实验性消化道溃疡上皮淋巴细胞毒活性的变化
作者：刘北星 吕昌龙
单位：中国医科大学免疫研究室，沈阳 110001
关键词：水浸限制刺激；肠上皮淋巴细胞；杀伤活性
中国免疫学杂志990315 中国图书分类号 R392.12 R392.3
摘 要 目的：了解消化道溃疡机体的免疫功能变化。方法：应用生物学测定法检测了水浸限制刺激诱发的C57BL/6小鼠消化道溃疡动物模型肠上皮淋巴细胞和脾淋巴细胞的细胞毒活性的变化。结果：发现给予水浸限制刺激后第2天，小鼠肠上皮淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性增至最高，达52.3%，1 w后基本恢复正常水平。脾淋巴细胞的杀伤活性在水浸限制刺激后第5天明显下降，第9天仍未完全恢复至正常水平。结论：肠上皮淋巴细胞活性在消化道溃疡发生后的一定期间内有升高，这一升高可能对肠道的功能具有保护作用。
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The change of cytotoxicity of intestinal intraepithelial lymphocytes from mice with experimental digestive ulcer
LIU Bei-Xing，L
Chang-Long.
Department of Immmunology,China Medical University,Shenyang 110001
Abstract Objective：In order to understand immunological changes in the body with digestive ulcer.Methods：The cytotoxity of intestinal intraepithelial lymphocytes(IELs)in C57BL/6 mice with digestive ulcer induced by water immersion were examined by biological assay technique.Results:It was showed that the cytotoxity of IELs was enhanced to a peak in 2 days and down back to the normal in 7 days after the stress and that the cytotoxity of spleen cells was lower than that of normal and could not revive to normal level on the 9th day. Conclusion:the cytotoxity of IELs was increased in a certain period of time after the ulcer,indicating IELs may play a protective role in digestive tract.
, 百拇医药
Key words Water immmersion restrain stress Intestinal intraepithelial lymphocyte(IEL) Cytotoxity
肠上皮淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocyte,IEL)是近几年发现的存在于消化道肠上皮细胞间的一种特殊T淋巴细胞。与在胸腺经阳性选择发育成熟的T淋巴细胞不同，IEL的绝大部分(约80%)为CD3+CD4-CD8+T细胞，且CD8分子构成多为αα同质双体[1]，实验发现胚胎鼠或未离乳鼠肠道内IEL很少，且多为表达γδTCR的IEL(γδIEL)[2]。随着断乳及成长，表达αβTCR表型的IEL(αβIEL)比例逐渐增加，IEL总数亦随之增多。成年鼠肠上皮细胞间存在约5×107～7×107个IEL/鼠，其中约45%～60%为αβIEL，其余40%～55%为γδIEL[3]。因IEL不进入淋巴再循环，而生存于消化道局部直至死亡，故推测IEL在对抗外来侵袭及清除消化道衰老细胞方面起十分重要的作用[4]。在免疫监视系统中IEL的细胞毒活性十分引人注目。
, 百拇医药
我们曾利用水浸限制刺激诱发小鼠消化道溃疡的实验模型，探讨了在实验性消化道溃疡发生及发展中小鼠IEL的变化，发现IEL总数及细胞亚群(αβIEL；γδIEL)数量均有一过性减少，指出在消化道溃疡发生过程中IEL确有变化[5]。为了进一步证实IEL在消化道局部免疫中的作用，我们检测了水浸限制刺激对IEL杀伤活性的影响，并与体内脾淋巴细胞杀伤活性做了比较。
1 材料与方法
1.1 动物 C57BL/6雄性鼠，6～8周龄，来自本校实验动物部。
1.2 实验性消化道溃疡模型——水浸限制刺激 将小鼠限制在盖有孔的50 ml离心管中，加水至小鼠胸骨处，将离心管置于22～23℃水浴箱中轻微震荡8 h后取出。剖开腹腔，摘出全胃，观察到胃粘膜出现浅表性溃疡为阳性。经统计，用该方法所诱导的小鼠应激性溃疡成功率达95%以上[6]。
, 百拇医药
1.3 IEL及脾淋巴细胞的分离 IEL的提取方法参照文献[5]。取回盲部至胃幽门部的全部小肠，冲洗干净后翻转肠，剪成小段，放入装有45 ml Hank′s液的离心管中，37℃150 r/min震荡45 min后，离心弃上清，用不同浓度的Percoll淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离IEL。同时常规方法提取脾细胞。
1.4 乳酸脱氢酶释放法[7]检测IEL及脾细胞杀伤活性 用下列公式计算杀伤活性：
1.5 统计学检测方法 根据Students′t-test判断实验组与对照组的显著性差异。
2 结果
2.1 IEL细胞毒活性的变化 分别分离水浸限制刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠IEL，用乳酸脱氢酶释放法检测其对靶细胞YAC-1的杀伤活性。结果显示在刺激后第2天，IEL杀伤活性为52.3%，明显高于正常对照组(27.6%)，P<0.01。以后逐渐下降，刺激后第9天实验组IEL杀伤活性基本恢复至正常水平(图1)。
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图1 水浸限制刺激对C57BL/6鼠IEL数量和杀伤活性的影响
Fig.1 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of IEL in C57BL/6 mice(n=6)
Note:P<0.01
2.2 脾淋巴细胞杀伤活性的变化 分别分离刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠脾淋巴细胞，去除红细胞和巨噬细胞后用同样方法检测其杀伤活性。发现脾淋巴细胞杀伤活性在刺激后略有增强，第3天增至最强，但无统计学意义。以后下降，刺激后第5天脾淋巴细胞杀伤活性(14.6%)降至正常水平以下，与对照组(26.1%)比较显示有意义的差异(P<0.05)(图2)。
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图2 水浸限制刺激对C57BL/6鼠脾淋巴细胞数量和杀伤活性的影响
Fig.2 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of spleen lympocyte cells in C57BL/6 mice(n=6)
Note:*P<0.05 **P<0.01
2.3 IEL和脾淋巴细胞数量的变化 在检测IEL和脾淋巴细胞杀伤活性的同时，分别计数了IEL和脾淋巴细胞数，其结果如图1和图2。水浸限制刺激后第2天IEL总数降至最低，为2.60×106±0.53×106，以后逐渐回升，刺激后第9天IEL总数恢复正常水平。而脾淋巴细胞总数在刺激后第6天降到最低(0.74×107±0.07×107)，第9天尚未恢复到正常水平。
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3 讨论
肠上皮淋巴细胞作为存在于肠上皮间的数量庞大的T淋巴细胞，其在消化道局部免疫系统中所起的生理作用值得研究。有报道水浸限制刺激降低Peyer′s板和肠系膜淋巴细胞总数，并改变这些免疫器官的T细胞构成[8]。我们也曾利用该刺激诱发小鼠消化道溃疡，检测小鼠IEL细胞数及其分化亚群的动态变化。发现水浸限制刺激一过性降低小鼠IEL总数，分化群中αβIEL下降幅度大于γδIEL；Thy1+IEL下降幅度大于Thy1-IEL(待发表)。提示水浸限制刺激对消化道粘膜免疫的影响的确存在。众所周知，肠粘膜以其庞大的总面积抵抗着外来抗原及其它微生物对人体的侵袭，并不断新陈代谢更换上皮细胞。依据IEL分布位置及数量，可推测其在抗感染免疫及免疫监视中意义重大[4]。杀伤活性作为机体抵抗力的一个标志，反应机体细胞免疫的一个重要方面。我们在本次实验中动态观察了水浸限制刺激诱发小鼠消化道溃疡后IEL杀伤活性的变化。结果发现其杀伤活性呈一过性增高，与IEL的数量变化呈相反关系。分析此现象发生的原因和机制可能为：其一，水浸限制刺激使大部分来自胸腺的T淋巴细胞(CD4+αβIEL)失活或死亡(凋亡?)，从而使IEL的杀伤活性因CD8+T淋巴细胞的比例增加而增加。这种一过性细胞毒活性的升高可能是消化道粘膜免疫系统为清除大量的死亡细胞，维持其自身恒定性所表现出的一种代偿性免疫保护机能。其二，水浸限制刺激诱发消化道溃疡，改变了肠上皮淋巴细胞的局部生长状态，从而使某些分化亚群的IEL(γδIEL?)的生物活性增强。其三，因IEL绝大部分来自于骨髓的前体细胞在消化道局部的分化发育，故能在刺激后迅速恢复细胞数量及原有的生物学活性。
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有报道禁食及寒冷刺激均可导致脾淋巴细胞杀伤活性一过性降低[9]，与我们的实验结果基本一致。但在本实验中还观察到水浸限制刺激初期脾淋巴细胞杀伤活性出现短暂升高，这很可能与自律神经的应激调节和儿茶酚胺等肾上腺皮质激素的释放增加有关。而且脾淋巴细胞的杀伤活性逐渐降低，甚至在刺激后第5天降至正常水平以下，在第9天仍未完全恢复到正常水平(图2)，这可能是水浸限制刺激导致胸腺的一过性萎缩，从而脾淋巴细胞来源短暂不足，导致脾淋巴细胞数的下降及其杀伤活性的降低[9]。
通过比较IEL和脾淋巴细胞的杀伤活性，可了解在相同刺激条件下消化道局部和全身免疫系统的不同反应性。为解释消化道局部粘膜免疫的特殊性及与消化道疾病发生的关系提供了依据。
实验性消化道溃疡上皮淋巴细胞毒活性的变化 受国家自然科学基金项目39600133资助
作者简介：刘北星，女，33岁，免疫研究室讲师，主要研究粘膜免疫
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4 参考文献
1 石川博通.消化管におけゐIEL细胞分化.Medical Immunology,1993;25(3):209
2 Rocha B,Vassali P,Guy-Grand D. The extrathymic T-cell development.Pathway Immunol Today,1992;13:449
3 Rocha B,Vassali P,Guy-Grand D.The Vβ repertoire of mouse gut homodimeric CD8+ intrepithelial T cell receptor α/β+ lymphocytes reveals a major extrathymic pathway of T cell differentiation.J Exp Med,1991;173:483
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4 Viney J I,Kilshaw P J，macDonald T T.Cytotoxic α/β+ and γ/δ+ T cell in murine intestinal epithelium.Eur J Immunol,1990;20:1623
5 刘北星，石川博通.水浸拘束ストレスのマウス肠管上皮细胞间Tリンパ球(IEL)に及ばす影响.Digestive Organ and Immunology,1995;30(2):66
6 高木敬次郎，罔部进.脏器炎とその疾患モデル.东京：医学书院，1976：136
7 陈丙莺，马建吟，黄饮田 et al. 简易自然杀伤试验-LDH释放改良法.上海免疫学杂志，1989；9(4)：218
8 细川友秀，竹原浩司，西泰明 et al. 水浸拘束ストレスのマウス消化管免疫系への影响.消化器と免疫，1992；26：52
9 Nakamura K,Aoike A,Hosokawa T et al.Effect of food-restriction stress on immune response in mice.J of Newroimmunology,1990;30:23
〔收稿1997-09-30 修回1998-03-05〕, 百拇医药
单位：中国医科大学免疫研究室，沈阳 110001
关键词：水浸限制刺激；肠上皮淋巴细胞；杀伤活性
中国免疫学杂志990315 中国图书分类号 R392.12 R392.3
摘 要 目的：了解消化道溃疡机体的免疫功能变化。方法：应用生物学测定法检测了水浸限制刺激诱发的C57BL/6小鼠消化道溃疡动物模型肠上皮淋巴细胞和脾淋巴细胞的细胞毒活性的变化。结果：发现给予水浸限制刺激后第2天，小鼠肠上皮淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性增至最高，达52.3%，1 w后基本恢复正常水平。脾淋巴细胞的杀伤活性在水浸限制刺激后第5天明显下降，第9天仍未完全恢复至正常水平。结论：肠上皮淋巴细胞活性在消化道溃疡发生后的一定期间内有升高，这一升高可能对肠道的功能具有保护作用。
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The change of cytotoxicity of intestinal intraepithelial lymphocytes from mice with experimental digestive ulcer
LIU Bei-Xing，L
Chang-Long.Department of Immmunology,China Medical University,Shenyang 110001
Abstract Objective：In order to understand immunological changes in the body with digestive ulcer.Methods：The cytotoxity of intestinal intraepithelial lymphocytes(IELs)in C57BL/6 mice with digestive ulcer induced by water immersion were examined by biological assay technique.Results:It was showed that the cytotoxity of IELs was enhanced to a peak in 2 days and down back to the normal in 7 days after the stress and that the cytotoxity of spleen cells was lower than that of normal and could not revive to normal level on the 9th day. Conclusion:the cytotoxity of IELs was increased in a certain period of time after the ulcer,indicating IELs may play a protective role in digestive tract.
, 百拇医药
Key words Water immmersion restrain stress Intestinal intraepithelial lymphocyte(IEL) Cytotoxity
肠上皮淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocyte,IEL)是近几年发现的存在于消化道肠上皮细胞间的一种特殊T淋巴细胞。与在胸腺经阳性选择发育成熟的T淋巴细胞不同，IEL的绝大部分(约80%)为CD3+CD4-CD8+T细胞，且CD8分子构成多为αα同质双体[1]，实验发现胚胎鼠或未离乳鼠肠道内IEL很少，且多为表达γδTCR的IEL(γδIEL)[2]。随着断乳及成长，表达αβTCR表型的IEL(αβIEL)比例逐渐增加，IEL总数亦随之增多。成年鼠肠上皮细胞间存在约5×107～7×107个IEL/鼠，其中约45%～60%为αβIEL，其余40%～55%为γδIEL[3]。因IEL不进入淋巴再循环，而生存于消化道局部直至死亡，故推测IEL在对抗外来侵袭及清除消化道衰老细胞方面起十分重要的作用[4]。在免疫监视系统中IEL的细胞毒活性十分引人注目。
, 百拇医药
我们曾利用水浸限制刺激诱发小鼠消化道溃疡的实验模型，探讨了在实验性消化道溃疡发生及发展中小鼠IEL的变化，发现IEL总数及细胞亚群(αβIEL；γδIEL)数量均有一过性减少，指出在消化道溃疡发生过程中IEL确有变化[5]。为了进一步证实IEL在消化道局部免疫中的作用，我们检测了水浸限制刺激对IEL杀伤活性的影响，并与体内脾淋巴细胞杀伤活性做了比较。
1 材料与方法
1.1 动物 C57BL/6雄性鼠，6～8周龄，来自本校实验动物部。
1.2 实验性消化道溃疡模型——水浸限制刺激 将小鼠限制在盖有孔的50 ml离心管中，加水至小鼠胸骨处，将离心管置于22～23℃水浴箱中轻微震荡8 h后取出。剖开腹腔，摘出全胃，观察到胃粘膜出现浅表性溃疡为阳性。经统计，用该方法所诱导的小鼠应激性溃疡成功率达95%以上[6]。
, 百拇医药
1.3 IEL及脾淋巴细胞的分离 IEL的提取方法参照文献[5]。取回盲部至胃幽门部的全部小肠，冲洗干净后翻转肠，剪成小段，放入装有45 ml Hank′s液的离心管中，37℃150 r/min震荡45 min后，离心弃上清，用不同浓度的Percoll淋巴细胞分离液(Sigma公司)分离IEL。同时常规方法提取脾细胞。
1.4 乳酸脱氢酶释放法[7]检测IEL及脾细胞杀伤活性 用下列公式计算杀伤活性：
1.5 统计学检测方法 根据Students′t-test判断实验组与对照组的显著性差异。
2 结果
2.1 IEL细胞毒活性的变化 分别分离水浸限制刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠IEL，用乳酸脱氢酶释放法检测其对靶细胞YAC-1的杀伤活性。结果显示在刺激后第2天，IEL杀伤活性为52.3%，明显高于正常对照组(27.6%)，P<0.01。以后逐渐下降，刺激后第9天实验组IEL杀伤活性基本恢复至正常水平(图1)。
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图1 水浸限制刺激对C57BL/6鼠IEL数量和杀伤活性的影响
Fig.1 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of IEL in C57BL/6 mice(n=6)
Note:P<0.01
2.2 脾淋巴细胞杀伤活性的变化 分别分离刺激后第2天，第4天，第6天，第9天C57BL/6鼠脾淋巴细胞，去除红细胞和巨噬细胞后用同样方法检测其杀伤活性。发现脾淋巴细胞杀伤活性在刺激后略有增强，第3天增至最强，但无统计学意义。以后下降，刺激后第5天脾淋巴细胞杀伤活性(14.6%)降至正常水平以下，与对照组(26.1%)比较显示有意义的差异(P<0.05)(图2)。
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图2 水浸限制刺激对C57BL/6鼠脾淋巴细胞数量和杀伤活性的影响
Fig.2 Effect of water-immersion restrain stress on number and cytotoxicity of spleen lympocyte cells in C57BL/6 mice(n=6)
Note:*P<0.05 **P<0.01
2.3 IEL和脾淋巴细胞数量的变化 在检测IEL和脾淋巴细胞杀伤活性的同时，分别计数了IEL和脾淋巴细胞数，其结果如图1和图2。水浸限制刺激后第2天IEL总数降至最低，为2.60×106±0.53×106，以后逐渐回升，刺激后第9天IEL总数恢复正常水平。而脾淋巴细胞总数在刺激后第6天降到最低(0.74×107±0.07×107)，第9天尚未恢复到正常水平。
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3 讨论
肠上皮淋巴细胞作为存在于肠上皮间的数量庞大的T淋巴细胞，其在消化道局部免疫系统中所起的生理作用值得研究。有报道水浸限制刺激降低Peyer′s板和肠系膜淋巴细胞总数，并改变这些免疫器官的T细胞构成[8]。我们也曾利用该刺激诱发小鼠消化道溃疡，检测小鼠IEL细胞数及其分化亚群的动态变化。发现水浸限制刺激一过性降低小鼠IEL总数，分化群中αβIEL下降幅度大于γδIEL；Thy1+IEL下降幅度大于Thy1-IEL(待发表)。提示水浸限制刺激对消化道粘膜免疫的影响的确存在。众所周知，肠粘膜以其庞大的总面积抵抗着外来抗原及其它微生物对人体的侵袭，并不断新陈代谢更换上皮细胞。依据IEL分布位置及数量，可推测其在抗感染免疫及免疫监视中意义重大[4]。杀伤活性作为机体抵抗力的一个标志，反应机体细胞免疫的一个重要方面。我们在本次实验中动态观察了水浸限制刺激诱发小鼠消化道溃疡后IEL杀伤活性的变化。结果发现其杀伤活性呈一过性增高，与IEL的数量变化呈相反关系。分析此现象发生的原因和机制可能为：其一，水浸限制刺激使大部分来自胸腺的T淋巴细胞(CD4+αβIEL)失活或死亡(凋亡?)，从而使IEL的杀伤活性因CD8+T淋巴细胞的比例增加而增加。这种一过性细胞毒活性的升高可能是消化道粘膜免疫系统为清除大量的死亡细胞，维持其自身恒定性所表现出的一种代偿性免疫保护机能。其二，水浸限制刺激诱发消化道溃疡，改变了肠上皮淋巴细胞的局部生长状态，从而使某些分化亚群的IEL(γδIEL?)的生物活性增强。其三，因IEL绝大部分来自于骨髓的前体细胞在消化道局部的分化发育，故能在刺激后迅速恢复细胞数量及原有的生物学活性。
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有报道禁食及寒冷刺激均可导致脾淋巴细胞杀伤活性一过性降低[9]，与我们的实验结果基本一致。但在本实验中还观察到水浸限制刺激初期脾淋巴细胞杀伤活性出现短暂升高，这很可能与自律神经的应激调节和儿茶酚胺等肾上腺皮质激素的释放增加有关。而且脾淋巴细胞的杀伤活性逐渐降低，甚至在刺激后第5天降至正常水平以下，在第9天仍未完全恢复到正常水平(图2)，这可能是水浸限制刺激导致胸腺的一过性萎缩，从而脾淋巴细胞来源短暂不足，导致脾淋巴细胞数的下降及其杀伤活性的降低[9]。
通过比较IEL和脾淋巴细胞的杀伤活性，可了解在相同刺激条件下消化道局部和全身免疫系统的不同反应性。为解释消化道局部粘膜免疫的特殊性及与消化道疾病发生的关系提供了依据。
实验性消化道溃疡上皮淋巴细胞毒活性的变化 受国家自然科学基金项目39600133资助
作者简介：刘北星，女，33岁，免疫研究室讲师，主要研究粘膜免疫
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4 参考文献
1 石川博通.消化管におけゐIEL细胞分化.Medical Immunology,1993;25(3):209
2 Rocha B,Vassali P,Guy-Grand D. The extrathymic T-cell development.Pathway Immunol Today,1992;13:449
3 Rocha B,Vassali P,Guy-Grand D.The Vβ repertoire of mouse gut homodimeric CD8+ intrepithelial T cell receptor α/β+ lymphocytes reveals a major extrathymic pathway of T cell differentiation.J Exp Med,1991;173:483
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4 Viney J I,Kilshaw P J，macDonald T T.Cytotoxic α/β+ and γ/δ+ T cell in murine intestinal epithelium.Eur J Immunol,1990;20:1623
5 刘北星，石川博通.水浸拘束ストレスのマウス肠管上皮细胞间Tリンパ球(IEL)に及ばす影响.Digestive Organ and Immunology,1995;30(2):66
6 高木敬次郎，罔部进.脏器炎とその疾患モデル.东京：医学书院，1976：136
7 陈丙莺，马建吟，黄饮田 et al. 简易自然杀伤试验-LDH释放改良法.上海免疫学杂志，1989；9(4)：218
8 细川友秀，竹原浩司，西泰明 et al. 水浸拘束ストレスのマウス消化管免疫系への影响.消化器と免疫，1992；26：52
9 Nakamura K,Aoike A,Hosokawa T et al.Effect of food-restriction stress on immune response in mice.J of Newroimmunology,1990;30:23
〔收稿1997-09-30 修回1998-03-05〕, 百拇医药