恶性黑素瘤细胞株细胞间粘附分子1的改变及临床意义
作者：夏建新 中山树一郎 占部和敬 母义明
单位：夏建新 130041长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科；中山树一郎，占部和敬 日本九州大学医学部皮肤科教室；母义明 北京解放军第三零一医院内分泌科
关键词：黑素瘤细胞因子细胞间粘附分子1逆转录聚合酶链反应
中华皮肤科杂志990308
【摘要】 目的 探讨细胞间粘附分子1(ICAM-1)在恶性黑素瘤细胞株的表达及临床意义。方法用体外细胞培养方法、逆转录聚合酶链反应技术，观察恶性黑素瘤细胞株MM8-1在温热及某些细胞因子刺激下，细胞形态、细胞增殖能力及ICAM-1的基因水平变化。结果温热、γ-干扰素、肿瘤坏死因子α可使细胞形态改变、细胞增殖能力下降、ICAM-1的表达增加，白介素2未能影响细胞形态及增殖能力，也未能使ICAM1明显改变。结论 恶性黑素瘤细胞株ICAM-1的表达与细胞被破坏有关，同时为温热、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α作为治疗恶性黑素瘤的辅助手段提供了理论依据。
The Expression of Intercellular Adhesion Molecule 1 in Human Malignant Melanoma Cell Lines and Its Clinical Significance
XIA Jianxin， * J. Nakayama， K. Urabe， et al. Department of Dermatology， Second Hospital, Norman Bethune Medical University， Changchun 130041
【 Abstract】 Objective To investigate the expression of ICAM 1 in human malignant melanoma ( MM) cell lines and its clinical significance. Methods Human MM cell lines MM8.1 were cultured and analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction( RT-PCR) , the cell shape， cell growth ability and ICAM 1 by mRNA expression under the stimulation of hyperthermia or cytokines were observed. Results Hyperthermia、 γ-IFN and TNF-α could change cell shape， reduce cell growth ability and increase the expression of ICAM-1. IL-2 could not influence the cell shape and the expression of ICAM-1. Conclusion The expression of ICAM-1 in MM cell lines may be correlated with the cell destruction， which provides theoretical basis of supplementary therapy for MM with hyperthermia、 IFNγ and TNFα .
【 Key words】 Melanoma Cytokine Intercellular adhesion molecule-1 Reverse transcription polymerase chain reaction
人恶性黑素瘤(MM)细胞细胞间粘附分子1(ICAM-1)的发现在国外有多家报道[1]，认为MM患者血清中可溶性ICAM-1的浓度与肿瘤进展程度呈正相关。作为MM的辅助治疗手段有温热疗法及细胞因子等。以前曾观察到培养人MM细胞株在体外进行温热及γ干扰素(γ-IFN)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理后，细胞表面ICAM-1的表达及培养液中ICAM-1的释放增加[2]。为探求在温热及细胞因子刺激下MM细胞株ICAM-1的表达发生改变的机理，我们将人MM细胞株在温热及某些细胞因子刺激下，观察细胞形态和增殖能力及ICAM-1的基因水平变化，现报道如下。
材料与方法
一、材料
1培养细胞：恶性黑素瘤细胞株MM8-1是从恶性黑素瘤患者淋巴结转移灶分离培养而确立起来的，保存于日本九州大学医学部皮肤科教室，细胞培养采用文献[3]的方法进行。
2细胞因子及试剂：γ-IFN、TNF-α和白介素2(IL-2)均由大日本制药株式会社提供，ICAM1引物由日本九州大学医学部皮肤科教室提供，ICAM-15′为AATGCCCAGACATCTGTG，ICAM13′为GCGTAGGGTAAGGTTCTT，提取RNA及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂均为日本宝酒造株式会社生物事业部门提供，此对引物扩增片段为327bp。
二、方法
1温热实验：将人MM细胞配成浓度为1×104个/mL，取2mL放入培养皿中培养24h(贴壁)，更换培养液后分别置入37°C、41°C、43°C含5%CO2的培养箱中培养，3h和6h后观察细胞形态，停止温热处理，重新放入37°C培养箱中培养，经过约3d恢复后，观察细胞形态，计数，41°C6h、43°C6h及对照组做RNA的提取及RTPCR。
表1温热及某些细胞因子刺激下恶性黑素瘤细胞增殖能力的改变
不同处理s
细胞株数
细胞数(1×105)
与对照组比较t值
P值
组间比较t值
P值
对照组
3
5.46±0.29
-
-
-
-
41℃6h
3
3.01±0.12
13.52
<0.01
8.89
>0.05
43℃6h
3
1.54±0.26
17.43
<0.01
γ-IFN10U/mL
3
3.45±0.02
11.98
<0.01
2.55
>0.05
γ-IFN100U/mL
3
2.78±0.05
15.77
<0.01
TNF-α10U/mL
3
4.11±0.24
6.21
<0.01
1.96
>0.05
TNF-α100U/mL
3
3.62±0.36
6.89
<0.01
IL-210U/mL
3
6.25±0.41
2.72
>0.05
>0.05
1.45
IL-2100U/mL
3
5.74±0.45
0.90
>0.05
γ-IFN+TNFα10U/mL
3
2.97±0.55
6.931
<0.01
0.12
>0.05
γ-IFN+TNFα100U/mL
3
3.01±0.14
3.17
<0.01
2细胞因子刺激实验：将上述细胞同时做细胞因子刺激实验，浓度为1×104个/mL，贴壁培养24h，更换培养液后分别加入10U/mL、100U/mL的γ-IFN、TNF-α、IL-2及γ-IFN+TNF-α，37°C培养72h后观察细胞形态，计数，收集γ-IFN、TNF-α、IL-2组细胞(浓度均为100U/mL)，做RNA的提取及RTPCR。
3RNA的提取：①将细胞剥离(用胰蛋白酶-EDTA)，放入15cm的离心管中2000r/min5min离心，弃上清液；②放入表面活性剂Catrimox-14TM1mL溶解细胞，并将此溶液移回原试管中；③1000r/min5min，弃上清液；④加入锂试剂1mL，振动，15000r/min5min，弃上清液；⑤加入冷的70%乙醇1mL洗沉淀物，吸净乙醇，干燥10min；⑥放入50μLDEPC水溶液，溶解沉淀物，-70°C保存。
4ICAM-1的RT-PCR：逆转录反应前先将标本90°C5min处理后再置于冰上急剧冷却。逆转录反应试剂为：3′-引物1μL(终浓度2.5μmol/L)，10×RNAPCR缓冲液2μL，MgCl24μL(终浓度5mmol/L)，dNTPs8μL(终浓度1mmol/L)，核苷酸酶抑制剂0.5μL(1U/μL)，逆转录酶1μL(025U/μL)，样本2μL，RNA酶自由水1.5μL。逆转录反应条件：42°C30min，99°C5min，5°C5min，此时已合成cDNA。PCR反应试剂为：MgCl26μL(终浓度25mmol/L)，5′-引物1μL(终浓度0-2μmol/L)，RNAPCR缓冲液8μL，Taq酶0.5μL，加DEPC水补至100μL，Taq酶于98°C预变性5min后加入。反应条件：94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，共35个循环，末次置72°C7min，反应结束后，取10μL反应产物在含溴化乙锭(EB)的15%琼脂糖凝胶中电泳30min，紫外灯下观察结果。为了避免各标本中总RNA的差异，用β-肌动蛋白测各标本中总RNA量。
5ICAM-1cDNA量的测定[4]及结果分析：电泳后，用CCD(charge-coupleddevice)影像系统测定每条带的EB荧光密度，将ICAM-1CDNA的EB荧光密度除以β-肌动蛋白的EB荧光密度得出ICAM-1mRNA专用单位。因β-肌动蛋白mRNA在同一种细胞的含量是一致的，其量与总RNA的量成正比，其意义在于消除加样不均所致的每一样本mRNA量的不一致。
表2各样本的ICAM1mRNA荧光密度及其相对值
mRNA
对照
TNF-α
γ-IFN
IL-2
41℃6h
43℃6h
ICAM-1
24282
53903
52484
20053
22628
33874
β-肌动蛋白
27590
19903
21580
35318
35402
25106
ICAM-1/β-肌动蛋白
0.88
2.71
2.43
0.57
0.64
1.35
结果
1细胞形态学改变：温热及γ-IFN、TNF-α均可改变细胞形态，表现为细胞形态不规则，胞膜不清，大小不等，温度越高，热处理时间越长，细胞形态变化越明显。细胞因子中尤以TNFα与γ-IFN合用细胞形态改变最明显。
2细胞增殖能力的改变：如表1，数据处理采用t检验。
3.ICAM-1cDNA量的测定：如表2，从中可以看出TNF-α(100U/mL)使ICAM-1增加3.08倍(2.71/0.88)，γ-IFN(100U/mL)使ICAM-1增加2.76倍(2.43/0.88)，43℃6h使ICAM-1增加1.54倍(1.35/0.88)，IL-2及41℃6h未能使ICAM-1增加。
讨论
目前对于肿瘤的治疗除了手术、放疗、化疗以外，还有细胞因子及温热疗法等，某些细胞因子常被应用于肿瘤的辅助治疗如干扰素及肿瘤坏死因子等，本实验中，用γ-IFN、TNF-α及IL2在体外作用于MM细胞，结果观察到：γ-IFN、TNF-α可破坏细胞，使细胞增殖能力下降，体外实验证实了γ-IFN、TNF-α的抗肿瘤作用，IL2未能改变细胞形态，也未能影响细胞的增殖能力。日本九州大学医学部皮肤科采用局部温热灌流疗法治疗进行期的四肢MM，通过超声波观察可见肿瘤体积缩小，取得了较好的临床效果[5]，本实验中，采用41℃及43℃处理3h和6h，从中观察到，温热处理后，随着温度的增高，热处理时间的延长，细胞形态变化越明显，细胞增殖能力下降越明显，与对照组比较及组间比较P<0/01，证实了温热效应的搞肿瘤作用。
ICAM-1又称CD54抗原，在某些肿瘤及炎症反应时其表达增加[6]，许多文献已报道了MM患者皮损及血清中ICAM-1增高，并与疾病的进展程度呈正相关，并认为是疾病进展与预后不良的指标[7]，体外实验也有报道温热、IFN及TNF可增加细胞表面ICAM-1的表达(蛋白水平)[2]，本实验通过各种刺激因素，在观察细胞形态及细胞增殖能力的同时，从基因水平观察了MM细胞株ICAM1的变化，从实验中观察到：①MM细胞株ICAM1的表达增加与细胞被破坏有关，不论温热、γ-IFN、TNF-α，凡能使细胞形态改变，细胞增殖能力下降的因素，均能使ICAM-1的表达增加。②IL-2(10U/mL及100U/mL)未能改变细胞形态，细胞增殖能力没有下降，ICAM-1也未见增高，因而IL2作为肿瘤的辅助治疗手段有待进一步研究。
我们认为，ICAM-1的表达增加在体内与体外可能是由不同机制完成的。在体内，MM皮损中，常伴有大量淋巴细胞浸润，可能淋巴细胞与肿瘤细胞相互“粘连”，以诱导体液或细胞免疫，而使ICAM-1表达增加。在体外，温热、γ-IFN、TNF-α可直接破坏细胞，如同炎症反应时，细胞被破坏一样，ICAM-1的表达增加。
参考文献
1江口弘晃，堀越贵志，高桥诚，他.恶性黑色肿におけるICAM-1发现.日皮会，1992，102：807-814.
2管晓春，中山树一郎，中岛学，他.ヒト恶性黑色肿细胞のハイパ-サ-ミアあるいはサイトカインによるICAM-1发现と可溶性ICAM-1放出の变动に关する研究.日皮会，1997，107：747-753.
3 Nakayama J， Moroi Y， Toshitani A,et al. Responses of B16 melanoma cell lines,F1 and F10, to hyperthermia lymphokine activated killer cells and a combination of both in vitro. Br J Dermatol， 1992， 126： 131- 136.
4 Yokoi H， Natsuyama S， Iwai M， et al. Non radioisotopic quantitative RT PCR to detect changes in mRNA levels during early mouse embryo development. Biochem Biophys Res Commun， 1993， 195： 769- 775.
5 Nakayama J， Takeuchi M， Nagae S， et al. Hyperthermic isolated limb perfusion with intra arterial administration of carboplatin and/ or interferon- β for the treatment of malignant melamoma of the leg. J Dermatol， 1994， 21： 915- 922.
6 冯信忠.细胞粘附分子与皮肤病理.国外医学皮肤性病学分册，1997，23:109-111.
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(收稿：1998-02-12修回：1998-07-14)
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