10个STR座位的法医学应用回顾
作者：余纯应 杨庆恩 陈慧 杨荣芝
单位：同济医科大学法医学系物证学教研室，武汉430030
关键词：短串联重复序列；遗传多态性；个人识别；亲子鉴定
同济医科大学学报990312 摘要 选用D19S253、TPOX、D8S1179、CYP19、TH01、LPL、PLA2A、vWA、FOLP23 、GABRB15共10个STR座位，采用相同热循环参数同步扩增、 分步加样电泳及银染方法，完成实际案例213例，其中，亲子鉴定159例, 不同检材个人识别54例。结果：10个STR座位累积非父排除概率(CCE)为99.93%,总个人识别能力(TDP)大于0.9999。证明本方法鉴定效率高,符合“快速、 灵敏、可靠”的办案要求。
Retrospective Study of 10 STR Loci in Forensic Application
, http://www.100md.com
Yu Chunying, Yang Qingen, Chen Hui et al
Department of Forensic Biology, Faculty of Forensic Medicine, Tongji Medical
University,Wuhan 430030
Abstract A simultaneous short tandem repeat (STR) typing of 10 loci was reported by using the same DNA thermal cycle parameters, electrophoresis in the same PAG and silver staining. The 10 STR loci of D19S253, TPOX， D8S1179, CYP19, TH01, vWA, FOLP23, GABRB15, LPL, PLA 2A have been applied in 213 cases which contained 159 paternity testing and 54 personal identification cases. The cumulative chance of exclusion(CCE) of the 10 STR loci was 99.93%, and the total discriminating probability(TDP) is greater than 0.9999. It is proved that the above method is a rapid, sensitive and reliable way in forensic applications.
, http://www.100md.com
Key words short tandem repeat；genetic polymorphisms； paternity testing；individual identification
短串联重复序列(short tandem repeat, STR)基因片段短,多在400 bp以下,约一半STR座位具有遗传多态性,易于PCR扩增，特别适用于法医物证检材个人识别和亲子鉴定。本文参考有关文献[1],结合现有实验条件,筛选10个STR座位同时扩增,分步加样电泳及银染,一次完成10个STR座位等位基因的检测。213例实际检案应用证明，单次检测获取的多态性信息量, 高于HLA等11种血型遗传标记,足以得出亲子鉴定或个人识别的明确结论, 现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
本文鉴定材料均为我室1996年12月至1998年3月受理的鉴定案件。
, http://www.100md.com
159例亲子鉴定中,司法部门送检33例(20.8%),计划生育部门送检14例(8.8%),疑医院调换婴儿1 例(0.6%),自诉111例(69.8%)。
亲子鉴定检材类型主要为EDTA抗凝血液,此外还有血痕、羊水、 牙齿、绒毛组织、唾液斑、拔取头发、皮肤、肌肉、脑组织、脱落的上皮细胞及骨骼等。
54例个人识别刑事案件由湖北、湖南、河南、安徽、广西等省司法机关送检，检材类型有血液、血痕、精斑或精液、阴道分泌液混合斑、牙齿、脑、肌肉、皮肤等。
1.2 DNA提取
血液、血痕、唾液斑、羊水、绒毛组织、脑组织、肌肉、皮肤、毛发、牙齿等采用Chelex100提取法[2]；精斑及精液、阴道分泌液混合斑采用酚\|氯仿提取法[3]；骨骼采用异丙醇沉淀法[4]。
, 百拇医药
1.3 PCR扩增
1.3.1 引物：10个STR基因座扩增引物均由Bio-tech公司合成,引物序列及反应浓度见表1。
表1 10个STR座位引物序列及反应浓度 基因座位
引 物 序 列
反应浓度
(μmol/L)
D19S253
5＇-ATA GAC AGA CAG ACG GACTG-3＇
0.4
5＇-GGG AGT GGA GAT TAC CCCT-3＇
, http://www.100md.com
TPOX
5＇-ACT GGC ACA GAA CAG GCA CTTAGG-3＇
0.4
5＇-GGA GGA CAT GGG AAC CAC ACA GGT-3＇
D8S1179
5＇-TTT TTG TAT TTC ATG TGT ACA TTC-3＇
0.4
5＇-CGT ATC TAT AAT TAG TTC ATT TTC-3＇
CYP19
5＇-GGT AAG CAG GTA CTT AGT TAG CTA C-3＇
, http://www.100md.com
0.5
5＇-GTT ACA GTG AGC CAA GGT CGT GAG-3＇
TH01
5＇-GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3＇
0.27
5＇-ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG-3＇
LPL
5＇-CTG ACC AAG GAT AGT GGG ATA TAG-3＇
0.6
5＇-GGT AAC TGA GCG AGA CTG TGT CT-3＇
, http://www.100md.com
PLA2A
5＇-GGT TGT AAG CTC CAT GAG GTT AGA-3＇
0.8
5＇-TTG AGC ACT TAC TAT GTG CCA GGC T-3＇
vWA
5＇-CCC TAG TGG ATG ATA AGA ATA ATC-3＇
0.8
5＇-GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG-3＇
FOLP23
, 百拇医药 5＇-ATT GTA AGA CTT TTG GAG CCA TTT-3＇
0.4
5＇-TTC AGG GAG AAT GAG ATG GGC-3＇
GABRB15
5＇-CTA GAA AGC TAG CAA GGT GGA T-3＇
0.4
5＇-GCT CAT TAA ACA CTG TGT TCC T-3＇
1.3.2 PCR反应：20 μl反应总体积中含：10×反应缓冲液2 μl,2.5 mmol/L dNTP 1.6 μl，引物(A和B)各2 μl,TaqDNA聚合酶1 μl(0.5 U),蒸馏水5.4 μl,模板DNA 8 μl,另加石蜡油2滴覆盖液面。
, http://www.100md.com
热循环参数：首先96 ℃保温2 min, 然后经94 ℃变性1 min, 60 ℃退火1 min,70 ℃延伸1.5 min,10次循环； 接着90 ℃变性1 min, 60 ℃退火1 min, 70 ℃延伸1.5 min，完成20次循环；最后60 ℃保温30 min退出循环。扩增在Hema\|480 型扩增仪(中国珠海)上完成。
1.3.3 电泳分离：采用PAG垂直平板电泳法。PAG 凝胶浓度为6%、交联度为5%，尿素4 mol/L,含0.5×TBE缓冲液,凝胶板规格220 mm×150 mm×0.4 mm。每管20 μl扩增产物中加入等容积2×STR载样缓冲液(10 mmol/L NaOH，950 ml/L甲酰胺，0.005 g/L溴酚蓝、0.005 g/L二甲苯兰FF),混匀后稍离心,取1 μl加样。加样顺序：①D19S253、TPOX加样电泳；②8 min后D8S1179、CYP19、TH01加样电泳；③再8min后其他座位加样电泳。
1.3.4 电泳条件:恒功率10 W，电泳时间约40 min。
, 百拇医药
1.3.5 银染:100 ml/L乙酸固定8 min,双蒸水漂洗3次,每次约2 min,1.5 g/L 硝酸银染20 min,蒸馏水漂洗10 s,30 g/L碳酸钠显色至谱带清晰。100 ml/L乙酸固定3 min, 双蒸水洗涤2 min。
1.3.6 亲子鉴定对照：159例亲子鉴定中，45例加作ABO、MN、Rh、HLA-A、 HLA-B 、 PGMsub 、EsD、GLOI、EAP、HP等常规血型分型对照。
2 结果
159例亲子鉴定中，排除亲权关系41例，占25.8%，不排除亲权关系 118例，占74.2%。10种STR座位中实际排除率最高为D8S1179(69.4%)， 最低为LPL(26.8%)，表2为各STR系统的实际非父排除机会。
表2 各STR系统的实际非父排除率 STR座位
, 百拇医药
非父检测例数
非父否定例数
排除率%
D19S253
36
22
61.1
TPOX
32
10
31.3
D8S1179
36
, 百拇医药
25
69.4
CYP19
41
20
48.8
TH01
41
22
53.7
LPL
41
11
, 百拇医药
26.8
PLA2A
41
24
58.5
vWA
41
23
56.1
FOLP23
32
15
46.9
, 百拇医药
GABRB15
32
14
43.8
41例排除亲权案例中,排除座位数最多者为8个座位,最少为 2个座位,最常见为4至5个座位排除亲权。 118例不排除亲子鉴定关系中,RCP值最高为99.99 %,最低为99.77 %,所有不排除亲权例RCP值均大于99 %。 45例亲子鉴定常规血型与STR型对照，结论一致。
物证检材个人识别鉴定54例,其中认定不同检材来自同一个体25例,否定不同检材来自同一个体29例。10个STR座位个人识别能力(TDP)大于99.99%。
认定同一个体25例中，检测10个座位,偶合概率(Pm)最低为5.7×10-11,限于检材条件，有的案例仅完成部分座位的检测，最少者为4个座位,Pm值最高为6.86×10-4。一般完成6～8个座位为最常见,平均Pm值为 2.5×10-7。否定同一个体29例中，10个座位检测，否定座位数最多为9个，最少为5个座位。3 讨论
, 百拇医药
本文选用10个三核苷酸重复单位和四核苷酸重复的STR座位进行扩增，稳定性好，尽可能避免了酶滑脱或扩增片段长度变异等引起附加带,使判读型别可靠。
选择法医应用理想的STR座位,等位基因数目应在6～10个,等位基因分布均衡。经过对武汉地区汉族人群调查，本文选用的10个STR座位等位基因数为5～9个,其中除LPL和 TPOX外,其他8个座位基因频率分布均较理想(表3)。LPL和TPOX与其他座位相比虽基因频率分布均匀性较差,但DP值也大于0.5(LPL为0.6700,TPOX为0.6975)，依然属高识别能力多态性座位。
表3 10个STR位点基因频率(汉族、武汉) D19S253(209～241 bp)
TPOX(232～248 bp)
D8S1179(162～202 bp)
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CYP19(173～201 bp)
TH01(179～203 bp)
n1=0.1956
n1=0.5700
n1=0.1288
n1=0.2475
n1=0.1550
n2=0.0311
n2=0.0525
n2=0.0901
, 百拇医药
n2=0.2725
n2=0.2700
n3=0.0089
n3=0.0150
n3=0.1416
n3=0.0100
n3=0.0475
n4=0.0200
n4=0.3500
, 百拇医药 n4=0.2017
n4=0.0325
n4=0.4050
n5=0.1644
n5=0.0125
n5=0.1974
n5=0.3600
n5=0.0675
n6=0.2933
n6=0.1631
, http://www.100md.com
n6=0.0775
n6=0.0550
n7=0.1867
n7=0.0601
n8=0.0956
n8=0.0150
n9=0.0044
n9=0.0022
LPL(107～135 bp)
PLA2A(118～139 bp)
, 百拇医药
vWA(139～167 bp)
FOLP23(160～184 bp)
GABRB15(150～178 bp)
n1=0.0100
n1=0.2531
n1=0.0056
n1=0.1277
n1=0.0475
n2=0.6975
n2=0.0750
, http://www.100md.com
n2=0.0960
n2=0.4946
n2=0.4100
n3=0.0750
n3=0.1875
n3=0.2175
n3=0.1902
n3=0.3475
n4=0.2050
, 百拇医药 n4=0.2594
n4=0.2401
n4=0.0516
n4=0.1150
n5=0.0125
n5=0.1250
n5=0.1610
n5=0.0163
n5=0.0700
n6=0.1000
, http://www.100md.com
n6=0.0141
n6=0.1168
n6=0.0100
n6=0.1168
n7=0.0027
n7=0.2627
n7=0.0028
基因座位的杂合度、 多态性信息容量、个人识别能力和非父排除率是评估多态性座位法医学应用价值的重要指标,本文10个STR座位上述指标列入表4,其中以D8S1179最为理想,TPOX、LPL相对较差。 但在实际应用中观察到，新鲜检材扩增D8S1179成功率较高，而陈旧变质检材相对较低。相反LPL和TPOX无论新鲜或陈旧检材均易扩增成功, 故认为实际应用中还应考虑扩增效率这一因素。
, 百拇医药
计算10个STR座位总体个人识别能力TDP大于0.9999, 陈旧检材有时只能扩增出部分STR座位,但只要有5～6个座位, 其累积个人识别能力仍可达0.9998以上,足以解决众多刑事案件物证检材的个人识别问题。
10个STR座位累积非父排除概率为99.97%,高于本实验室常用的11种血型遗传标记的累积非表4 10个STR座位的H、DP、PE和PIC值 座位
基因数
H
(期望值)
PIC
DP
PE
D19S253
, 百拇医药
9
0.8050
0.7754
0.9309
0.6133
TPOX
5
0.5508
0.4671
0.6975
0.2745
D8S1179
9
, 百拇医药
0.8470
0.8258
0.9515
0.6874
CYP19
6
0.7587
0.7168
0.8783
0.5148
TH01
6
0.7310
, http://www.100md.com
0.7167
0.8871
0.5322
LPL
5
0.4679
0.4531
0.6700
0.2475
PLA2A
6
0.8073
0.7783
, http://www.100md.com
0.9318
0.6148
vWA
8
0.7952
0.7649
0.9241
0.5872
FOLP23
7
0.6882
0.6495
0.9259
, http://www.100md.com
0.4649
GABRB15
6
0.6907
0.6380
0.8273
0.4436
父排除概率(98.65%)[5],从本文完成的159 例亲子鉴定分析,排除亲子关系座位数目最多为8个,常见为4～5个座位排除亲权,而常规11个血型系统最多为6个标记系统否定亲子关系,常见为2～3种标记系统否定亲权。不排除亲子关系的118例中,STR分型的RCP值都大于99%, 而11种血型标记检测,RCP值大于99%者仅占58.3%,说明本室选用的10个STR座位比常规血型检验更具有实用价值。
, 百拇医药
PCRSTR技术在法医物证检验中的突出优点是适用于人体多种检材及微量或陈旧检材的检测。本文应用10个STR座位， 对血液以外的多种检材，如羊水、绒毛组织、脑组织、肌肉、牙齿、骨骼、皮肤等成功地进行了亲子鉴定和个人识别，这是常规血型标记无法比拟的。
本文通过调整引物浓度，使10个STR座位能在同一热循环参数下完成扩增。同时，电泳按不同座位基因片段大小分步加样,大片段先加样,电泳一定时间后再加中等片段,最后加小片段,使结束电泳时,10个座位等位基因停留在相近的迁移距离上。通过上述方法，10 个座位从扩增到电泳一次完成,有效地节省人力和缩短检案时间,达到快速办案、降低检测成本的目的。
由于现有条件下尚缺乏等位基因标准对照, 分析检测结果时，等位基因命名采用了比较保守的方法，等位基因按分子量从小到大顺序命名(n1～n9)(表3),实际检案计算中按顶蓬原则(ceiling principle)尽可能先考虑频率最高的等位基因,以该等位基因为基础再确定其他等位基因,因此, 最终计算值趋于保守,但保证了结论的可靠性,用于个人识别和亲子鉴定效果依然满意。建立等位基因梯阶, 按等位基因重复次数进行标准化命名将是本室进一步研究的内容。
, 百拇医药
作者简介:余纯应，男，1946年生，副教授
参考文献
1 Urquhart A, Kimpton C P, Downes T J et al. Variation in short tandem repeat sequences-a survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers. Int J Med, 1994,107:13
2 Wolsh P S,Mezger D A, Higuchi R. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Bio Techniques， 1991,10:506
, 百拇医药
3 Gill P, Jeffreys A J, Werrett D J. Forensic application of DNA fingerprints. Nature, 1985, 318:577
4 Cattaneo C, Smillie D M, Gelsthorpe K et al. A simple method for extracting DNA from old skeleton material. J Forensic, 1995, 74:169
5 余纯应，杨庆恩. 血型遗传标记在235例亲子鉴定中的应用. 同济医科大学学报, 1998,27(5):385
(1998-08-22 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学法医学系物证学教研室，武汉430030
关键词：短串联重复序列；遗传多态性；个人识别；亲子鉴定
同济医科大学学报990312 摘要 选用D19S253、TPOX、D8S1179、CYP19、TH01、LPL、PLA2A、vWA、FOLP23 、GABRB15共10个STR座位，采用相同热循环参数同步扩增、 分步加样电泳及银染方法，完成实际案例213例，其中，亲子鉴定159例, 不同检材个人识别54例。结果：10个STR座位累积非父排除概率(CCE)为99.93%,总个人识别能力(TDP)大于0.9999。证明本方法鉴定效率高,符合“快速、 灵敏、可靠”的办案要求。
Retrospective Study of 10 STR Loci in Forensic Application
, http://www.100md.com
Yu Chunying, Yang Qingen, Chen Hui et al
Department of Forensic Biology, Faculty of Forensic Medicine, Tongji Medical
University,Wuhan 430030
Abstract A simultaneous short tandem repeat (STR) typing of 10 loci was reported by using the same DNA thermal cycle parameters, electrophoresis in the same PAG and silver staining. The 10 STR loci of D19S253, TPOX， D8S1179, CYP19, TH01, vWA, FOLP23, GABRB15, LPL, PLA 2A have been applied in 213 cases which contained 159 paternity testing and 54 personal identification cases. The cumulative chance of exclusion(CCE) of the 10 STR loci was 99.93%, and the total discriminating probability(TDP) is greater than 0.9999. It is proved that the above method is a rapid, sensitive and reliable way in forensic applications.
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Key words short tandem repeat；genetic polymorphisms； paternity testing；individual identification
短串联重复序列(short tandem repeat, STR)基因片段短,多在400 bp以下,约一半STR座位具有遗传多态性,易于PCR扩增，特别适用于法医物证检材个人识别和亲子鉴定。本文参考有关文献[1],结合现有实验条件,筛选10个STR座位同时扩增,分步加样电泳及银染,一次完成10个STR座位等位基因的检测。213例实际检案应用证明，单次检测获取的多态性信息量, 高于HLA等11种血型遗传标记,足以得出亲子鉴定或个人识别的明确结论, 现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
本文鉴定材料均为我室1996年12月至1998年3月受理的鉴定案件。
, http://www.100md.com
159例亲子鉴定中,司法部门送检33例(20.8%),计划生育部门送检14例(8.8%),疑医院调换婴儿1 例(0.6%),自诉111例(69.8%)。
亲子鉴定检材类型主要为EDTA抗凝血液,此外还有血痕、羊水、 牙齿、绒毛组织、唾液斑、拔取头发、皮肤、肌肉、脑组织、脱落的上皮细胞及骨骼等。
54例个人识别刑事案件由湖北、湖南、河南、安徽、广西等省司法机关送检，检材类型有血液、血痕、精斑或精液、阴道分泌液混合斑、牙齿、脑、肌肉、皮肤等。
1.2 DNA提取
血液、血痕、唾液斑、羊水、绒毛组织、脑组织、肌肉、皮肤、毛发、牙齿等采用Chelex100提取法[2]；精斑及精液、阴道分泌液混合斑采用酚\|氯仿提取法[3]；骨骼采用异丙醇沉淀法[4]。
, 百拇医药
1.3 PCR扩增
1.3.1 引物：10个STR基因座扩增引物均由Bio-tech公司合成,引物序列及反应浓度见表1。
表1 10个STR座位引物序列及反应浓度 基因座位
引 物 序 列
反应浓度
(μmol/L)
D19S253
5＇-ATA GAC AGA CAG ACG GACTG-3＇
0.4
5＇-GGG AGT GGA GAT TAC CCCT-3＇
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TPOX
5＇-ACT GGC ACA GAA CAG GCA CTTAGG-3＇
0.4
5＇-GGA GGA CAT GGG AAC CAC ACA GGT-3＇
D8S1179
5＇-TTT TTG TAT TTC ATG TGT ACA TTC-3＇
0.4
5＇-CGT ATC TAT AAT TAG TTC ATT TTC-3＇
CYP19
5＇-GGT AAG CAG GTA CTT AGT TAG CTA C-3＇
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0.5
5＇-GTT ACA GTG AGC CAA GGT CGT GAG-3＇
TH01
5＇-GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3＇
0.27
5＇-ATT CAA AGG GTA TCT GGG CTC TGG-3＇
LPL
5＇-CTG ACC AAG GAT AGT GGG ATA TAG-3＇
0.6
5＇-GGT AAC TGA GCG AGA CTG TGT CT-3＇
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PLA2A
5＇-GGT TGT AAG CTC CAT GAG GTT AGA-3＇
0.8
5＇-TTG AGC ACT TAC TAT GTG CCA GGC T-3＇
vWA
5＇-CCC TAG TGG ATG ATA AGA ATA ATC-3＇
0.8
5＇-GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG-3＇
FOLP23
, 百拇医药 5＇-ATT GTA AGA CTT TTG GAG CCA TTT-3＇
0.4
5＇-TTC AGG GAG AAT GAG ATG GGC-3＇
GABRB15
5＇-CTA GAA AGC TAG CAA GGT GGA T-3＇
0.4
5＇-GCT CAT TAA ACA CTG TGT TCC T-3＇
1.3.2 PCR反应：20 μl反应总体积中含：10×反应缓冲液2 μl,2.5 mmol/L dNTP 1.6 μl，引物(A和B)各2 μl,TaqDNA聚合酶1 μl(0.5 U),蒸馏水5.4 μl,模板DNA 8 μl,另加石蜡油2滴覆盖液面。
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热循环参数：首先96 ℃保温2 min, 然后经94 ℃变性1 min, 60 ℃退火1 min,70 ℃延伸1.5 min,10次循环； 接着90 ℃变性1 min, 60 ℃退火1 min, 70 ℃延伸1.5 min，完成20次循环；最后60 ℃保温30 min退出循环。扩增在Hema\|480 型扩增仪(中国珠海)上完成。
1.3.3 电泳分离：采用PAG垂直平板电泳法。PAG 凝胶浓度为6%、交联度为5%，尿素4 mol/L,含0.5×TBE缓冲液,凝胶板规格220 mm×150 mm×0.4 mm。每管20 μl扩增产物中加入等容积2×STR载样缓冲液(10 mmol/L NaOH，950 ml/L甲酰胺，0.005 g/L溴酚蓝、0.005 g/L二甲苯兰FF),混匀后稍离心,取1 μl加样。加样顺序：①D19S253、TPOX加样电泳；②8 min后D8S1179、CYP19、TH01加样电泳；③再8min后其他座位加样电泳。
1.3.4 电泳条件:恒功率10 W，电泳时间约40 min。
, 百拇医药
1.3.5 银染:100 ml/L乙酸固定8 min,双蒸水漂洗3次,每次约2 min,1.5 g/L 硝酸银染20 min,蒸馏水漂洗10 s,30 g/L碳酸钠显色至谱带清晰。100 ml/L乙酸固定3 min, 双蒸水洗涤2 min。
1.3.6 亲子鉴定对照：159例亲子鉴定中，45例加作ABO、MN、Rh、HLA-A、 HLA-B 、 PGMsub 、EsD、GLOI、EAP、HP等常规血型分型对照。
2 结果
159例亲子鉴定中，排除亲权关系41例，占25.8%，不排除亲权关系 118例，占74.2%。10种STR座位中实际排除率最高为D8S1179(69.4%)， 最低为LPL(26.8%)，表2为各STR系统的实际非父排除机会。
表2 各STR系统的实际非父排除率 STR座位
, 百拇医药
非父检测例数
非父否定例数
排除率%
D19S253
36
22
61.1
TPOX
32
10
31.3
D8S1179
36
, 百拇医药
25
69.4
CYP19
41
20
48.8
TH01
41
22
53.7
LPL
41
11
, 百拇医药
26.8
PLA2A
41
24
58.5
vWA
41
23
56.1
FOLP23
32
15
46.9
, 百拇医药
GABRB15
32
14
43.8
41例排除亲权案例中,排除座位数最多者为8个座位,最少为 2个座位,最常见为4至5个座位排除亲权。 118例不排除亲子鉴定关系中,RCP值最高为99.99 %,最低为99.77 %,所有不排除亲权例RCP值均大于99 %。 45例亲子鉴定常规血型与STR型对照，结论一致。
物证检材个人识别鉴定54例,其中认定不同检材来自同一个体25例,否定不同检材来自同一个体29例。10个STR座位个人识别能力(TDP)大于99.99%。
认定同一个体25例中，检测10个座位,偶合概率(Pm)最低为5.7×10-11,限于检材条件，有的案例仅完成部分座位的检测，最少者为4个座位,Pm值最高为6.86×10-4。一般完成6～8个座位为最常见,平均Pm值为 2.5×10-7。否定同一个体29例中，10个座位检测，否定座位数最多为9个，最少为5个座位。3 讨论
, 百拇医药
本文选用10个三核苷酸重复单位和四核苷酸重复的STR座位进行扩增，稳定性好，尽可能避免了酶滑脱或扩增片段长度变异等引起附加带,使判读型别可靠。
选择法医应用理想的STR座位,等位基因数目应在6～10个,等位基因分布均衡。经过对武汉地区汉族人群调查，本文选用的10个STR座位等位基因数为5～9个,其中除LPL和 TPOX外,其他8个座位基因频率分布均较理想(表3)。LPL和TPOX与其他座位相比虽基因频率分布均匀性较差,但DP值也大于0.5(LPL为0.6700,TPOX为0.6975)，依然属高识别能力多态性座位。
表3 10个STR位点基因频率(汉族、武汉) D19S253(209～241 bp)
TPOX(232～248 bp)
D8S1179(162～202 bp)
, http://www.100md.com
CYP19(173～201 bp)
TH01(179～203 bp)
n1=0.1956
n1=0.5700
n1=0.1288
n1=0.2475
n1=0.1550
n2=0.0311
n2=0.0525
n2=0.0901
, 百拇医药
n2=0.2725
n2=0.2700
n3=0.0089
n3=0.0150
n3=0.1416
n3=0.0100
n3=0.0475
n4=0.0200
n4=0.3500
, 百拇医药 n4=0.2017
n4=0.0325
n4=0.4050
n5=0.1644
n5=0.0125
n5=0.1974
n5=0.3600
n5=0.0675
n6=0.2933
n6=0.1631
, http://www.100md.com
n6=0.0775
n6=0.0550
n7=0.1867
n7=0.0601
n8=0.0956
n8=0.0150
n9=0.0044
n9=0.0022
LPL(107～135 bp)
PLA2A(118～139 bp)
, 百拇医药
vWA(139～167 bp)
FOLP23(160～184 bp)
GABRB15(150～178 bp)
n1=0.0100
n1=0.2531
n1=0.0056
n1=0.1277
n1=0.0475
n2=0.6975
n2=0.0750
, http://www.100md.com
n2=0.0960
n2=0.4946
n2=0.4100
n3=0.0750
n3=0.1875
n3=0.2175
n3=0.1902
n3=0.3475
n4=0.2050
, 百拇医药 n4=0.2594
n4=0.2401
n4=0.0516
n4=0.1150
n5=0.0125
n5=0.1250
n5=0.1610
n5=0.0163
n5=0.0700
n6=0.1000
, http://www.100md.com
n6=0.0141
n6=0.1168
n6=0.0100
n6=0.1168
n7=0.0027
n7=0.2627
n7=0.0028
基因座位的杂合度、 多态性信息容量、个人识别能力和非父排除率是评估多态性座位法医学应用价值的重要指标,本文10个STR座位上述指标列入表4,其中以D8S1179最为理想,TPOX、LPL相对较差。 但在实际应用中观察到，新鲜检材扩增D8S1179成功率较高，而陈旧变质检材相对较低。相反LPL和TPOX无论新鲜或陈旧检材均易扩增成功, 故认为实际应用中还应考虑扩增效率这一因素。
, 百拇医药
计算10个STR座位总体个人识别能力TDP大于0.9999, 陈旧检材有时只能扩增出部分STR座位,但只要有5～6个座位, 其累积个人识别能力仍可达0.9998以上,足以解决众多刑事案件物证检材的个人识别问题。
10个STR座位累积非父排除概率为99.97%,高于本实验室常用的11种血型遗传标记的累积非表4 10个STR座位的H、DP、PE和PIC值 座位
基因数
H
(期望值)
PIC
DP
PE
D19S253
, 百拇医药
9
0.8050
0.7754
0.9309
0.6133
TPOX
5
0.5508
0.4671
0.6975
0.2745
D8S1179
9
, 百拇医药
0.8470
0.8258
0.9515
0.6874
CYP19
6
0.7587
0.7168
0.8783
0.5148
TH01
6
0.7310
, http://www.100md.com
0.7167
0.8871
0.5322
LPL
5
0.4679
0.4531
0.6700
0.2475
PLA2A
6
0.8073
0.7783
, http://www.100md.com
0.9318
0.6148
vWA
8
0.7952
0.7649
0.9241
0.5872
FOLP23
7
0.6882
0.6495
0.9259
, http://www.100md.com
0.4649
GABRB15
6
0.6907
0.6380
0.8273
0.4436
父排除概率(98.65%)[5],从本文完成的159 例亲子鉴定分析,排除亲子关系座位数目最多为8个,常见为4～5个座位排除亲权,而常规11个血型系统最多为6个标记系统否定亲子关系,常见为2～3种标记系统否定亲权。不排除亲子关系的118例中,STR分型的RCP值都大于99%, 而11种血型标记检测,RCP值大于99%者仅占58.3%,说明本室选用的10个STR座位比常规血型检验更具有实用价值。
, 百拇医药
PCRSTR技术在法医物证检验中的突出优点是适用于人体多种检材及微量或陈旧检材的检测。本文应用10个STR座位， 对血液以外的多种检材，如羊水、绒毛组织、脑组织、肌肉、牙齿、骨骼、皮肤等成功地进行了亲子鉴定和个人识别，这是常规血型标记无法比拟的。
本文通过调整引物浓度，使10个STR座位能在同一热循环参数下完成扩增。同时，电泳按不同座位基因片段大小分步加样,大片段先加样,电泳一定时间后再加中等片段,最后加小片段,使结束电泳时,10个座位等位基因停留在相近的迁移距离上。通过上述方法，10 个座位从扩增到电泳一次完成,有效地节省人力和缩短检案时间,达到快速办案、降低检测成本的目的。
由于现有条件下尚缺乏等位基因标准对照, 分析检测结果时，等位基因命名采用了比较保守的方法，等位基因按分子量从小到大顺序命名(n1～n9)(表3),实际检案计算中按顶蓬原则(ceiling principle)尽可能先考虑频率最高的等位基因,以该等位基因为基础再确定其他等位基因,因此, 最终计算值趋于保守,但保证了结论的可靠性,用于个人识别和亲子鉴定效果依然满意。建立等位基因梯阶, 按等位基因重复次数进行标准化命名将是本室进一步研究的内容。
, 百拇医药
作者简介:余纯应，男，1946年生，副教授
参考文献
1 Urquhart A, Kimpton C P, Downes T J et al. Variation in short tandem repeat sequences-a survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers. Int J Med, 1994,107:13
2 Wolsh P S,Mezger D A, Higuchi R. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Bio Techniques， 1991,10:506
, 百拇医药
3 Gill P, Jeffreys A J, Werrett D J. Forensic application of DNA fingerprints. Nature, 1985, 318:577
4 Cattaneo C, Smillie D M, Gelsthorpe K et al. A simple method for extracting DNA from old skeleton material. J Forensic, 1995, 74:169
5 余纯应，杨庆恩. 血型遗传标记在235例亲子鉴定中的应用. 同济医科大学学报, 1998,27(5):385
(1998-08-22 收稿), 百拇医药