虎杖金银花联用抗Ⅰ型疱疹病毒药效分析*
作者：王志洁
单位：武汉 430071 湖北医科大学病毒研究所
关键词：虎杖；金银花；疱疹；病毒
中国现代应用药学990404 摘要 目的：HSV-1可引起多种疾病，ACV(阿昔洛韦)治疗HSV-1感染效果虽好，但易出现耐药毒株。新药Cidofovir对ACV耐药毒株效果好，毒性也大。HSV疫苗研究主要针对生殖道疱疹，效果不好。为了解决这些问题，研制新的抗HSV中药方剂的最佳配比，我们进行了此项研究。方法：以ACV为阳性对照，采用空斑减数试验，观察了虎杖金银花单用及联用抗HSV-1F株及HS-1株的药效，并且用中效作用原理对联用药效进行了分析。结果：在HEp-2细胞系统中，当虎杖/金银花是1(ED50)虎杖/2(ED50)金银花时，对F株及HS-1株有直接杀灭及感染的阻断作用，以及对F株及HS-1株增殖有抑制作用，当空斑减数率从20%～90%时，CI<1，协同作用极为明显，这是首选联用比。结论：虎杖与金银花以1(ED50)虎杖/2(ED50)金银花联用，对F株的治疗指数(TI)为ACV的4 607，287和425倍；对HS-1株TI为ACV的548，393和509倍。我们认为对于抗HSV-1而言，这是有利的药物联用组合。
, 百拇医药
Effects analysis of antiherpes simplex virus type-1 with combination of Rhizoma polygoni cusp idati and Lonicerahypoglauca Miq
Wang Zhijie(Wang ZJ)(Deparment of Oncogenic Virus,Virus Research Institute,Hubei Medical University,Wuhan 430071)
ABSTRACT OBJECTIVE：Herpes simplex virus type-1 will result in many diseases.Although therapeutical effect of ACV on HSV-1 infection is good,resistant strains against ACV appear easily.New drug cidofovir can cure the infection of ACV resistant strains,but it′s toxicity is large.The research about HSV vaccines focuses mainly on genital herpes and the effect is not good.This research was carried out to resolve these problems,and to exploit the best dispensing proportion of new antiherpes simplex virus recipe of Chinese medicinal herbs.METHODS:We observed antiherpes effects on simplex virus type-1 strains F and HS-1 of polygoni cuspidati and lonicera hypoglauca Miq which were used lonely or in combination by p-laque reduction assay,and made analysis of combination by median effect principle.RESULTS:In HEp-2 cell system,when the combination ratio was equalled to 1(ED50) of polygoni cuspidati/2(ED50) of lonicera hypoglauca Miq and plaque reduction rate was from 20% to 90%,whether in direct virucidal effect and blockade of infection of HSV-1 strain and HS-1 Ftrain,or in the inhibition on the multiplication of HSV-1F,HS-1 strain with the combination index<1,they had displayed evident synergism.Therefore this ratio was the best choice.CONCLUSION:When polygoni cuspidati and lonicera hypoglauca Miq were used in combination of 1(ED50) of polygoni cuspidati/2(ED50) of lonicera hypoglauca Miq,the treatment indexes(TI) against F strain were 4 607,287,425 times of ACV TIs,the TIs against HS-1 strain were 548,393,509 times of ACV TIs.We think this is a advantageous antiviras combination to herpes simplex virus type-1.
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KEY WORDS rhizoma polygoni cuspidati,lonicera hypoglauca Miq,Herpes simplex virus
Ⅰ型人疱疹病毒可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病。阿昔洛韦(aciclovir)对小鼠脉络膜视网膜炎及疱疹性角膜结膜炎有显著疗效[1,2],也可以抑制无毛小鼠皮下HSV-1 KOS株的感染[3],然而在治疗人类感染时易产生ACV耐药株[4,5],流式细胞仪分析[6]表明,HSV-1 ACV敏感株ED50为0.45～1.47μmol,HSV-1 ACV耐药株ED50为140～3 134μmol[6]，为ACV的应用造成了一定的困难。目前用新药cidofovir治疗患HSV感染而对ACV无反应的AIDs病人效果较好[4],可是cidofovir静注有很大的肾毒性:12%表现为蛋白尿，5%尿肌酐增加，而且15%的病人有中性粒细胞减少[5]。HSV-2糖蛋白D和B重组疫苗对人类反复发作的生殖道疱疹没有作用[7],HSV-1亚单位疫苗(Skinner疫苗)可使女病人生殖道疱疹复发频率降低，但是结果不具统计学显著性[8]。筛选研制抗病毒新药就成为十分紧迫的任务了。
, 百拇医药
据报道，10%虎杖水煎液对HSV-1、HSV-2、甲型流感病毒京科68-1株、埃可病毒11型等多种病毒有抑制作用[9]。金银花是中药制剂康尔心及小儿咳喘宁的主要成分[10，11]。对CVB3及呼吸道合胞病毒感染有抑制作用，对HIV-RT有弱抑制作用[12]。为了研制新的抗HSV中药方剂，我们对虎杖、金银花单用及联用抗HSV-1F株及HS-1株药效进行了观察，并且用“中效作用原理”对联用药效进行了分析，以求得联用效果最好的方剂配比，为中药方剂的研制提供实验依据。现在将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药：由湖北医科大学附属二院中药房提供，并经附属二院中医科方学韫副教授、程仲敏教授鉴定是虎杖(Polygonum Cuspidatum Siebet zucc)、金银花(Lonicera hypoglauca Miq-腺叶忍冬)。用水提醇沉法处理，减压浓缩，消毒G6漏斗抽滤制成浓度分别为1 216 600和595 200μg/ml的虎杖金银花母液。
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1.1.2 阿昔洛韦(ACV)(丽珠集团湖北科益药业有限公司，批号:980751-3)，实验中用作阳性对照。
1.1.3 细胞及病毒：HEp-2细胞(湖北省医学科学院病毒研究所)。HSV-1F株及HS-1株(本室保存)。按本室常规培养细胞，HSV-1F株TCID50为108/0.1ml,HS-1株TCID50为109/0.1ml。
1.2 方法
1.2.1 空斑减数试验：以ACV为阳性对照组。本实验采用3种方式进行。①药物对HSV-1的直接杀灭，病毒悬液与含药培养液37℃孵1h后，感染细胞。②药物对HSV-1感染细胞的阻断作用，以含药培养液预先与细胞孵2h，再以HSV-1感染细胞。③药物对HSV-1增殖的抑制作用，先感染HSV-1，再以含药培养液孵育。每组均设置正常细胞及单用病毒感染(加含等体积PBS的培养液)的对照，所用感染复数达1PFu/细胞，经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羧甲基纤维素)，培养48h，弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数。
, 百拇医药
1.2.2 细胞毒性试验：HEp-2细胞长成单层后，加入含药培养液37℃孵育72h后，以苔盼蓝拒染法数死活细胞数。
1.2.3 药物联用的实验设计：按韩锐主编[13]的《肿瘤化学预防及药物治疗》一书中的方法进行。
1.3 结果的统计学处理
1.3.1 ED50、IC50的计算采用“加权直线回归法”。
1.3.2 联用结果评判：采用Chou和Talalay导出的多种药物效量公式及合用指数(Combination Index,CI)方法[13，14]。CI<1，表示协同；CI=1，表示相加；CI>1，表示拮抗。
2 结 果
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2.1 虎杖金银花联用对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭
从表1，2及图1可以看出：①金银花及虎杖直接杀灭HSV-1F株及HS-1株的Dm(ED50)均比ACV的Dm(ED50)小，说明两者的直接杀灭作用比ACV强。②虎杖与金银花以不同的Dm(ED50)比值联用时，联用Dm(ED50)均小于单用的及ACV的Dm，说明联用效果比单用及ACV药效强。③当虎杖/金银花=1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，中效线(d线及d′线)的斜率及Dm值均最小，直到空斑减数率(fa)≤90%，CI均<1，协同作用极为明显。
表1 虎杖金银花联用对HSV-1直接杀灭的中效方程参数 药 物
中效方程参数
斜率
, 百拇医药
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.99
13.22
-0.61
0.99(6)
0.63
30.83
, http://www.100md.com -0.14
0.98(4)
虎杖
1.00
6.15
-0.13
0.89*1(7)
0.54
24.22
-0.24
0.98(12)
金银花
0.95
, 百拇医药
8.36
0.11
0.93(7)
0.49
10.84
0.07
0.99(12)
虎杖/金银花=
0.46
1.16
-0.06
0.99(3)
2(Dm)虎/1(Dm)金
, http://www.100md.com
0.82
11.60
-0.28
0.99(4)
虎杖/金银花=
0.41
0.26
-0.10
0.97*2(3)
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.23
5.12
, 百拇医药
0.64
0.95*3(5)
虎杖/金银花=
0.49
2.04
-0.03
0.99*3(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.52
8.80
0.20
0.98*4(3)
, http://www.100md.com
注：*1P<0.01，*2P<0.005，*3P<0.001，*4P=0.001，其余P值均<0.0005。本表中上行数字代表HSV-1F株，下行数字代表HSV-1 HS-1株的实验结果，ED50单位为μg/ml表2 虎杖金银花联用直接杀灭HSV-1的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
, 百拇医药 0.03
0.11
0.27
0.84
2.19
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.03
0.11
0.28
0.99
3.20
1.18
0.82
, 百拇医药
0.57
0.41
0.29
1.52
0.98
0.65
0.22
0.17
虎杖/金银花=
0.01
0.02
0.06
0.17
, 百拇医药
0.80
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.01
0.02
0.06
0.18
0.94
0.67
0.49
0.34
0.23
0.17
0.74
, 百拇医药
0.71
0.50
0.33
0.24
虎杖/金银花=
0.07
0.19
0.42
1.15
2.64
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.07
0.20
, http://www.100md.com
0.46
1.47
4.38
1.07
0.71
0.50
0.33
0.24
1.58
0.81
0.55
0.35
0.26
, 百拇医药
注：本表每上两行数字代表HSV-1F株，下两行数安代表HSV-1 HS-1株的CI值。而两行数之中上行代表药物相互不排斥情况下的CI值，下行数字代表药物相互排斥情况下的CI值
图1 虎杖金银花联用对HSV-1直接杀灭的中效作用图
a,b及a′,b′分别代表虎杖及金银花单用对HSV-1F株及HS-1株直接杀灭的中效线；c,d,e及c′,d′,e′分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花时对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭。c线与e线多项数值太接近，在中效图中只好以一条中效线代表
2.2 虎杖金银花联用对HSV-1增殖的抑制作用
从表3，4及图2可以提出以下结论：①虎杖及金银花对HSV-1F株及HS-1株增殖抑制的Dm数值比ACV的相应数值小，两者对HSV-1增殖的抑制作用比ACV强。②虎杖及金银花以不同的Dm比值联用时，联用的Dm值比两种中药单用及ACV的Dm值小，说明联用药效比单用及ACV的药效好。③两药联用抗F株时，d线与e线斜率相近，但e线的斜率更小，当fa≤60%时,CI<1,两药有协同作用。两药联用抗HS-1株时，当虎杖/金银花为1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花或1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花时,d′线与e′线的,Dm值相近，fa从20%～90%,CI<1，协同作用极为明显。
, 百拇医药
表3 虎杖金银花联用对HSV-1增殖抑制的中效方程参数
中效方程参数
斜率
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.60
9.09
-0.08
, 百拇医药
0.99(7)
0.56
20.04
-0.23
0.98(5)
虎杖
1.00
7.58
-0.06
1.00(8)
0.46
13.76
0.32
, http://www.100md.com
0.99(6)
金银花
1.33
3.22
-0.21
0.91(7)
0.49
10.04
0.04
0.99(7)
虎杖/金银花=
0.69
4.16
, 百拇医药
0.11
0.97*1(3)
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.64
10.58
0.14
0.99*1(2)
虎杖/金银花=
0.61
2.85
0.22
0.99(3)
, http://www.100md.com
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.17
4.62
0.70
0.99(4)
虎杖/金银花=
0.60
1.72
-0.09
0.98*2(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.56
, http://www.100md.com
5.08
0.15
0.99(3)
注：*1P<0.005，*2P<0.0025，其余P值均<0.0005。对表的说明同表1表4 虎杖金银花联用抑制HSV-1增殖的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
, 百拇医药
1.21
0.55
0.85
1.46
5.26
2(Dm)虎/1(Dm)金
1.23
0.62
1.02
1.98
10.20
1.54
1.01
, http://www.100md.com
0.71
0.47
0.34
2.08
1.24
0.82
0.51
0.37
虎杖/金银花=
0.20
0.44
0.84
1.91
, 百拇医药
3.78
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.21
0.48
0.99
2.61
6.27
0.75
0.49
0.34
0.22
0.16
0.87
, 百拇医药
0.54
0.37
0.24
0.17
虎杖/金银花=
0.11
0.23
0.44
0.97
1.94
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.11
0.24
, 百拇医药
0.49
1.20
2.81
0.70
0.48
0.38
0.28
0.23
0.82
0.54
0.41
0.30
0.24
, http://www.100md.com
注：本表说明同表2
图2 虎杖金银花联用抑制HSV-1增殖的中效作用图
a,a′,b,b′线分别代表虎杖金银花单用对F株及HS-1株增殖的抑制；c,c′,d,d′,e,e′线分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花联用时对F株及HS-1株增殖抑制的中效线
2.3 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的作用
观察分析表5，6及图3的实验结果，不难看出：①虎杖及金银花阻断HSV-1F株及HS-1株感染的Dm数值比ACV的相应数值为小，两者阻断HSV-1感染的作用比ACV强。②当虎杖与金银花以不同的Dm比值联用时，联用Dm比单用Dm及ACV的Dm小，说明联用药效比两药单用及ACV的药效强。③当虎杖/金银花的1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，不论是阻断F株还是阻断HS-1株的感染，fa从20～90%时，CI<1，协同作用极为明显。表5 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的中效方程参数
, 百拇医药
中效方程参数
斜率
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.56
8.71
0.02
1.00(5)
0.57
, 百拇医药
16.04
-0.18
0.99(10)
虎杖
0.94
2.76
-0.31
0.91(7)
0.40
11.29
0.13
1.00(9)
金银花
, http://www.100md.com
0.79
3.76
-0.04
0.97(9)
0.48
6.35
0.14
0.94(9)
虎杖/金银花=
0.73
1.88
-0.04
1.00(3)
, 百拇医药
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.55
4.02
0.21
0.99(3)
虎杖/金银花=
0.91
1.86
-0.14
0.94*1(3)
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.31
, 百拇医药
2.88
0.55
0.98(5)
虎杖/金银花=
0.79
3.32
0.08
0.98*2(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.27
2.65
0.57
, http://www.100md.com
0.99(5)
注：*1P<0.01，*2P<0.0025，其余P值均<0.0005；对表的说明同表1表6 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
0.44
0.55
, 百拇医药
0.67
0.85
1.05
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.49
0.62
0.77
0.99
1.25
0.61
0.54
0.48
0.43
, http://www.100md.com
0.40
0.70
0.60
0.53
0.47
0.42
虎杖/金银花=
0.63
0.57
0.51
0.47
0.45
1(Dm)虎/2(Dm)金
, 百拇医药
0.71
0.64
0.57
0.52
0.50
0.70
0.49
0.36
0.26
0.20
0.74
0.51
0.37
, 百拇医药
0.26
0.20
虎杖/金银花=
0.90
0.97
1.06
1.19
1.30
1(Dm)虎/1(Dm)金
1.09
1.21
1.34
1.54
, 百拇医药
1.70
0.44
0.39
0.35
0.31
0.28
0.47
0.41
0.36
0.32
0.29
注：对本表说明同表2
图3 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的中效作用图
, 百拇医药
a,a′；b,b′分别代表虎杖金银花单用对F株及HS-1株感染的阻断；c,c′；d,d′；e,e′分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花联用时阻断F株及HS-1株感染的中效线
2.4 虎杖金银花联用的细胞毒
ACV对HEp-2细胞的IC50为1 085μg/ml;而HEp-2细胞对浓度达182 500μg/ml的虎杖及95 230μg/ml的金银花仍能耐受，细胞毒IC50则依次分别为57 850及46 020μg/ml;两药联用细胞毒IC50为98 240μg/ml。
3 讨 论
在上面3种抗病毒实验中，虎杖与金银花联用的药效比两药单用及阳性对照ACV的药效强。尤其当虎杖金银花联用比为1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，不论是对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭，还是对HSV-1F株及HS-1株感染的阻断，以及对HSV-1 HS-1株增殖的抑制，均是空斑减数率从20%～90%时，CI<1，协同作用极为明显。所以这应该是组方时首选的联用比。
, 百拇医药
从治疗指数(Treatment Index,TI)来看，TI=IC50/ED50。如果TI全部按直接杀灭、对增殖的抑制、对感染的阻断的顺序排列。ACV IC50为1 085μg/ml,对HSV-1F株的TI为82,120和124;对HS-1株的TI为35,54和67。虎杖单用对HSV-1F株的TI为9 406,7 631和20 960;对HS-1株TI为2 388,4 204和5 124。金银花单用对HSV-1F株TI为5 504，12 503和10 707；对HS-1株TI为3 714，4 009和6 340。虎杖金银花以1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花联用时，对F株TI为377 846，34 470和52 817；对HS-1株TI为19 187，21 264和34 111。联用时对F株的TI为ACV对F株TI的4 607，287和425倍；对HS-1株的TI为ACV对HS-1株TI的548，393和509倍。这种联用药效比ACV强，毒性比ACV小，是非常有利的抗HSV-1的中药联用组合。
, 百拇医药
本实验采用的两个HSV-1毒株F株及HS-1株均是实验室连续传代的标准株，毒力要比临床新分离的毒株弱些，所以检测出的ED50比所列举的文献报道的小些；再者，检测方法不同也是差异的原因。
“中效作用原理”已为西方医学界广泛应用，但是对我国使用的中草药复方，其药物相互间作用的药效的科学分析，尚未见用此原理分析的报道。本研究目的在于通过用“中效作用原理”对药效的分析，为中药方剂组方配比提供科学的实验依据。我们将在动物实验中检验我们的结果，并进行中药联用抗其它病毒的实验研究。
*本课题由湖北省自然科学基金资助98725号
参考文献
1 Merchant A,Fl-echer J,Medina CA,et al.Pharmacomanipulation of HSV-1 induced chorioretinitis in mice.Eye,1997,11(pt4)∶504.
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收稿日期：1998-04-21, 百拇医药
单位：武汉 430071 湖北医科大学病毒研究所
关键词：虎杖；金银花；疱疹；病毒
中国现代应用药学990404 摘要 目的：HSV-1可引起多种疾病，ACV(阿昔洛韦)治疗HSV-1感染效果虽好，但易出现耐药毒株。新药Cidofovir对ACV耐药毒株效果好，毒性也大。HSV疫苗研究主要针对生殖道疱疹，效果不好。为了解决这些问题，研制新的抗HSV中药方剂的最佳配比，我们进行了此项研究。方法：以ACV为阳性对照，采用空斑减数试验，观察了虎杖金银花单用及联用抗HSV-1F株及HS-1株的药效，并且用中效作用原理对联用药效进行了分析。结果：在HEp-2细胞系统中，当虎杖/金银花是1(ED50)虎杖/2(ED50)金银花时，对F株及HS-1株有直接杀灭及感染的阻断作用，以及对F株及HS-1株增殖有抑制作用，当空斑减数率从20%～90%时，CI<1，协同作用极为明显，这是首选联用比。结论：虎杖与金银花以1(ED50)虎杖/2(ED50)金银花联用，对F株的治疗指数(TI)为ACV的4 607，287和425倍；对HS-1株TI为ACV的548，393和509倍。我们认为对于抗HSV-1而言，这是有利的药物联用组合。
, 百拇医药
Effects analysis of antiherpes simplex virus type-1 with combination of Rhizoma polygoni cusp idati and Lonicerahypoglauca Miq
Wang Zhijie(Wang ZJ)(Deparment of Oncogenic Virus,Virus Research Institute,Hubei Medical University,Wuhan 430071)
ABSTRACT OBJECTIVE：Herpes simplex virus type-1 will result in many diseases.Although therapeutical effect of ACV on HSV-1 infection is good,resistant strains against ACV appear easily.New drug cidofovir can cure the infection of ACV resistant strains,but it′s toxicity is large.The research about HSV vaccines focuses mainly on genital herpes and the effect is not good.This research was carried out to resolve these problems,and to exploit the best dispensing proportion of new antiherpes simplex virus recipe of Chinese medicinal herbs.METHODS:We observed antiherpes effects on simplex virus type-1 strains F and HS-1 of polygoni cuspidati and lonicera hypoglauca Miq which were used lonely or in combination by p-laque reduction assay,and made analysis of combination by median effect principle.RESULTS:In HEp-2 cell system,when the combination ratio was equalled to 1(ED50) of polygoni cuspidati/2(ED50) of lonicera hypoglauca Miq and plaque reduction rate was from 20% to 90%,whether in direct virucidal effect and blockade of infection of HSV-1 strain and HS-1 Ftrain,or in the inhibition on the multiplication of HSV-1F,HS-1 strain with the combination index<1,they had displayed evident synergism.Therefore this ratio was the best choice.CONCLUSION:When polygoni cuspidati and lonicera hypoglauca Miq were used in combination of 1(ED50) of polygoni cuspidati/2(ED50) of lonicera hypoglauca Miq,the treatment indexes(TI) against F strain were 4 607,287,425 times of ACV TIs,the TIs against HS-1 strain were 548,393,509 times of ACV TIs.We think this is a advantageous antiviras combination to herpes simplex virus type-1.
, 百拇医药
KEY WORDS rhizoma polygoni cuspidati,lonicera hypoglauca Miq,Herpes simplex virus
Ⅰ型人疱疹病毒可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病。阿昔洛韦(aciclovir)对小鼠脉络膜视网膜炎及疱疹性角膜结膜炎有显著疗效[1,2],也可以抑制无毛小鼠皮下HSV-1 KOS株的感染[3],然而在治疗人类感染时易产生ACV耐药株[4,5],流式细胞仪分析[6]表明,HSV-1 ACV敏感株ED50为0.45～1.47μmol,HSV-1 ACV耐药株ED50为140～3 134μmol[6]，为ACV的应用造成了一定的困难。目前用新药cidofovir治疗患HSV感染而对ACV无反应的AIDs病人效果较好[4],可是cidofovir静注有很大的肾毒性:12%表现为蛋白尿，5%尿肌酐增加，而且15%的病人有中性粒细胞减少[5]。HSV-2糖蛋白D和B重组疫苗对人类反复发作的生殖道疱疹没有作用[7],HSV-1亚单位疫苗(Skinner疫苗)可使女病人生殖道疱疹复发频率降低，但是结果不具统计学显著性[8]。筛选研制抗病毒新药就成为十分紧迫的任务了。
, 百拇医药
据报道，10%虎杖水煎液对HSV-1、HSV-2、甲型流感病毒京科68-1株、埃可病毒11型等多种病毒有抑制作用[9]。金银花是中药制剂康尔心及小儿咳喘宁的主要成分[10，11]。对CVB3及呼吸道合胞病毒感染有抑制作用，对HIV-RT有弱抑制作用[12]。为了研制新的抗HSV中药方剂，我们对虎杖、金银花单用及联用抗HSV-1F株及HS-1株药效进行了观察，并且用“中效作用原理”对联用药效进行了分析，以求得联用效果最好的方剂配比，为中药方剂的研制提供实验依据。现在将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药：由湖北医科大学附属二院中药房提供，并经附属二院中医科方学韫副教授、程仲敏教授鉴定是虎杖(Polygonum Cuspidatum Siebet zucc)、金银花(Lonicera hypoglauca Miq-腺叶忍冬)。用水提醇沉法处理，减压浓缩，消毒G6漏斗抽滤制成浓度分别为1 216 600和595 200μg/ml的虎杖金银花母液。
, 百拇医药
1.1.2 阿昔洛韦(ACV)(丽珠集团湖北科益药业有限公司，批号:980751-3)，实验中用作阳性对照。
1.1.3 细胞及病毒：HEp-2细胞(湖北省医学科学院病毒研究所)。HSV-1F株及HS-1株(本室保存)。按本室常规培养细胞，HSV-1F株TCID50为108/0.1ml,HS-1株TCID50为109/0.1ml。
1.2 方法
1.2.1 空斑减数试验：以ACV为阳性对照组。本实验采用3种方式进行。①药物对HSV-1的直接杀灭，病毒悬液与含药培养液37℃孵1h后，感染细胞。②药物对HSV-1感染细胞的阻断作用，以含药培养液预先与细胞孵2h，再以HSV-1感染细胞。③药物对HSV-1增殖的抑制作用，先感染HSV-1，再以含药培养液孵育。每组均设置正常细胞及单用病毒感染(加含等体积PBS的培养液)的对照，所用感染复数达1PFu/细胞，经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羧甲基纤维素)，培养48h，弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数。
, 百拇医药
1.2.2 细胞毒性试验：HEp-2细胞长成单层后，加入含药培养液37℃孵育72h后，以苔盼蓝拒染法数死活细胞数。
1.2.3 药物联用的实验设计：按韩锐主编[13]的《肿瘤化学预防及药物治疗》一书中的方法进行。
1.3 结果的统计学处理
1.3.1 ED50、IC50的计算采用“加权直线回归法”。
1.3.2 联用结果评判：采用Chou和Talalay导出的多种药物效量公式及合用指数(Combination Index,CI)方法[13，14]。CI<1，表示协同；CI=1，表示相加；CI>1，表示拮抗。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 虎杖金银花联用对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭
从表1，2及图1可以看出：①金银花及虎杖直接杀灭HSV-1F株及HS-1株的Dm(ED50)均比ACV的Dm(ED50)小，说明两者的直接杀灭作用比ACV强。②虎杖与金银花以不同的Dm(ED50)比值联用时，联用Dm(ED50)均小于单用的及ACV的Dm，说明联用效果比单用及ACV药效强。③当虎杖/金银花=1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，中效线(d线及d′线)的斜率及Dm值均最小，直到空斑减数率(fa)≤90%，CI均<1，协同作用极为明显。
表1 虎杖金银花联用对HSV-1直接杀灭的中效方程参数 药 物
中效方程参数
斜率
, 百拇医药
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.99
13.22
-0.61
0.99(6)
0.63
30.83
, http://www.100md.com -0.14
0.98(4)
虎杖
1.00
6.15
-0.13
0.89*1(7)
0.54
24.22
-0.24
0.98(12)
金银花
0.95
, 百拇医药
8.36
0.11
0.93(7)
0.49
10.84
0.07
0.99(12)
虎杖/金银花=
0.46
1.16
-0.06
0.99(3)
2(Dm)虎/1(Dm)金
, http://www.100md.com
0.82
11.60
-0.28
0.99(4)
虎杖/金银花=
0.41
0.26
-0.10
0.97*2(3)
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.23
5.12
, 百拇医药
0.64
0.95*3(5)
虎杖/金银花=
0.49
2.04
-0.03
0.99*3(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.52
8.80
0.20
0.98*4(3)
, http://www.100md.com
注：*1P<0.01，*2P<0.005，*3P<0.001，*4P=0.001，其余P值均<0.0005。本表中上行数字代表HSV-1F株，下行数字代表HSV-1 HS-1株的实验结果，ED50单位为μg/ml表2 虎杖金银花联用直接杀灭HSV-1的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
, 百拇医药 0.03
0.11
0.27
0.84
2.19
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.03
0.11
0.28
0.99
3.20
1.18
0.82
, 百拇医药
0.57
0.41
0.29
1.52
0.98
0.65
0.22
0.17
虎杖/金银花=
0.01
0.02
0.06
0.17
, 百拇医药
0.80
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.01
0.02
0.06
0.18
0.94
0.67
0.49
0.34
0.23
0.17
0.74
, 百拇医药
0.71
0.50
0.33
0.24
虎杖/金银花=
0.07
0.19
0.42
1.15
2.64
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.07
0.20
, http://www.100md.com
0.46
1.47
4.38
1.07
0.71
0.50
0.33
0.24
1.58
0.81
0.55
0.35
0.26
, 百拇医药
注：本表每上两行数字代表HSV-1F株，下两行数安代表HSV-1 HS-1株的CI值。而两行数之中上行代表药物相互不排斥情况下的CI值，下行数字代表药物相互排斥情况下的CI值
图1 虎杖金银花联用对HSV-1直接杀灭的中效作用图
a,b及a′,b′分别代表虎杖及金银花单用对HSV-1F株及HS-1株直接杀灭的中效线；c,d,e及c′,d′,e′分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花时对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭。c线与e线多项数值太接近，在中效图中只好以一条中效线代表
2.2 虎杖金银花联用对HSV-1增殖的抑制作用
从表3，4及图2可以提出以下结论：①虎杖及金银花对HSV-1F株及HS-1株增殖抑制的Dm数值比ACV的相应数值小，两者对HSV-1增殖的抑制作用比ACV强。②虎杖及金银花以不同的Dm比值联用时，联用的Dm值比两种中药单用及ACV的Dm值小，说明联用药效比单用及ACV的药效好。③两药联用抗F株时，d线与e线斜率相近，但e线的斜率更小，当fa≤60%时,CI<1,两药有协同作用。两药联用抗HS-1株时，当虎杖/金银花为1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花或1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花时,d′线与e′线的,Dm值相近，fa从20%～90%,CI<1，协同作用极为明显。
, 百拇医药
表3 虎杖金银花联用对HSV-1增殖抑制的中效方程参数
中效方程参数
斜率
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.60
9.09
-0.08
, 百拇医药
0.99(7)
0.56
20.04
-0.23
0.98(5)
虎杖
1.00
7.58
-0.06
1.00(8)
0.46
13.76
0.32
, http://www.100md.com
0.99(6)
金银花
1.33
3.22
-0.21
0.91(7)
0.49
10.04
0.04
0.99(7)
虎杖/金银花=
0.69
4.16
, 百拇医药
0.11
0.97*1(3)
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.64
10.58
0.14
0.99*1(2)
虎杖/金银花=
0.61
2.85
0.22
0.99(3)
, http://www.100md.com
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.17
4.62
0.70
0.99(4)
虎杖/金银花=
0.60
1.72
-0.09
0.98*2(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.56
, http://www.100md.com
5.08
0.15
0.99(3)
注：*1P<0.005，*2P<0.0025，其余P值均<0.0005。对表的说明同表1表4 虎杖金银花联用抑制HSV-1增殖的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
, 百拇医药
1.21
0.55
0.85
1.46
5.26
2(Dm)虎/1(Dm)金
1.23
0.62
1.02
1.98
10.20
1.54
1.01
, http://www.100md.com
0.71
0.47
0.34
2.08
1.24
0.82
0.51
0.37
虎杖/金银花=
0.20
0.44
0.84
1.91
, 百拇医药
3.78
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.21
0.48
0.99
2.61
6.27
0.75
0.49
0.34
0.22
0.16
0.87
, 百拇医药
0.54
0.37
0.24
0.17
虎杖/金银花=
0.11
0.23
0.44
0.97
1.94
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.11
0.24
, 百拇医药
0.49
1.20
2.81
0.70
0.48
0.38
0.28
0.23
0.82
0.54
0.41
0.30
0.24
, http://www.100md.com
注：本表说明同表2
图2 虎杖金银花联用抑制HSV-1增殖的中效作用图
a,a′,b,b′线分别代表虎杖金银花单用对F株及HS-1株增殖的抑制；c,c′,d,d′,e,e′线分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花联用时对F株及HS-1株增殖抑制的中效线
2.3 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的作用
观察分析表5，6及图3的实验结果，不难看出：①虎杖及金银花阻断HSV-1F株及HS-1株感染的Dm数值比ACV的相应数值为小，两者阻断HSV-1感染的作用比ACV强。②当虎杖与金银花以不同的Dm比值联用时，联用Dm比单用Dm及ACV的Dm小，说明联用药效比两药单用及ACV的药效强。③当虎杖/金银花的1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，不论是阻断F株还是阻断HS-1株的感染，fa从20～90%时，CI<1，协同作用极为明显。表5 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的中效方程参数
, 百拇医药
中效方程参数
斜率
(m)
Dm(ED50)
Y轴截矩
相关系数r
(自由度)
ACV
0.56
8.71
0.02
1.00(5)
0.57
, 百拇医药
16.04
-0.18
0.99(10)
虎杖
0.94
2.76
-0.31
0.91(7)
0.40
11.29
0.13
1.00(9)
金银花
, http://www.100md.com
0.79
3.76
-0.04
0.97(9)
0.48
6.35
0.14
0.94(9)
虎杖/金银花=
0.73
1.88
-0.04
1.00(3)
, 百拇医药
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.55
4.02
0.21
0.99(3)
虎杖/金银花=
0.91
1.86
-0.14
0.94*1(3)
1(Dm)虎/2(Dm)金
0.31
, 百拇医药
2.88
0.55
0.98(5)
虎杖/金银花=
0.79
3.32
0.08
0.98*2(3)
1(Dm)虎/1(Dm)金
0.27
2.65
0.57
, http://www.100md.com
0.99(5)
注：*1P<0.01，*2P<0.0025，其余P值均<0.0005；对表的说明同表1表6 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的CI值
空斑减数率(fa)(%)
20
40
60
80
90
虎杖/金银花=
0.44
0.55
, 百拇医药
0.67
0.85
1.05
2(Dm)虎/1(Dm)金
0.49
0.62
0.77
0.99
1.25
0.61
0.54
0.48
0.43
, http://www.100md.com
0.40
0.70
0.60
0.53
0.47
0.42
虎杖/金银花=
0.63
0.57
0.51
0.47
0.45
1(Dm)虎/2(Dm)金
, 百拇医药
0.71
0.64
0.57
0.52
0.50
0.70
0.49
0.36
0.26
0.20
0.74
0.51
0.37
, 百拇医药
0.26
0.20
虎杖/金银花=
0.90
0.97
1.06
1.19
1.30
1(Dm)虎/1(Dm)金
1.09
1.21
1.34
1.54
, 百拇医药
1.70
0.44
0.39
0.35
0.31
0.28
0.47
0.41
0.36
0.32
0.29
注：对本表说明同表2
图3 虎杖金银花联用阻断HSV-1感染的中效作用图
, 百拇医药
a,a′；b,b′分别代表虎杖金银花单用对F株及HS-1株感染的阻断；c,c′；d,d′；e,e′分别代表虎杖/金银花为2(Dm)虎杖/1(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花、1(Dm)虎杖/1(Dm)金银花联用时阻断F株及HS-1株感染的中效线
2.4 虎杖金银花联用的细胞毒
ACV对HEp-2细胞的IC50为1 085μg/ml;而HEp-2细胞对浓度达182 500μg/ml的虎杖及95 230μg/ml的金银花仍能耐受，细胞毒IC50则依次分别为57 850及46 020μg/ml;两药联用细胞毒IC50为98 240μg/ml。
3 讨 论
在上面3种抗病毒实验中，虎杖与金银花联用的药效比两药单用及阳性对照ACV的药效强。尤其当虎杖金银花联用比为1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花时，不论是对HSV-1F株及HS-1株的直接杀灭，还是对HSV-1F株及HS-1株感染的阻断，以及对HSV-1 HS-1株增殖的抑制，均是空斑减数率从20%～90%时，CI<1，协同作用极为明显。所以这应该是组方时首选的联用比。
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从治疗指数(Treatment Index,TI)来看，TI=IC50/ED50。如果TI全部按直接杀灭、对增殖的抑制、对感染的阻断的顺序排列。ACV IC50为1 085μg/ml,对HSV-1F株的TI为82,120和124;对HS-1株的TI为35,54和67。虎杖单用对HSV-1F株的TI为9 406,7 631和20 960;对HS-1株TI为2 388,4 204和5 124。金银花单用对HSV-1F株TI为5 504，12 503和10 707；对HS-1株TI为3 714，4 009和6 340。虎杖金银花以1(Dm)虎杖/2(Dm)金银花联用时，对F株TI为377 846，34 470和52 817；对HS-1株TI为19 187，21 264和34 111。联用时对F株的TI为ACV对F株TI的4 607，287和425倍；对HS-1株的TI为ACV对HS-1株TI的548，393和509倍。这种联用药效比ACV强，毒性比ACV小，是非常有利的抗HSV-1的中药联用组合。
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本实验采用的两个HSV-1毒株F株及HS-1株均是实验室连续传代的标准株，毒力要比临床新分离的毒株弱些，所以检测出的ED50比所列举的文献报道的小些；再者，检测方法不同也是差异的原因。
“中效作用原理”已为西方医学界广泛应用，但是对我国使用的中草药复方，其药物相互间作用的药效的科学分析，尚未见用此原理分析的报道。本研究目的在于通过用“中效作用原理”对药效的分析，为中药方剂组方配比提供科学的实验依据。我们将在动物实验中检验我们的结果，并进行中药联用抗其它病毒的实验研究。
*本课题由湖北省自然科学基金资助98725号
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收稿日期：1998-04-21, 百拇医药