C型肉毒素毒性评价
作者：宋文佳 王雅文 袁林 刘玉瑛
单位：宋文佳 王雅文 袁林 刘玉瑛 中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050
关键词：
C型肉毒素毒性评价 肉毒毒素是肉毒梭菌繁殖时产生的外毒素，是一种强烈的神经毒素。根据其抗原性不同，分为A、B、C、D、E、F和G型，其中仅A、B、E、F型能引起人类中毒[1]。C型肉毒素(Botulin type C)是由C型肉毒梭菌产生的一种高分子蛋白质毒素[2]，由两个亚单位通过二硫键联接成双链分子。青海省兽医生物药品制造厂将C型肉毒素作为一种新型生物毒素灭鼠剂，灭鼠效果好。由于联合国生物武器公约组织已将肉毒毒素(包括C型肉毒素)列入严格管理名单，我国亦为该公约的入约国。为了确切了解和评价C型肉毒素的毒性，我们进行了急性毒性(包括急性经口、经皮，对眼睛和皮肤刺激性)和亚急性毒性(30天喂养)的实验[3]。
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1 材料和方法
1.1 材料
Wistar大鼠(中国医学科学院动物中心提供，合格证：医动字第01-3008号)，体重180～220g；大耳白家兔，体重2～3kg。
C型肉毒素由青海省兽医生物药品制造厂提供，为棕褐色带腐肉臭味液体，比重1.040。在酸性环境(pH3.5～6.8)下稳定，碱性环境易失活。同批样品于-20℃小包装冷冻保存，以避免反复冻融影响毒效，使用前取小包装在冷水中融化，限3天内使用。
1.2 实验方法
根据国标方法进行急性经口毒性试验、急性经皮毒性试验、急性皮肤刺激试验、眼刺激试验和亚急性经口毒性试验；做血尿常规和病理组织学检查。使用日立7060型全自动生化分析仪测定生化指标(试剂盒由中国科学院生物物理所北京中生生物工程高技术公司生产)：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)测定采用酶动力法，尿素氮(BUN)测定采用尿酶动力法，血清总蛋白(TP)测定采用双缩脲终点法，血清白蛋白(ALB)测定采用溴酚兰终点法。
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2 结果
2.1 急性毒性
2.1.1 急性经口毒性：染毒后1～2小时内未见明显症状，然后随染毒剂量大小出现活动减少、食量下降、四肢瘫软等症状；高剂量组更加严重，个别大鼠口鼻出现血性分泌物，死亡后解剖见胸腔有血性积液。动物一般在1～3天内死亡。用霍恩氏法计算半数致死量为雄性大鼠LD50 58.4mg/kg(95%可信限43～79.4mg/kg)；雌性大鼠LD50 200mg/kg(95%可信限137～291mg/kg)。
2.1.2 急性经皮毒性：染毒后各剂量组均未见明显中毒症状，用霍恩氏法计算半数致死量为：
雄性大鼠LD50>5g/kg；
雌性大鼠LD50>5g/kg；
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2.1.3 急性皮肤刺激试验：染毒后未见对动物局部皮肤有刺激和腐蚀作用。
2.1.4 眼刺激试验：染毒后未见家兔角膜、结膜、虹膜损伤刺激反应。
2.2 亚急性经口毒性
2.2.1 一般症状 染毒后大鼠进食量下降，活动减少，肌力肌张力下降。染毒10～15天后，大鼠体重开始增加，活动增多，但肌力与肌张力仍较对照组低。
2.2.2 C型肉毒素对大鼠体重的影响：实验1～15天内随染毒剂量增大，大鼠体重有减小趋势；约10～15天后染毒组大鼠开始增重，染毒组雄性大鼠体重改变更为明显(见附表)。
附表 C型肉毒素亚急性毒性试验大鼠血清生化指标、体重增长率及尿蛋白测定
指标
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ALT(U/L)
AST(U/L)
ALP(U/L)
BUN
(mmol/L)
TP(g/L)
ALB(g/L)
A/G
体重增长
率(%)
尿蛋白
(-/+/++)
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对照组
49.0±7.8
185.4±29.6
192.6±22.6
6.9±1.0
64.0±1.5
33.6±0.3
1.1
163.9
5/0/0
低剂量
39.6±4.4
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182.0±23.9
161.0±33.1
5.9±1.0
64.4±2.2
33.2±1.2
1.1
132.4
5/0/0
中剂量
46.6±7.3
170.0±34.8
207.2±106.0
, 百拇医药
6.8±1.0
66.6±5.7
33.8±1.9
1.1
142.0
2/1/2
高剂量
43.6±5.3
222.6±39.5(1)
163.2±40.5
5.4±0.7
62.5±2.6
, 百拇医药
33.7±0.8
1.2
140.2
0/0/5
雌性
对照组
29.6±5.9
126.0±24.4
79.8±18.1
6.8±1.1
68.7±3.4
35.0±0.7
, 百拇医药
1.0
118.4
5/0/0
低剂量
30.0±5.3
145.0±32.1
88.2±7.8
7.7±1.3
67.9±3.5
34.6±2.2
1.0
112.3
, 百拇医药
5/0/0
中剂量
24.6±4.4
106.0±22.4
90.6±7.9
7.0±0.9
64.5±3.1
34.3±1.2
1.1
112.1
4/1/0
高剂量
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36.0±4.6
192.0±26.7(1)
90.0±22.6
7.3±0.9
66.7±5.7
33.8±2.0
1.0
119.1
4/1/0
注：(1)P<0.05 2.2.3 C型肉毒素染毒大鼠血、尿常规检查结果：血常规检查显示，染毒组动物与对照组间的各项指标无明显差异。白细胞(♂：6.3×109～14.2×109个/L，♀：6.1×109～11.3×109 个/L)、白细胞分类、血色素(♂：143～155g/L，♀：141～151g/L)均在正常范围内。尿常规检查结果发现，染毒剂量与尿蛋白量存在剂量反应关系，雄性组更为明显(见附表)；尿比重(1.008～1.032)、pH(6～7)均在正常范围；镜检未见异常，各组均见尿沉淀物中有少量结晶。
, 百拇医药
2.2.4 生物化学检查：AST随染毒剂量增大有增高趋势。其它指标如ALT、ALP、BUN、TP、ALB、A/G等与对照组无明显差异(见附表)。
2.2.5 脏器系数与病理组织学检查：由脏器系数测定结果可知，各染毒组动物的脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸或卵巢的脏器系数与对照组无明显差异。病理组织学检查也未见异常。
3 结论
根据我国《农药安全性毒理学评价程序》的农药分级标准和《农药登记毒理学试验方法》[3，4]，C型肉毒素经口毒性属中等毒性，对雄性动物毒性比较大；其经皮毒性属低毒；对皮肤和眼无刺激性。急性中毒后主要症状是肌肉麻痹，肌力和肌张力降低。
在C型肉毒素的亚急性毒性试验中，低剂量组(1/80LD50：♂0.73mg/(kg.d)，♀2.5mg/(kg.d)，大鼠的各项检验指标均未发现异常改变。中剂量组大鼠出现尿蛋白。高剂量组除尿蛋白量增加外，血中AST显著增高，以上改变在雄性动物更为显著。30天亚急性毒性试验表明，C型肉毒素对雌、雄大鼠的最大无作用剂量分别为0.73和2.5mg/(kg.d)。
, 百拇医药
C型肉毒素作为一种蛋白型生物毒剂，在自然环境中易降解，因此对生态环境保护的优势将使它具有其它合成杀鼠剂无法替代的作用。
参考文献
1 江伟.营养与食品卫生学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992：248—250
2 张洪洋等译.实用食品卫生.北京大学出版社，1992：82—88
3 GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法
4 卫生部农业部.农药安全性毒理学评价程序.北京：中华人民共和国卫生部中华人民共和国农业部，1991：1—12
1998-08-25收稿, http://www.100md.com
单位：宋文佳 王雅文 袁林 刘玉瑛 中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050
关键词：
C型肉毒素毒性评价 肉毒毒素是肉毒梭菌繁殖时产生的外毒素，是一种强烈的神经毒素。根据其抗原性不同，分为A、B、C、D、E、F和G型，其中仅A、B、E、F型能引起人类中毒[1]。C型肉毒素(Botulin type C)是由C型肉毒梭菌产生的一种高分子蛋白质毒素[2]，由两个亚单位通过二硫键联接成双链分子。青海省兽医生物药品制造厂将C型肉毒素作为一种新型生物毒素灭鼠剂，灭鼠效果好。由于联合国生物武器公约组织已将肉毒毒素(包括C型肉毒素)列入严格管理名单，我国亦为该公约的入约国。为了确切了解和评价C型肉毒素的毒性，我们进行了急性毒性(包括急性经口、经皮，对眼睛和皮肤刺激性)和亚急性毒性(30天喂养)的实验[3]。
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1 材料和方法
1.1 材料
Wistar大鼠(中国医学科学院动物中心提供，合格证：医动字第01-3008号)，体重180～220g；大耳白家兔，体重2～3kg。
C型肉毒素由青海省兽医生物药品制造厂提供，为棕褐色带腐肉臭味液体，比重1.040。在酸性环境(pH3.5～6.8)下稳定，碱性环境易失活。同批样品于-20℃小包装冷冻保存，以避免反复冻融影响毒效，使用前取小包装在冷水中融化，限3天内使用。
1.2 实验方法
根据国标方法进行急性经口毒性试验、急性经皮毒性试验、急性皮肤刺激试验、眼刺激试验和亚急性经口毒性试验；做血尿常规和病理组织学检查。使用日立7060型全自动生化分析仪测定生化指标(试剂盒由中国科学院生物物理所北京中生生物工程高技术公司生产)：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)测定采用酶动力法，尿素氮(BUN)测定采用尿酶动力法，血清总蛋白(TP)测定采用双缩脲终点法，血清白蛋白(ALB)测定采用溴酚兰终点法。
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2 结果
2.1 急性毒性
2.1.1 急性经口毒性：染毒后1～2小时内未见明显症状，然后随染毒剂量大小出现活动减少、食量下降、四肢瘫软等症状；高剂量组更加严重，个别大鼠口鼻出现血性分泌物，死亡后解剖见胸腔有血性积液。动物一般在1～3天内死亡。用霍恩氏法计算半数致死量为雄性大鼠LD50 58.4mg/kg(95%可信限43～79.4mg/kg)；雌性大鼠LD50 200mg/kg(95%可信限137～291mg/kg)。
2.1.2 急性经皮毒性：染毒后各剂量组均未见明显中毒症状，用霍恩氏法计算半数致死量为：
雄性大鼠LD50>5g/kg；
雌性大鼠LD50>5g/kg；
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2.1.3 急性皮肤刺激试验：染毒后未见对动物局部皮肤有刺激和腐蚀作用。
2.1.4 眼刺激试验：染毒后未见家兔角膜、结膜、虹膜损伤刺激反应。
2.2 亚急性经口毒性
2.2.1 一般症状 染毒后大鼠进食量下降，活动减少，肌力肌张力下降。染毒10～15天后，大鼠体重开始增加，活动增多，但肌力与肌张力仍较对照组低。
2.2.2 C型肉毒素对大鼠体重的影响：实验1～15天内随染毒剂量增大，大鼠体重有减小趋势；约10～15天后染毒组大鼠开始增重，染毒组雄性大鼠体重改变更为明显(见附表)。
附表 C型肉毒素亚急性毒性试验大鼠血清生化指标、体重增长率及尿蛋白测定
指标
, 百拇医药
ALT(U/L)
AST(U/L)
ALP(U/L)
BUN
(mmol/L)
TP(g/L)
ALB(g/L)
A/G
体重增长
率(%)
尿蛋白
(-/+/++)
, http://www.100md.com 雄性
对照组
49.0±7.8
185.4±29.6
192.6±22.6
6.9±1.0
64.0±1.5
33.6±0.3
1.1
163.9
5/0/0
低剂量
39.6±4.4
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182.0±23.9
161.0±33.1
5.9±1.0
64.4±2.2
33.2±1.2
1.1
132.4
5/0/0
中剂量
46.6±7.3
170.0±34.8
207.2±106.0
, 百拇医药
6.8±1.0
66.6±5.7
33.8±1.9
1.1
142.0
2/1/2
高剂量
43.6±5.3
222.6±39.5(1)
163.2±40.5
5.4±0.7
62.5±2.6
, 百拇医药
33.7±0.8
1.2
140.2
0/0/5
雌性
对照组
29.6±5.9
126.0±24.4
79.8±18.1
6.8±1.1
68.7±3.4
35.0±0.7
, 百拇医药
1.0
118.4
5/0/0
低剂量
30.0±5.3
145.0±32.1
88.2±7.8
7.7±1.3
67.9±3.5
34.6±2.2
1.0
112.3
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5/0/0
中剂量
24.6±4.4
106.0±22.4
90.6±7.9
7.0±0.9
64.5±3.1
34.3±1.2
1.1
112.1
4/1/0
高剂量
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36.0±4.6
192.0±26.7(1)
90.0±22.6
7.3±0.9
66.7±5.7
33.8±2.0
1.0
119.1
4/1/0
注：(1)P<0.05 2.2.3 C型肉毒素染毒大鼠血、尿常规检查结果：血常规检查显示，染毒组动物与对照组间的各项指标无明显差异。白细胞(♂：6.3×109～14.2×109个/L，♀：6.1×109～11.3×109 个/L)、白细胞分类、血色素(♂：143～155g/L，♀：141～151g/L)均在正常范围内。尿常规检查结果发现，染毒剂量与尿蛋白量存在剂量反应关系，雄性组更为明显(见附表)；尿比重(1.008～1.032)、pH(6～7)均在正常范围；镜检未见异常，各组均见尿沉淀物中有少量结晶。
, 百拇医药
2.2.4 生物化学检查：AST随染毒剂量增大有增高趋势。其它指标如ALT、ALP、BUN、TP、ALB、A/G等与对照组无明显差异(见附表)。
2.2.5 脏器系数与病理组织学检查：由脏器系数测定结果可知，各染毒组动物的脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸或卵巢的脏器系数与对照组无明显差异。病理组织学检查也未见异常。
3 结论
根据我国《农药安全性毒理学评价程序》的农药分级标准和《农药登记毒理学试验方法》[3，4]，C型肉毒素经口毒性属中等毒性，对雄性动物毒性比较大；其经皮毒性属低毒；对皮肤和眼无刺激性。急性中毒后主要症状是肌肉麻痹，肌力和肌张力降低。
在C型肉毒素的亚急性毒性试验中，低剂量组(1/80LD50：♂0.73mg/(kg.d)，♀2.5mg/(kg.d)，大鼠的各项检验指标均未发现异常改变。中剂量组大鼠出现尿蛋白。高剂量组除尿蛋白量增加外，血中AST显著增高，以上改变在雄性动物更为显著。30天亚急性毒性试验表明，C型肉毒素对雌、雄大鼠的最大无作用剂量分别为0.73和2.5mg/(kg.d)。
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C型肉毒素作为一种蛋白型生物毒剂，在自然环境中易降解，因此对生态环境保护的优势将使它具有其它合成杀鼠剂无法替代的作用。
参考文献
1 江伟.营养与食品卫生学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992：248—250
2 张洪洋等译.实用食品卫生.北京大学出版社，1992：82—88
3 GB 15670-1995 农药登记毒理学试验方法
4 卫生部农业部.农药安全性毒理学评价程序.北京：中华人民共和国卫生部中华人民共和国农业部，1991：1—12
1998-08-25收稿, http://www.100md.com