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编号:10500078
血小板/T细胞活化抗原1
http://www.100md.com 《中华微生物学和免疫学杂志》 1999年第3期
     作者:孙凯 冯琦 金伯泉

    单位:孙凯 710031 西安,西京医院肝胆外科;冯琦 血液内科;金伯泉 第四军医大学免疫教研室

    关键词:

    中华微生物学和免疫学杂志990337 1985年Burns等以活化T细胞为免疫原制备了抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体,并将其中1株单克隆抗体Leo-A1识别的抗原命名为人T细胞系特异性活化抗原1(T lineage-specific activation antigen1, TLiSA1),实验证实TLiSA1参与了CTL细胞的活化与分化〔1-3〕。随后的实验发现TLiSA1也高表达于血小板表面,并与血小板的活化和凝集功能有关,遂将此抗原重新命名为血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)〔4〕。1997年我实验室与澳大利亚Newcastle大学癌症研究中心合作成功克隆了人PTA1 cDNA〔5〕。随后,我室又成功克隆了长臂猿和猴PTA1全长cDNA。PTA1基因的克隆为进一步深入探讨PTA1的功能打下了良好的基础。
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    有趣的是,PTA1的基因序列与1996年DNAX分子与细胞生物学研究院Shibuya等发表的DNAM-1分子(DNAX accessory molecular-1, DNAM-1)序列相同。DNAM-1分子的发现过程同PTA1十分相似,最初作者制备针对人CTL的单抗,发现其中DX11单抗能明显抑制CTL对多种肿瘤细胞系(如Colo205、PA-1、MCF7等)的杀伤作用。Shibuya等首先从外周血单个核细胞(PBMC)中通过DX11单抗亲和层析纯化了DX11识别的抗原,进行了部分蛋白序列测定,以多肽对应的PCR引物扩增出DNAM-1的部分片段,再以32 P标记的探针进行筛选,最终获得了DNAM-1的cDNA序列。Shibuya认为DNAM-1分子是一种新的粘附分子,并可能与信号转导有关〔6〕

    到目前为止,PTA1的配体(PTA1 ligand, PTA1L)尚未基因克隆成功。本实验室已成功构建、表达了PTA1胞膜外区/IgG1 Fc段融合蛋白,通过PTA1/Ig融合蛋白进行的免疫组化及粘附阻断实验证实PTA1配体表达于肿瘤细胞系Colo205细胞膜表面。PTA1配体的鉴定正在进行之中。
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    PTA1的基因及结构

    1997年Sherrington等从以pCDM8为载体的活化Jurkat细胞cDNA文库中,通过Leo-A1单抗panning的方法筛选得到人PTA1阳性克隆〔5〕。人PTA1基因为单拷贝基因,定位于染色体18q22-q23。其cDNA全长1.4kb,5和3端分别有174bp和111bp非编码区。开放读框1 011bp,编码336个氨基酸,包括18个疏水氨基酸的信号肽,成熟蛋白由318个氨基酸组成,属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成,形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域,这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的一个。PTA1分子第19和90位的保守半胱氨酸形成链内二硫键,第134和204位的保守半胱氨酸形成第二个链内二硫键,这2个二硫键分别起到稳定胞膜外区2个结构域的作用。在90位和204位半胱氨酸处均存在免疫球蛋白超家族V样结构域的特征性基序Asp-X(Gly或Ala)-X-Try-X-Cys基序。PTA1胞膜外区含有8个潜在的N-糖基化位点和3个潜在的O-糖基化位点。当用内切糖苷酶(Endo F)消化N-连接的糖基后,PTA1的相对分子质量减小了30×103,表明PTA1分子胞膜外区是高度糖基化的,这可能与PTA1参与分子识别有关。PTA1的糖基中含有大量的唾液酸,神经氨酸酶(neuraminidase)消化唾液酸后,其pI由3.5~4.2转变为7.8~8.2。PTA1穿膜区由25个疏水氨基酸组成。胞浆区有61个氨基酸,含有3个酪氨酸、6个丝氨酸和6个苏氨酸,胞浆区尾部含有一段EDIYVNY基序,中央酪氨酸的氨基端有2个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸(ED),羧基端为缬氨酸、天冬酰胺和酪氨酸(VNY),此基序可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)的底物。并可以和蛋白酪氨酸磷酸酶2(protein tyrosine phosphatase 2, PTP2)氨基端的SH2结构域结合。另外,在PTA1胞浆区还存在着酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ)和PKC作用的底物S/T结构。胞浆区的上述结构和基序提示PTA1分子可能参与T细胞和血小板活化的信号转导过程〔4,5〕。人、猿、猴PTA1分子cDNA及蛋白水平的同源性为93%~95%,表明PTA1在生物进化过程中高度保守并可能具有重要的功能。
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    Burns等通过Leo-A1单抗亲和层析的方法从血小板上纯化了PTA1分子,并进行了蛋白部分序列测定,证实PTA1分子为一全新的分子。通过纯化的PTA1分子再次免疫制备了抗PTA1的单克隆抗体NEWE1和NEWI1〔3〕。而后通过免疫沉淀证实从血小板、Jurkat细胞和T细胞上沉淀下来的分子是相同的。采用流式细胞仪检测发现Leo-A1和NEWE1能结合到PMA刺激的Jurkat细胞膜表面,并且平均荧光强度相同,但NEWI1不能在PMA刺激的Jurkat细胞膜表面着色,当增加Jurkat细胞膜通透性后,NEWI1能使Jurkat细胞着色,并且获得与Leo-A1和NEWE1相同的荧光强度,表明NEWI1识别的表位位于PTA1胞浆区。

    用Leo-A1单抗进行的血小板裂解物免疫沉淀证实PTA1相对分子质量为(65~70)×103,蛋白带并不均一。O'Farrell双维电泳(two dimensional gel analysis)表明从活化T细胞免疫沉淀得到的PTA1分子为一弥散产物,pI范围为4.0~6.5,而血小板来源的PTA1分子的pI为3.5~4.2,其差别可能是由于糖基化不同造成的,用神经氨酸酶切除唾液酸后,两种来源的PTA1分子pI均转变为8.0,相对分子质量减少为(60~65)×103〔4〕。Burns等还发现,在不同的细胞系及不同的刺激条件下,通过免疫沉淀有2~3种相关蛋白同PTA1分子共沉淀下来,相对分子质量为(65~90)×103不等,pI4.0~6.5。当用Leo-A1单抗及不同血小板活化剂刺激血小板时,PTA1被快速磷酸化,同时相关蛋白中的部分分子也发生了低水平的磷酸化〔4,7〕。但这些共沉淀分子的特性、作用及结构仍不清楚。这些附加蛋白在人类嗜T淋巴细胞Ⅰ型病毒感染的HUT102B2细胞系中总能被免疫沉淀下来,在PHA刺激的T细胞中有时能沉淀下来,而在Jurkat细胞系中未能沉淀下这种蛋白。这些蛋白的发现总与肌动蛋白(actin)同时存在,提示这些蛋白定位于细胞内。
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    用125I标记PMA刺激的Jurkat细胞及血小板胞膜,再用磷酸肌醇磷脂酶C(phosphatidyl inositol phospholipase C)处理细胞,然后在Jurkat细胞上清中可以检测到从细胞膜上释放的PTA1抗原,表明PTA1分子至少是部分通过糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol, GPI)方式锚定于细胞膜上的。其它参与细胞信号转导的膜表面分子中,有部分是通过GPI方式锚定于细胞膜表面的。而在血小板上清中未发现PTA1抗原的释放,可能血小板PTA1分子主要以跨膜方式连接于血小板胞膜上,另一种可能是血小板胞膜对外源性酶的作用不敏感。

    PTA1的表达及表达调节

    已获得的实验证据表明,PTA1主要表达于巨核/血小板谱系、活化T细胞、NK细胞、单核细胞、胸腺细胞、及多种转化的造血细胞系。PTA1较高水平地表达于血小板,平均1 200个分子/每个血小板〔4〕。PTA1在巨核/血小板谱系有组成性表达,并且受到TPA(PKC激活剂)及PHA的上调。在部分白血病细胞系中,PTA1具有异质性表达(如红白血病细胞TF-1、巨核细胞Dami及HEL组成性表达PTA1,而红白血病细胞K562不表达PTA1〔9〕。上述结果提示,PTA1可能与髓样干细胞→CFU-GEMM→巨核细胞→血小板的发育过程及功能有关。另外,某些T细胞杂交瘤、T细胞白血病细胞高表达PTA1,HUT-102B2细胞系表达较高水平的PTA1,长臂猿细胞系MLA-144也高表达PTA1分子〔8〕
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    PHA活化的正常T细胞及混合淋巴细胞反应中的活化T细胞表达PTA1分子,并受细胞因子及其它活化剂的调节,其中IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、TNF-α及佛波酯PMA(phorbol ester)均对PTA1表达有上调作用。IL-1和IL-2最佳反应剂量为200U/ml,PMA的最佳浓度为20~50ng/ml。几乎所有的刺激实验均表明PTA1在刺激后半小时至1小时内引起Leo-A1 McAb结合的减少,随后在10~20小时内PTA1的表达达到高峰。TGF-β对PTA1的表达有下调作用〔3〕

    PMA和IL-2对PTA1表达的上调作用依赖于蛋白质的合成。100μg/ml放线菌酮(cycloheximide)即完全抑制了IL-2和PMA对PTA1表达的诱导。而IL-1的刺激实验有所不同,在实验早期PTA1的表达没有减少,表达的高峰在刺激后7~8小时,15~18小时后降回本底水平,放线菌酮对IL-1的诱导作用几乎无影响,表明IL-1诱导的PTA1快速表达过程不依赖于蛋白质的合成。这一现象,提示可能存在细胞内PTA1分子的储存和PTA1受细胞因子调节的再分布。而且,在血小板中确实存在着膜结合的空泡结构和tortou管道系统,可以作为血小板PTA1分子的胞浆储存池〔4〕
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    PHA或CD3 McAb能刺激静止T细胞PTA1抗原的表达。但PHA对Jurkat细胞PTA1的表达无刺激作用,组成性高表达PTA1的HUT102B2细胞在受PHA刺激后,表达水平反而下降。

    除MLA-144细胞受PMA刺激后PTA1表达下降外,几乎所有测试细胞受PMA刺激后PTA1的表达均升高。其中,Jurkat细胞对PMA的刺激反应最为敏感和强烈,静止Jurkat细胞不表达PTA1 mRNA,当Jurkat细胞受PMA刺激12小时后开始转录PTA1 mRNA,其转录子1.6~5.0kb不等。PHA预先刺激的外周血T细胞受PMA刺激后,首先PTA1的表达下降并低于未处理水平,6小时后开始渐渐升高,24~30小时后达到高峰(PTA1表达几乎增高5倍),但这种上调作用出乎意料地被A23187完全阻断。单独的PHA、CD3 McAb和A23187均无刺激PTA1表达的作用,当上述试剂分别同PMA同时作用时,均明显减弱或完全阻断了PMA对PTA1表达的诱导作用。
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    PTA1的功能

    1.刺激血小板活化及聚集

    PTA1 McAb属于血小板刺激型抗体,这类抗体与巨核细胞发育及免疫性血小板减少有密切的联系,如CD41/CD61(gpⅡb/Ⅲa)、CD9、CD36抗体。PTA1 McAb可以诱导血小板活化、聚集,这种作用需要抗体Fc段的介导,Leo-A1 McAb去除Fc段后即失去了刺激血小板聚集的功能〔4,7〕。有意义的是PTA1 McAb对格兰茨曼血小板功能不全(Glanzmen's thrombasthenia)患者血小板无活化及促聚集作用,提示PTA1可能与血小板功能异常性疾病的发病机理有关〔4〕。NEWE1在5μg/ml以上浓度均能直接刺激血小板分泌和凝集,NEWE1刺激血小板凝集的潜伏期明显延长,并且这一潜伏期依赖于抗体的浓度。

    2.在混合淋巴细胞反应中抑制CTL的分化
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    将Leo-A1 McAb或其F(ab')2片段加入MLC或T细胞培养体系中能抑制T细胞向细胞毒T细胞分化,明显减少CTL及LAK细胞产率,这一作用不依赖抗体的Fc段。PTA1 McAb只能在MLC初期发挥作用,抑制CTL的分化,在杀伤阶段Leo-A1 McAb不能抑制CTL的细胞毒活性,提示PTA1作用于CTL的分化阶段〔1-3〕。但DX11 McAb能在杀伤相抑制CTL对多种肿瘤细胞的杀伤〔6〕,提示Leo-A1及DX11 McAb识别的PTA1表位可能不同。

    Leo-A1及NEWE1 McAb能以剂量依赖方式抑制CD3诱导的T细胞增殖,它们单独或联合均不能刺激PBMC和纯化的T细胞的增殖。在MLC反应体系中加入10μg/ml抗体,第7天时实验组3H-TdR的掺入率要比对照组低50%左右。

    但Leo-A1及NEWE1 McAb对PHA诱导的单个核细胞增殖无抑制作用,对亚适剂量的PHA (1μg/ml)和绵羊红细胞刺激的纯化T细胞的增殖也无抑制作用,这2种抗体对CD2(T111和T112刺激)诱导的T细胞增殖反应亦无抑制作用,提示PTA1与CD2活化通路是不相同的。
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    3.PTA1可能参与信号转导

    PTA1与Tactile、neuroglian及CEA家族的粘附分子有一定的同源性,PTA1的表达特点及上述同源性提示PTA1可能是某种细胞外分子的细胞膜受体〔7〕。PTA1胞浆区具有PTK、酪蛋白激酶Ⅱ、PKC等多种蛋白激酶的底物结构,其胞浆区的EDIYVNY基序可以作为非受体型蛋白酪氨酸激酶的底物,在其氨基端有2个带负电荷的氨基酸残基,这2个残基与其羧基端的3个残基构成了SH2分子的识别位点,提示PTA1可能参与细胞的信号转导〔5〕。血小板颗粒的释放被认为与蛋白激酶C(PKC)的活化有关,Leo-A1 McAb能持续性诱导血小板聚集,且这一过程不依赖于血小板颗粒的释放。

    当Leo-A1 McAb结合PTA1分子后引起了该分子的酪氨酸磷酸化,抑制蛋白磷酸化的激酶抑制剂能抑制血小板的聚集,酪氨酸磷酸化被公认为是信号转导中的主要生化事件〔7〕。由于PTA1分子的胞浆区不含任何激酶活性及可能的结构域,因此PTA1可能通过此SH2识别位点与胞浆内的其它信号转导分子发生相互作用。
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    4.PTA1与疾病的关系

    已获得的实验证据显示,PTA1与免疫相关性疾病有着密切的关系,这些疾病主要包括自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植排斥反应。PTA1在移植物抗宿主病、肾综合征出血热、尖锐湿疣患者PBMC,及胃癌浸润淋巴细胞、桥本氏甲状腺炎浸润T细胞中有较高水平的表达。由于PTA1分子表达于活化T细胞,因此PTA1可能参与了这些疾病的免疫应答或免疫病理过程〔9,10〕

    Tabata等发现,类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者的外周血及关节液T细胞PTA1的表达水平明显增高。在上述患者中存在着全身或局部T细胞的活化,这可能与上述疾病的发病机理有关〔11〕。在肌炎患者中,PTA1表达水平比正常对照增高,并且PTA1的表达水平与疾病的活动性相关〔12〕。在出血热患者中,CD25及PTA1的表达均升高,在急性期明显高于康复期,提示出血热患者处于较高水平的细胞免疫状态,这有利于机体清除病原体〔13〕。在心脏及肾脏等器官移植患者中,PTA1以及其它的T细胞活化标记(如IL-2R)均高于正常对照,但在心脏移植患者中,PTA1的表达水平与病情未见明显的联系〔14〕
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    PTA1分子是具有重要功能的新分子,有关PTA1的进一步研究尚有大量的工作要做。PTA1及PTA1L的组织细胞分布、功能、PTA1/PTA1L的相互作用及其介导的信号转导过程、PTA1与疾病的关系及PTA1L基因克隆是本课题今后进一步研究的主要内容。

    参考文献

    1 Burns GF, Triglia T, Werkmeister-JA, et al. TLiSA1, a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors. J Exp Med,1985,161∶1063-1078.

    2 Chen LK, Bensussan A, Burns GF, et al. Tourvieille-B; SAllospecific proliferative human T-cell clones acquire the cytotoxic effector function after three months in culture, in IL-2 conditioned medium. Hum Immunol,1986,17∶30-36.
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    3 Jin B, Scott JL, Vadas MA, et al. TGF beta down-regulates TLiSA1 expression and inhibits the differentiation of precursor lymphocytes into CTL and LAK cells. Immunology,1989,66∶570-576.

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    5 Sherrington PD, Scott JL, Jin BQ, et al. TLiSA(PTA1) activation antigen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the regulation of expression. J Biol Chem,1997,272∶21735-21744.
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    6 Shibuya A, Campbell D, Hunnum C, et al. DNAM-1, a novel adhesion molecule involved in the cytolytic function of T lymphocytes. Immunity, 1998,4∶573-581.

    7 Zuzel M, Walton S, Burns GF, et al. A monoclonal antibody to a 67kD cell membrane glycoprotein directly induces persistent platelet aggregation independently of granule secretion. Brit J Haematol,1991,79∶466-473.

    8 田方,金伯泉,姜绍谆,等.一种新的免疫球蛋白超家族成员PTA1的细胞分布及表达研究.细胞与分子免疫学,1996,12∶53-57.
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    10 王坚,胡绍文,王泊云,等.自身免疫性甲状腺病浸润T细胞活化与滤泡细胞DR抗原表达.中华医学杂志,1992,27∶77-80.

    11 Tabata H, Hara M, Kitani A, et al. Hirose-T expression of TLiSA1 on T cells from patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Immunopathol,1989,52∶366-375.

    12 Miller FW, Love LA, Barbieri SA, et al. Lymphocyte activation markers in idiopathic myositis: changes with disease activity and differences among clinical and autoantibody subgroups. Clin Exp Immunol, 1990, 81∶373-379.
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    13 Huang C, Jin B, Wang M, et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome: relationship between pathogenesis and cellular immunity. J Infect Dis,1994,169∶868-870.

    14 Loertscher R, Forbes RD, Halabi G, et al. Expression of early and late activation markers on peripheral blood T lymphocytes does not reliably reflect immune events in transplanted hearts. Clin Transplant,1994,8∶230-238.

    (收稿:1998-06-30 修回:1998-10-20), 百拇医药