肝细胞癌P16基因的纯合性缺失及其临床意义
作者：邱法波 王培林 张建立 吴力群 杨金镛
单位：青岛医学院(青岛 266003)邱法波 张建立 吴力群 杨金镛 附属医院普外科；王培林 生物学教研室
关键词：肝肿瘤；基因，抑制，肿瘤；聚合酶链反应
青岛医学院学报990311 【摘要】 ①目的 探讨肝细胞癌(HCC)组织中P16基因的缺失及其临床意义。②方法 应用聚合酶链反应和单链构象多态技术银染法，检测21例HCC的癌组织、癌旁组织和外周血标本P16基因的缺失情况。③结果 21例HCC中癌组织P16基因纯合性缺失3例，且均为高分化HCC；癌旁组织和外周血均无P16基因的缺失。④结论HCC组织中存在P16基因的纯合性缺失，而且其缺失与高分化有关。
中国图书馆分类法分类号 R735.7
HOMOZYGOUS DELETION OF TUMOR SUPPRESSOR GENE P16 IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA
, http://www.100md.com
Qiu Fabo, Wang Peilin, Zhang Jianli, et al
Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To detect the deletion of P16 gene in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods PCR-SSCP was used to detect the deletion of P16 gene in DNA extracted from liver cancer tissues, cancer adjacent liver tissuses and peripheral blood of 21 cases of HCC. Results Of 21 cases of HCC, 3 cases of cancer tissues were the homozygous deletion of P16 gene and the well differentiated HCC. No deletion was found in all samples of cancer adjacent liver tissues and peripheral blood. Conclusion The homozygous deletion of the P16 gene is present in HCC and associated with well differentiated HCC.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 liver neoplasms; genes, suppressor, tumor; polymerase chain reaction
P16基因是近几年发现的抑癌基因，它在多种肿瘤中缺失，有关P16基因在肝细胞癌(HCC)中的缺失情况报道较少。本文旨在探讨肝癌组织、癌旁组织和外周血中P16基因的缺失情况及其临床意义，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
21例HCC病人中，男16例，女5例；年龄36～70岁，平均51.1岁。肿瘤直径<3cm者6例，3～10cm者8例，>10cm者7例。分化程度：高分化7例，中分化8例，低分化6例。病人均经病理证实。
1.2 检测方法
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1.2.1 标本采集 21例HCC病人均于术前抽取外周血5mL抗凝，于术中取癌组织和距肿瘤边缘3cm以上癌旁组织。
1.2.2 DNA的提取 ①癌组织和癌旁组织DNA提取：取小块新鲜组织，生理盐水冲洗3次，将组织剪碎，加抽提缓冲液和蛋白酶K，50℃水浴3h，苯酚、氯仿、异戊醇常规抽提，无水酒精沉淀DNA，风干后，加TE缓冲液溶解，-20℃保存待测。②外周血DAN提取：新鲜肝素抗凝血2mL加1.5倍体积的双蒸水溶解红细胞，离心后，用生理盐水洗涤白细胞沉淀，并将其悬浮于2mL SE中，加蛋白酶K，50℃水浴3h.常规氯仿抽提，无水酒精沉淀。紫外分光光度计测定DAN质量良好，-20℃保存待测。
1.2.3 引物设计 设计P16引物一对，序列如下。
上游引物：
5′-ACACAAGCTTCCTTTCCGTC-3′，位于P16基因34～54位核苷酸；
, 百拇医药
下游引物：
5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTC-3′，位于P16基因459～479位，扩增片段长度425bp.
设计微管蛋白基因引物一对。
上游引物：
5′-CCCGTCTTCAGGGCTCTTTG-3′；
下游引物：
5′-TTTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3′，扩增片段长度为295bp，作为阳性扩增对照。
1.2.4 PCR扩增 50μL反应体系中分别含10×Buffer 5μL，2.5mmol/L的4×dNTP 1μL，15mmol/L氯化镁5μL，20μmol/L Primer 1.5μL，模板200ng，二甲基亚砜(DMSO)2.5μL，Taq酶2.5U和双蒸水,石蜡油覆盖。P16基因扩增程序为：94℃预变性7min；94℃ 30s，62℃ 50s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，65℃ 50s，72℃ 50s，15个循环；94℃ 30s，56℃ 15s，72℃ 30s，20个循环；74℃延伸10min.
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1.2.5 单链构象多态(SSCP)技术检测 取PCR产物5μL，加入SSCP加样缓冲液15μL，混匀，98℃变性8min后迅速置于冰浴中，样品加入80g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在500V，20W，4℃下恒功率电泳4h，银染观察结果。每次扩增均设阴性和阳性对照，并扩增2～3次以排除假阴性和假阳性结果。P16基因扩增时，如每次扩增均未出现条带，则判断为P16基因的纯合性缺失。
2 结果
21例HCC组织中有3例P16基因纯合性缺失，且均为高分化HCC.癌旁组织和外周血标本中均未发现P16基因的缺失。
3 讨论
研究发现，肿瘤发生是多因素作用、多步骤复杂过程的结果，肝癌的发生也是如此。某些基因在肝癌的发生和发展过程中发挥重要作用，研究这些基因与肝癌易感性的关系对有效防治肝癌有重要意义。P16基因定位于9P21区域，由2个内含子和3个外显子组成。P16是细胞周期的负性调节物，抑制细胞的增殖。国外文献报道，以P16/INK4-cDNA表达的载体转染的癌细胞，可有效抑制癌细胞克隆的形成；反之，P16的缺乏则导致肿瘤细胞的无限制生长〔1〕。P16基因转染入神经胶质瘤细胞可抑制其侵袭性〔2〕。
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有关肝细胞癌中P16基因的缺失文献报道较少，Qin等〔3〕对24例肝癌病人的研究发现，其中2例(8.3%)外显子2纯合性缺失，其他有关肝癌的报道中未发现这一失活方式。有关P16基因纯合性缺失与肝癌分化程度的关系未见文献报道，本组发现3例纯合性缺失均为高分化HCC，8例中分化型和6例低分化型均无纯合性缺失。这一结果与P16基因在其他肿瘤中的缺失意义不同，如原发性星形细胞瘤P16基因的纯合性缺失与分化程度有关〔4〕，分化程度高者缺失率低。本文结果不同，可能是P16基因在中国肝癌中的一种特殊表现，或者在肝癌的发生和发展过程中P16基因主要通过其他途径失活，如通过甲基化和(或)转录后途径，而其纯合性缺失仅是一种少见的特殊情况。
参考文献
1 Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of P16/INK4 in human cancer. Proc Natl Acad USA, 1994, 91:11045
, http://www.100md.com
2 Chintala SK, Fueyo J, Gomez-Manzano C, et al. Adenovirus-mediated P16/CDKN2 gene transfer suppresses glioma invasion in vitro. Ongegene, 1997, 15:2049
3 Qin L, Tang Z, Liu K, et al. Alterations of CDKN2(P16/MTS1) exon 2 in human hepatocellular carcinoma. Oncology Reports, 1996,3:405
4 Walker DG, Duan W, Popovic EA, et al. Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomas. Cancer Res, 1995, 55:20
(1999-04-15收稿 1999-07-10修回), 百拇医药
单位：青岛医学院(青岛 266003)邱法波 张建立 吴力群 杨金镛 附属医院普外科；王培林 生物学教研室
关键词：肝肿瘤；基因，抑制，肿瘤；聚合酶链反应
青岛医学院学报990311 【摘要】 ①目的 探讨肝细胞癌(HCC)组织中P16基因的缺失及其临床意义。②方法 应用聚合酶链反应和单链构象多态技术银染法，检测21例HCC的癌组织、癌旁组织和外周血标本P16基因的缺失情况。③结果 21例HCC中癌组织P16基因纯合性缺失3例，且均为高分化HCC；癌旁组织和外周血均无P16基因的缺失。④结论HCC组织中存在P16基因的纯合性缺失，而且其缺失与高分化有关。
中国图书馆分类法分类号 R735.7
HOMOZYGOUS DELETION OF TUMOR SUPPRESSOR GENE P16 IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA
, http://www.100md.com
Qiu Fabo, Wang Peilin, Zhang Jianli, et al
Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To detect the deletion of P16 gene in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods PCR-SSCP was used to detect the deletion of P16 gene in DNA extracted from liver cancer tissues, cancer adjacent liver tissuses and peripheral blood of 21 cases of HCC. Results Of 21 cases of HCC, 3 cases of cancer tissues were the homozygous deletion of P16 gene and the well differentiated HCC. No deletion was found in all samples of cancer adjacent liver tissues and peripheral blood. Conclusion The homozygous deletion of the P16 gene is present in HCC and associated with well differentiated HCC.
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【KEY WORDS】 liver neoplasms; genes, suppressor, tumor; polymerase chain reaction
P16基因是近几年发现的抑癌基因，它在多种肿瘤中缺失，有关P16基因在肝细胞癌(HCC)中的缺失情况报道较少。本文旨在探讨肝癌组织、癌旁组织和外周血中P16基因的缺失情况及其临床意义，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
21例HCC病人中，男16例，女5例；年龄36～70岁，平均51.1岁。肿瘤直径<3cm者6例，3～10cm者8例，>10cm者7例。分化程度：高分化7例，中分化8例，低分化6例。病人均经病理证实。
1.2 检测方法
, http://www.100md.com
1.2.1 标本采集 21例HCC病人均于术前抽取外周血5mL抗凝，于术中取癌组织和距肿瘤边缘3cm以上癌旁组织。
1.2.2 DNA的提取 ①癌组织和癌旁组织DNA提取：取小块新鲜组织，生理盐水冲洗3次，将组织剪碎，加抽提缓冲液和蛋白酶K，50℃水浴3h，苯酚、氯仿、异戊醇常规抽提，无水酒精沉淀DNA，风干后，加TE缓冲液溶解，-20℃保存待测。②外周血DAN提取：新鲜肝素抗凝血2mL加1.5倍体积的双蒸水溶解红细胞，离心后，用生理盐水洗涤白细胞沉淀，并将其悬浮于2mL SE中，加蛋白酶K，50℃水浴3h.常规氯仿抽提，无水酒精沉淀。紫外分光光度计测定DAN质量良好，-20℃保存待测。
1.2.3 引物设计 设计P16引物一对，序列如下。
上游引物：
5′-ACACAAGCTTCCTTTCCGTC-3′，位于P16基因34～54位核苷酸；
, 百拇医药
下游引物：
5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTC-3′，位于P16基因459～479位，扩增片段长度425bp.
设计微管蛋白基因引物一对。
上游引物：
5′-CCCGTCTTCAGGGCTCTTTG-3′；
下游引物：
5′-TTTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3′，扩增片段长度为295bp，作为阳性扩增对照。
1.2.4 PCR扩增 50μL反应体系中分别含10×Buffer 5μL，2.5mmol/L的4×dNTP 1μL，15mmol/L氯化镁5μL，20μmol/L Primer 1.5μL，模板200ng，二甲基亚砜(DMSO)2.5μL，Taq酶2.5U和双蒸水,石蜡油覆盖。P16基因扩增程序为：94℃预变性7min；94℃ 30s，62℃ 50s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，65℃ 50s，72℃ 50s，15个循环；94℃ 30s，56℃ 15s，72℃ 30s，20个循环；74℃延伸10min.
, http://www.100md.com
1.2.5 单链构象多态(SSCP)技术检测 取PCR产物5μL，加入SSCP加样缓冲液15μL，混匀，98℃变性8min后迅速置于冰浴中，样品加入80g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在500V，20W，4℃下恒功率电泳4h，银染观察结果。每次扩增均设阴性和阳性对照，并扩增2～3次以排除假阴性和假阳性结果。P16基因扩增时，如每次扩增均未出现条带，则判断为P16基因的纯合性缺失。
2 结果
21例HCC组织中有3例P16基因纯合性缺失，且均为高分化HCC.癌旁组织和外周血标本中均未发现P16基因的缺失。
3 讨论
研究发现，肿瘤发生是多因素作用、多步骤复杂过程的结果，肝癌的发生也是如此。某些基因在肝癌的发生和发展过程中发挥重要作用，研究这些基因与肝癌易感性的关系对有效防治肝癌有重要意义。P16基因定位于9P21区域，由2个内含子和3个外显子组成。P16是细胞周期的负性调节物，抑制细胞的增殖。国外文献报道，以P16/INK4-cDNA表达的载体转染的癌细胞，可有效抑制癌细胞克隆的形成；反之，P16的缺乏则导致肿瘤细胞的无限制生长〔1〕。P16基因转染入神经胶质瘤细胞可抑制其侵袭性〔2〕。
, http://www.100md.com
有关肝细胞癌中P16基因的缺失文献报道较少，Qin等〔3〕对24例肝癌病人的研究发现，其中2例(8.3%)外显子2纯合性缺失，其他有关肝癌的报道中未发现这一失活方式。有关P16基因纯合性缺失与肝癌分化程度的关系未见文献报道，本组发现3例纯合性缺失均为高分化HCC，8例中分化型和6例低分化型均无纯合性缺失。这一结果与P16基因在其他肿瘤中的缺失意义不同，如原发性星形细胞瘤P16基因的纯合性缺失与分化程度有关〔4〕，分化程度高者缺失率低。本文结果不同，可能是P16基因在中国肝癌中的一种特殊表现，或者在肝癌的发生和发展过程中P16基因主要通过其他途径失活，如通过甲基化和(或)转录后途径，而其纯合性缺失仅是一种少见的特殊情况。
参考文献
1 Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of P16/INK4 in human cancer. Proc Natl Acad USA, 1994, 91:11045
, http://www.100md.com
2 Chintala SK, Fueyo J, Gomez-Manzano C, et al. Adenovirus-mediated P16/CDKN2 gene transfer suppresses glioma invasion in vitro. Ongegene, 1997, 15:2049
3 Qin L, Tang Z, Liu K, et al. Alterations of CDKN2(P16/MTS1) exon 2 in human hepatocellular carcinoma. Oncology Reports, 1996,3:405
4 Walker DG, Duan W, Popovic EA, et al. Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomas. Cancer Res, 1995, 55:20
(1999-04-15收稿 1999-07-10修回), 百拇医药