观察7 d。③癌细胞3H-TdR掺入量脉冲值测定(美国产Backman LS 3801液闪仪)：细胞光敏化后24 h取材。④染色体观察：对M期、S期癌细胞行光敏实验后，前者立刻按常规收集染色体，后者8 h后收集染色体、并滴片观察。⑤酸性磷酸酶(ACP)和琥珀酸脱氢酶染色：连续观察3 d。⑥透射电镜(JEM 100CX-Ⅱ型，日本产)观察：光敏实验后72 h取材观察。
, http://www.100md.com
统计学方法：染色体观察结果用方差分析，3H-TdR掺入量测定用t检验，酶染色观察结果用χ2检验。
2 结果
2.1 黄柏的光动力学效应
在480 nm波长光照下，4 mL/L黄柏使光敏化后24 h的BGC823细胞MTT代谢OD值百分率降低了32%，随着药物体积浓度增高和作用时间延长，这种光敏抑制效应更明显。到48 h，1～100 mL/L黄柏均使MTT的OD明显下降。650 nm光照下，BGC823细胞光敏化后24 h，10 mL/L黄柏使MTT的OD值明显降低，48 h时，所有体积浓度的黄柏均导致细胞MTT的OD值明显下降(图1、2)。
图1 BGC823人胃癌细胞光敏化后24 h噻唑蓝代谢
图2 BGC823人胃癌细胞光敏化后48 h噻唑蓝代谢
, 百拇医药
4 mL/L黄柏对BGC823细胞光敏化后第3～7天生长抑制率达37.1%～66.6%(图3)。
图3 BGC823人胃癌细胞生长曲线
2.2 黄柏对癌细胞核的影响
实验组BGC823细胞光敏化后24 h，3H-TdR掺入脉冲值百分率较对照组显著降低(P<0.01，表1)。
表1 黄柏对BGC823细胞3H-TdR掺入光敏抑制作用 ρ(黄柏)/
(mL.L-1)
3H-TdR掺入量脉冲值/%
P值
, http://www.100md.com
不照光
照光
4
102
48.9
<0.01
10
108
41.7
<0.01
100
101
36.5
, http://www.100md.com
<0.01
染色体观察：对M期BGC823细胞进行光敏实验，证明黄柏10 mL/L和100 mL/L时，均未导致染色体粘连的光敏损伤，实验组和对照组染色体分散均好。S期BGC823细胞在光敏实验8 h后，染色体也未见粘连现象。但100 mL/L黄柏组进入中期分裂细胞为16%，较对照组(29%)明显减少(P<0.01)。
2.3 组织化学观察
ACP染色：光敏实验后3个不同时期取材，都发现实验组癌细胞ACP阳性细胞百分率显著下降(P<0.01，表2)。
表2 黄柏对BGC823细胞ACP光敏抑制作用 ρ(黄柏)/
(mL.L-1)
, 百拇医药 t取材/
h
不照光
照光
+
2+
总阳性率
+
2+
总阳性率
%
4
0
, 百拇医药 10.0
30.1
40.1
9.5
7.1
16.6
24
14.8
45.5
60.3
3.8
4.1
7.9
, 百拇医药
72
13.8
77.2
91.0
10.6
22.5
33.1
10
0
13.2
12.7
25.8
3.1
, http://www.100md.com
1.8
4.9
6
18.2
38.7
56.9
0.6
0.5
1.1
24
13.8
34.7
48.6
, http://www.100md.com
0.5
0.3
0.8
72
13.4
56.5
69.8
6.1
8.4
14.5
**与不照光组比较P<0.01
琥珀酸脱氢酶染色：连续3 d的染色观察，实验组与对照组未见明显差异。2组细胞胞浆均见有广泛分布的酶染阳性的紫色小棒状或颗粒状物。
, 百拇医药
2.4 透射电镜观察
10 mL/L和100 mL/L黄柏对癌细胞超微结构有相似的影响。实验组均可见细胞内核糖颗粒明显减少，胞浆电子密度明显降低；线粒体嵴变少变形，线粒体肿胀甚至束泡变；粗面内质网明显扩张；核异染色质减少。此外，实验组细胞张力微丝明显减少。相比之下，100 mL/L黄柏导致细胞的这些损伤更明显。4 mL/L黄柏组细胞变化不明显。
3 讨论
本实验结果显示：黄柏在加药照光条件下，能使癌细胞的噻唑蓝代谢、癌细胞的生长均明显或持续性降低，提示黄柏对人癌细胞的确具有光动力学抑制效应。
黄柏在15～30 min内就能被活细胞摄取，并广泛分布到胞浆、胞核[2]。本实验进一步观察到黄柏在细胞潴留的部位造成相应的光敏损伤。在胞浆，黄柏使癌细胞线粒体、内质网肿胀扩张，证明黄柏光敏作用的重点靶部位与血卟啉一致，仍是生物膜[4]。此外，实验组ACP受抑制(P<0.01)也可能涉及溶酶体膜损伤，继而溶酶体崩解导致细胞死亡。然而琥珀酸脱氢酶在实验组和对照组未见明显差异，说明线粒体在黄柏体积浓度为10 mL/L时，其损伤以肿胀为特点，却仍能维持一定程度代谢，暂时不足以造成整个细胞线粒体功能受阻的趋势。
, 百拇医药
据报道荧光剂吖啶橙使人肝癌细胞光敏化后，细胞的染色体发生粘连变性，从而导致分裂障碍[5]。本实验对M期S期细胞加药照光后，细胞染色体均未见粘连变性，且分散好。但黄柏100 mL/L组光敏化的S期细胞能重新分裂的细胞百分率显著降低(P<0.01)。同时，液闪仪测定实验组癌细胞的3H-TdR掺入脉冲值明显低于对照组(P<0.01)，从DNA合成受阻角度，再次证明黄柏对BGC823细胞S期有明显的光动力学抑制效应。
临床上光动力学疗法广泛用于体表、体腔或消化道肿瘤的治疗，而这些部位与黄柏抗癌作用的部位有些一致性。因此，在病人服用黄柏抗癌时，如对局部瘤组织照光，会有利于达到肿瘤综合治疗的最佳效果。
参考文献
1.胡月英,宣明盛.云南抗癌中草药.昆明:云南人民出版社,1982.56～57
, http://www.100md.com
2.廖静,李萍萍,武陆静,等.中草药光敏剂的筛选及对人胃癌细胞系光动力学杀伤效应的研究.中国中西医结合杂志,1997,17(12):726～729
3.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55～63
4.Milanesi C, Sorgato F, Jori G. Photokinetic and ultrastructural studies on porphyrin photosensitizationof Hela cells. Int J Radiat Biol,1989,55(1):59～69
5.柯杨,鄂征,陈泉光,等.吖啶橙激光光敏化对离体培养肝癌细胞系的生物学效应.实验生物学报,1983,16(4):397～407
收稿日期：1998-06-19, 百拇医药
单位：廖静 首都医科大学病理解剖学教研室；鄂征 宁涛北京肿瘤研究所遗传室；聂毓秀 陈玉兰白求恩医科大学组胚教研室
关键词：中药黄柏；光敏抗癌；细胞学机制
首都医科大学学报/990301 提要： 以BGC823人胃癌细胞为实验材料，研究黄柏在480 nm和650 nm光照下对癌细胞的光敏作用。结果：黄柏加药照光组对癌细胞生长、癌细胞噻唑蓝代谢活力均有光敏抑制效应。同时，黄柏实验组癌细胞酸性磷酸酶含量明显减少(P<0.01)，癌细胞3H-TdR掺入量显著降低(P<0.01)，100 mL/L黄柏对染色体并无光敏致粘连畸变作用，但能延缓S期细胞周期过程(P<0.01)。透射电镜发现：10 mL/L和100 mL/L黄柏使实验组细胞线粒体、内质网广泛肿胀、扩张，细胞核糖体明显减少。提示黄柏对BGC823人胃癌细胞的确具有光敏抑制效应。
, http://www.100md.com
中图分类号： R730.52
中药黄柏临床上常用作抗癌药[1]。在对中草药抗癌光敏剂的筛选中，发现黄柏提取液具有较强荧光性[2]。本实验进一步探讨了黄柏对BGC823人胃癌细胞是否有光动力学杀伤效应及其细胞学机制，为中草药在肿瘤光动力学疗法(PDT)领域中的应用提供参考。
Photosensitive Anticancer Studies on
Chinese Medicine Cortex Phellodendri
Liao Jing
Department of Pathology, Capital University of Medical Sciences
, http://www.100md.com
E Zheng, Ning Tao
Beijing Institute for Cancer Research
Nie Yuxiu, Chen Yulan
Norman Bethune University of Medical Sciences
Abstract:BGC823 human stomach cancer cells were cultured for the identification of photodynamic effects of Cortex phellodendri with illumination of 480 nm and 650 nm wave length. In the test groups with illumination, the herb extract diminished cell growth curve and the metabolism of 3-(4,5-dimethylthiazo1-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT). Futhermore, the significant decrease of the acid phosphatase (P<0.01) and the incorporation of 3H-TdR into cells (P<0.01) were demonstrated in the test groups.The progression of cancer cell cycle was postponed in S-phase(P<0.01) by the herb of 100 mL/L,but no chromosome adhering aberration appeared. The ultrastructural appearances showed that in the test groups, the mitochondria and the rough endoplasmic reticula of the cells became swollen and vesiculate and the ribosomes decreased.The result showed that Chineses medicine Cortex phellodendri has photosensitive effects on the cancer cells.
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Key words: Chinese medicine Cortex phellodendri; photosensitive anticancer; cytological mechanism
1 材料和方法
黄柏提取液的制备方法和浓度确定见文献[2]。
常规培养BGC823人胃癌细胞(由北京医科大学附属人民医院提供)。
光敏实验条件和实验处理：实验组：加药照光；对照组：加药不照光。染色体观察另设空白对照组。光波长：480 nm和650 nm，其他同参考文献[2]。
观察指标和取材：①噻唑蓝(MTT)代谢比色法[2，3]：以了解癌细胞代谢活力状态，细胞在光敏化后24 h和48 h分别取材检测。②癌细胞生长曲线：按常规观察7 d。③癌细胞3H-TdR掺入量脉冲值测定(美国产Backman LS 3801液闪仪)：细胞光敏化后24 h取材。④染色体观察：对M期、S期癌细胞行光敏实验后，前者立刻按常规收集染色体，后者8 h后收集染色体、并滴片观察。⑤酸性磷酸酶(ACP)和琥珀酸脱氢酶染色：连续观察3 d。⑥透射电镜(JEM 100CX-Ⅱ型，日本产)观察：光敏实验后72 h取材观察。
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统计学方法：染色体观察结果用方差分析，3H-TdR掺入量测定用t检验，酶染色观察结果用χ2检验。
2 结果
2.1 黄柏的光动力学效应
在480 nm波长光照下，4 mL/L黄柏使光敏化后24 h的BGC823细胞MTT代谢OD值百分率降低了32%，随着药物体积浓度增高和作用时间延长，这种光敏抑制效应更明显。到48 h，1～100 mL/L黄柏均使MTT的OD明显下降。650 nm光照下，BGC823细胞光敏化后24 h，10 mL/L黄柏使MTT的OD值明显降低，48 h时，所有体积浓度的黄柏均导致细胞MTT的OD值明显下降(图1、2)。
图1 BGC823人胃癌细胞光敏化后24 h噻唑蓝代谢
图2 BGC823人胃癌细胞光敏化后48 h噻唑蓝代谢
, 百拇医药
4 mL/L黄柏对BGC823细胞光敏化后第3～7天生长抑制率达37.1%～66.6%(图3)。
图3 BGC823人胃癌细胞生长曲线
2.2 黄柏对癌细胞核的影响
实验组BGC823细胞光敏化后24 h，3H-TdR掺入脉冲值百分率较对照组显著降低(P<0.01，表1)。
表1 黄柏对BGC823细胞3H-TdR掺入光敏抑制作用 ρ(黄柏)/
(mL.L-1)
3H-TdR掺入量脉冲值/%
P值
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不照光
照光
4
102
48.9
<0.01
10
108
41.7
<0.01
100
101
36.5
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<0.01
染色体观察：对M期BGC823细胞进行光敏实验，证明黄柏10 mL/L和100 mL/L时，均未导致染色体粘连的光敏损伤，实验组和对照组染色体分散均好。S期BGC823细胞在光敏实验8 h后，染色体也未见粘连现象。但100 mL/L黄柏组进入中期分裂细胞为16%，较对照组(29%)明显减少(P<0.01)。
2.3 组织化学观察
ACP染色：光敏实验后3个不同时期取材，都发现实验组癌细胞ACP阳性细胞百分率显著下降(P<0.01，表2)。
表2 黄柏对BGC823细胞ACP光敏抑制作用 ρ(黄柏)/
(mL.L-1)
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不照光
照光
+
2+
总阳性率
+
2+
总阳性率
%
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30.1
40.1
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13.8
77.2
91.0
10.6
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33.1
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25.8
3.1
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18.2
38.7
56.9
0.6
0.5
1.1
24
13.8
34.7
48.6
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0.5
0.3
0.8
72
13.4
56.5
69.8
6.1
8.4
14.5
**与不照光组比较P<0.01
琥珀酸脱氢酶染色：连续3 d的染色观察，实验组与对照组未见明显差异。2组细胞胞浆均见有广泛分布的酶染阳性的紫色小棒状或颗粒状物。
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2.4 透射电镜观察
10 mL/L和100 mL/L黄柏对癌细胞超微结构有相似的影响。实验组均可见细胞内核糖颗粒明显减少，胞浆电子密度明显降低；线粒体嵴变少变形，线粒体肿胀甚至束泡变；粗面内质网明显扩张；核异染色质减少。此外，实验组细胞张力微丝明显减少。相比之下，100 mL/L黄柏导致细胞的这些损伤更明显。4 mL/L黄柏组细胞变化不明显。
3 讨论
本实验结果显示：黄柏在加药照光条件下，能使癌细胞的噻唑蓝代谢、癌细胞的生长均明显或持续性降低，提示黄柏对人癌细胞的确具有光动力学抑制效应。
黄柏在15～30 min内就能被活细胞摄取，并广泛分布到胞浆、胞核[2]。本实验进一步观察到黄柏在细胞潴留的部位造成相应的光敏损伤。在胞浆，黄柏使癌细胞线粒体、内质网肿胀扩张，证明黄柏光敏作用的重点靶部位与血卟啉一致，仍是生物膜[4]。此外，实验组ACP受抑制(P<0.01)也可能涉及溶酶体膜损伤，继而溶酶体崩解导致细胞死亡。然而琥珀酸脱氢酶在实验组和对照组未见明显差异，说明线粒体在黄柏体积浓度为10 mL/L时，其损伤以肿胀为特点，却仍能维持一定程度代谢，暂时不足以造成整个细胞线粒体功能受阻的趋势。
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据报道荧光剂吖啶橙使人肝癌细胞光敏化后，细胞的染色体发生粘连变性，从而导致分裂障碍[5]。本实验对M期S期细胞加药照光后，细胞染色体均未见粘连变性，且分散好。但黄柏100 mL/L组光敏化的S期细胞能重新分裂的细胞百分率显著降低(P<0.01)。同时，液闪仪测定实验组癌细胞的3H-TdR掺入脉冲值明显低于对照组(P<0.01)，从DNA合成受阻角度，再次证明黄柏对BGC823细胞S期有明显的光动力学抑制效应。
临床上光动力学疗法广泛用于体表、体腔或消化道肿瘤的治疗，而这些部位与黄柏抗癌作用的部位有些一致性。因此，在病人服用黄柏抗癌时，如对局部瘤组织照光，会有利于达到肿瘤综合治疗的最佳效果。
参考文献
1.胡月英,宣明盛.云南抗癌中草药.昆明:云南人民出版社,1982.56～57
, http://www.100md.com
2.廖静,李萍萍,武陆静,等.中草药光敏剂的筛选及对人胃癌细胞系光动力学杀伤效应的研究.中国中西医结合杂志,1997,17(12):726～729
3.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55～63
4.Milanesi C, Sorgato F, Jori G. Photokinetic and ultrastructural studies on porphyrin photosensitizationof Hela cells. Int J Radiat Biol,1989,55(1):59～69
5.柯杨,鄂征,陈泉光,等.吖啶橙激光光敏化对离体培养肝癌细胞系的生物学效应.实验生物学报,1983,16(4):397～407
收稿日期：1998-06-19, 百拇医药