脑缺血时乙酰胆碱加强谷氨酸的神经兴奋毒性及受体机制研究*
作者：邢宏义 王才源 关新民
单位：邢宏义，同济医科大学附属协和医院神经内科，武汉 430022； 王才源 关新民，同济医科大学实验医学研究中心神经生物学教研室，武汉 430030
关键词：脑缺血；乙酰胆碱；谷氨酸；神经兴奋毒性
同济医科大学学报990416 摘要 分别用TTC染色和HE染色观察大鼠大脑中动脉闭塞后乙酰胆碱(ACh)和谷氨酸(Glu)对梗塞面积及细胞形态的影响；采用皮质脑电图记录方法，观察大鼠双侧颈总动脉夹闭后，Glu、ACh及ACh受体激动剂、拮抗剂对脑电图恢复时间的影响。结果发现：Glu可使梗塞面积扩大，ACh可使Glu的这种效应放大30%(P<0.01)；脑缺血后Glu使缺血区细胞破坏加重，ACh可加剧细胞的崩解，Glu致缺血性皮质神经元兴奋性存在量效关系，其阈值为10-2 mol/L，ACh可使之降为10-3 mol/L，ACh的这种作用可被阿托品所阻断而不被六羟季胺拮抗，可被氨甲酰胆碱呈浓度-效应模拟，而不被烟碱模拟。可见，脑缺血时，乙酰胆碱通过M型受体降低谷氨酸兴奋毒性的阈值而表现出加强谷氨酸的神经兴奋毒性作用。
, 百拇医药
中图法分类号 R743.31， R971， R741
Study on Acetylcholine Potentiating Glutamate Neuronal Excitotoxicity and Its Mechanism of Receptors during Cerebral Ischemia
Xing Hongyi，Guan Xinmin
Department of Neurology, Xiehe Hosipital, Tongji Medical University,Wuhan 430022
Wang Caiyuan
Department of Neurobiology, Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract TTC staining and HE staining were used to observe the influence of acteylcholine (ACh) and glutamate (Glu) on infarction area and cell morphology after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats, and electrocorticography (ECG) applied to investigate the influence of Glu, ACh, ACh receptor activator and ACh antagonist on restoring time of EEG during bilateral common carotid artery occlusion (CCAO) in rats. The results showed that Glu could enlarge the infart area, ACh magnified the effect of Glu about 30% (P<0.01)； Glu maked cell damage heavier in ischemic area after cerebral ischemia, ACh aggravated cell to destroy. Glu induced neocortex neuronal excitation in a dose-effect manner. The threshold of neuronal excitotoxicity induced by Glu was 10-2 mol/L, which could be lowered to 10-3 mol/L by ACh. The effect of ACh could be antagonized by atropine, rather than by hexamethonium, simulated by carbachol in a concentration-effect manner, rather than by nicotine. It was concluded that ACh potentiated glutamate induced neuronal excitotoxicity by way of m-ACh-R to lower Glu threshold.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemic; acetylcholine; glutamate; neuronal excitotoxicity
近年来兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)的神经兴奋毒性与缺血性脑损伤的关系基本明确[1]，乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是脑内经典的兴奋性递质，有研究表明ACh可加强谷氨酸(glutamate, Glu)诱导的培养海马神经元变性[2]，那么这两种兴奋性神经递质在脑缺血中的关系到底怎样呢?本研究从形态和机能上证实了ACh可加强Glu的神经兴奋毒性，并发现这种作用是通过M型受体来实现的。
1 材料与方法
1.1 脑缺血动物模型
由同济医科大学实验动物学部提供成年健康的Wistar大鼠，体重为200～250 g。参照Bederson[3]方法制作大脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO), 大鼠用氨基甲酸乙酯(250 g/L，1 g/kg，腹腔注射)麻醉，固定于脑立体定位仪上，在左眼与左耳孔中点作一弧形切口，充分暴露颧弓后，在颧弓与颞鳞骨交接处向前1～2 mm作一直径为4 mm的骨窗，小心暴露大脑中动脉(MCA)、大脑下静脉与嗅束，并在后二者之间用电热烧灼器轻轻烫烧MCA使其凝闭。用止血钳及玻璃分针小心分离双侧颈总动脉，穿线并用动脉夹夹闭来制作双侧颈总动脉闭塞(common carotid artery occlusion, CCAO)模型。
, 百拇医药
1.2 主要实验试剂及给药方式
谷氨酸(北京化工厂产品，分析纯)，依色林(Fluka公司产品)，阿托品(湖北省医药公司分装室提供)，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)(E.M.K进口分装)，六烃季胺、烟碱、氨甲酰胆碱(Sigma公司产品)。所有工具药均采用侧脑室给药，参照包新民[4]图谱定位，即调整门齿平面使其较耳间线平面低2.4 mm，侧脑室位于前囱后1.5 mm、矢状缝旁开1.5 mm、脑表面下3.5 mm。所用药物均用生理盐水配制，每次侧脑室给药5 μl。
1.3 TTC染色及梗塞面积的计算
动物经MCAO处理24 h后断头取脑，于视交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔3 mm切一片，将脑片置于用0.2 mol/L pH 7.4～7.8 PB新鲜配制的20 g/L TTC染液中水浴(37℃ 20～30 min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，固定于100 g/L中性甲醛液中，以供彩色照像和进一步切片作HE染色。用求积仪计算出梗塞区的面积和整个脑片的截面积，二者之比即为梗塞区占整个脑片的相对面积百分比。
, 百拇医药
1.4 HE染色及神经细胞形态观察
脑片置AO恒冷箱切片机中-20℃作10 μm的切片，HE染色，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察神经细胞形态，根据白希清[5]标准判断缺血性神经细胞损害。
1.5 皮质脑电图的记录
用颅骨钻在大鼠冠状缝后1 mm，矢状缝旁开1 mm左右分别开一个直径为5 mm的圆形骨窗，暴露硬脑膜，用Ag-AgCl的记录电极(Φ=1 mm)置于脑顶叶外侧(冠状缝后1 mm，矢状缝旁开5 mm)皮质感觉运动区的硬脑膜表面，在大鼠鼻子上方无脑组织处接上参考电极，作用电极接上前置放大器(时间常数0.1 s，滤波60 Hz，增益×10000)，信号输出到四导生理记录仪上描记皮质脑电图(electrocorticography, ECoG)。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 谷氨酸和乙酰胆碱对梗塞面积的影响
选用阻断ACh水解的胆碱酯酶抑制剂(依色林，Ese)以间接提高脑内ACh水平。侧脑室给药Glu 10-1 mol/L 5 μl，Ese 10g/5 μl。结果发现生理盐水组(NS)、谷氨酸组(Glu)、谷氨酸+依色林组(Glu+Ese)大鼠MCAO梗塞面积百分比分别为(12.1±0.5)%、(15.6±0.3)%、(20.1±0.4)%(
±s，n=8)。可见Glu可使梗塞面积扩大，而Ese则使之增加约30%(P<0.01)。表明：Glu能增强缺血性损害作用，ACh能加剧Glu的神经毒性效应。
2.2 大脑皮质神经元缺血性损伤的组织学观察
正常大脑皮质神经细胞排列有序，脑缺血皮质细胞排列紊乱，胞核缩小，胞浆嗜伊红变，细胞呈三角形；给谷氨酸后可见大量成片的神经元坏死，部分格子细胞出现，但纹状体细胞结构尚清晰；给谷氨酸和依色林后可见大量崩解的神经细胞，其结构模糊，并且纹状体中可见火焰状坏死灶，表明乙酰胆碱加强谷氨酸促使神经元坏死。
, 百拇医药
2.3 乙酰胆碱加强谷氨酸毒性作用的受体药理学
采用CCAO脑缺血再灌注动物模型，以缺血后皮质脑电图(ECoG)的恢复时间为观察指标，研究ACh加强Glu毒性作用的受体机制。
2.3.1 脑缺血时乙酰胆碱对皮质神经元的作用：侧脑室注射Ese 10 μg 2 min后夹闭双侧CCA，持续3 min后放夹再灌注开始计时，观察ECoG的恢复时间，结果发现正常大鼠为(248±0.1) min，而缺血大鼠则为(7.6±0.2) min，二者比较有极显著差异(P<0.01)，提示脑缺血时ACh可能作为一种有害物质引起神经元的过度兴奋，推测可能与缺血性脑损伤有关。
2.3.2 Clu的神经兴奋毒性及ACh的加强作用：大鼠随机分为缺血+谷氨酸组(CI+Glu)和缺血+谷氨酸+依色林组(CI+Ese+Glu)，侧脑室注射，Ese(10 μg/5 μl)浓度固定不变，而Glu的浓度则递增，结果如表1示，CCAO的大鼠脑电活动变化是短暂的，放夹后1 min即恢复正常；脑缺血时Glu致神经兴奋毒性的阈值为10-2 mol/L，而加有Ese后其阈值降为10-3 mol/L。表明脑缺血时Glu致皮质神经元的兴奋毒性存在量效关系，ACh可能是通过降低Glu致神经元兴奋毒性的阈值来表现出加强Glu神经兴奋毒性作用。
, 百拇医药
表1 ACh加强不同浓度Glu(mol/L)对缺血皮层兴奋性的影响(
, min,n=6) 组别
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
0.5
Glu
1.1±0.1
, 百拇医药
0.9±0.1
1.0±0.1
0.9±0.1
13.8±0.7▲
22.2±3.3▲
Glu+Ese
7.8±0.2
8.2±0.4
8.6±0.6
12.50.5
22.2±1.5**
, 百拇医药
22.4±1.9**
与10-2 mol/L浓度组比较 ▲ P<0.01；与10-3 mol/L浓度组比较 **P<0.01
2.3.3 ACh加强Glu神经兴奋毒性的受体机制：选用Glu致神经元兴奋的阈值浓度(10-2 mol/L)为观察点，研究了m-ACh-R激动剂(氨甲酰胆碱，CC)、拮抗剂(阿托品，AT)、n-ACh-R激动剂(烟碱，NT)、拮抗剂(六烃季胺，HM)对ACh加强Glu神经兴奋毒性效应的影响(表2)。结果发现：Ese加强Glu的兴奋性神经毒性的效应可被AT阻断而不被HM拮抗，可为CC呈浓度-效应关系所模拟，NT则无此效应。表明：ACh加强Glu兴奋毒性效应是通过m-ACh-R而发挥的。表2 ACh-R激动剂和拮抗剂对Glu神经
, http://www.100md.com 兴奋效应的影响(,min)
组 别
例数
脑电恢复时间
NS
6
1.0±0.1
Ese
6
7.6±0.2*
Ese+AT
, 百拇医药 5
1.0±0.1▲
Ese+HM
5
7.5±0.4
CC100 ng/5 μl
5
1.0±0.1
CC500 ng/5 μl
5
6.0±0.6*
CC1000 ng/5 μl
, 百拇医药
5
31.5±2.2*
NT
5
1.0±0.1
与NS相比 *P<0.001，与Ese相比 ▲ P<0.013 讨论
评价缺血性脑损伤的方法很多，既可用形态学方法直接观察脑缺血致细胞损害的严重程度，又可用脑功能改变来早期监测细胞电活动，Kochs[6]强调了脑电活动的恢复程度和恢复时间与神经细胞功能恢复有很好的相关性，并且脑缺血后ECoG恢复神经延长，反映了缺血介导的神经元功能异常。
脑缺血急性期神经元由于对缺血的应激而出现多种化学物质和神经递质的释放，导致神经元兴奋性增加，加速了细胞能量的耗竭，细胞损害加重。兴奋性氨基酸(EEA)是已基本明确的在脑缺血中有明显神经兴奋毒性的中枢性神经递质，Olney称之为兴奋毒性作用[7]，谷氨酸是脑内EAA受体的内源性配基，也是脑内含量最多、毒性最强的兴奋性氨基酸。乙酰胆碱(ACh)是脑内一种重要的经典神经递质，在脑缺血中的作用尚未明了，有研究表明脑缺血时皮质ACh的释放明显上升[8]。
, 百拇医药
人们早就注意到一种生物效应是多种神经递质之间相互作用、相互调制的结果，ACh与Glu都是中枢兴奋性递质，二者在脑缺血中的关系如何呢?有研究表明，Glu能够促使皮质和纹状体ACh释放[9]，而ACh则可加强Glu的神经毒性作用[2]。
本研究从形态学方面证实了ACh有加强Glu毒性的作用，使脑梗塞面积扩大、梗塞区细胞结构破坏加重，进一步用皮质脑电图方法从功能上研究了受体作用机制，发现ACh加强Glu的神经兴奋毒性是通过M型受体来发挥的，我们的结果与Gonzales[10]在培养脑片上实验的结论相似，同时还发现ACh可降低Glu致神经兴奋毒性的阈值，即从10-2 mol/L降为10-3 mol/L。鉴于乙酰胆碱是促进学习记忆维持觉醒的重要神经递质，特别是脑梗塞恢复期和多发性脑梗塞痴呆治疗方案中需增加脑内ACh含量，以改善智能，那么ACh在脑缺血急性期的这种促进Glu神经兴奋毒性作用该怎么对待?以及脑缺血恢复期ACh与Glu之间的作用如何，均有待进一步探讨。
, 百拇医药
乙酰胆碱与谷氨酸之间的相互作用机制是很复杂的，ACh通过M型受体加强Glu的毒性作用，那么这种效应涉及怎样的信使传导系统以及M型受体的亚型，有无其他递质参与等问题，尚需进一步研究。
注：国家科委资助项目(No.92IJ26-17)
作者简介：邢宏义，男，1969年生，主治医师
参 考 文 献
1 Diemer N H, Johansen F F, Jorgersen M B. N-methy-D-aspartate and non-N-methy-D-aspartate antagonists in global cerebral ischemia. Stroke, 1990,21(suppl Ⅲ):39
2 Mattson M P. Acetylcholine potentiates glutamate-induced neurodegeneration in cultured hippocampal neurons. Brain Res, 1989,497:402
, 百拇医药
3 Bederson J B, Pitts L H, Tsujim et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evalution of the model and development of a neurologic examination. Stroke, 1986,17:472
4 包新民主编.大鼠脑受体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.1～6
5 白希清主编.病理学.北京：科学出版社，1992.1164～1165
6 Kochs E, Hoffman W E, Wemer C et al. The effects of propofol on brain electrical activity, neurologic outcome and neuronal damage following incomplete ischemia in rats. Anesthesiology, 1992,76:245
, http://www.100md.com
7 Olney J W, Sharpe L G. Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate. Science, 1969,166:386
8 Phillis J W, Smith-Barbour M, Perkins L M et al. Acetylcholine output from the ischemic rat cerebral cortex effects of adenosine agonists. Brain Res, 1993,613:337
9 Ulus I H, Buyukuysal R L, Wurtman R J. N-methyl-D-asartate increases acetylcholine release from rat stratum and cortex: its effect augmented by choline. J pharmacol Exp Ther, 1992,261:1122
10 Gonzales R A, Roper L C, Westbrook S L. Cholinergic modulation of N-methyl-d-aspartate-evoked [3H]norepinephrine release from rat cortical slices. J Pharmacol Exp Ther, 1993,264:282
(1998-07-08 收稿), http://www.100md.com
单位：邢宏义，同济医科大学附属协和医院神经内科，武汉 430022； 王才源 关新民，同济医科大学实验医学研究中心神经生物学教研室，武汉 430030
关键词：脑缺血；乙酰胆碱；谷氨酸；神经兴奋毒性
同济医科大学学报990416 摘要 分别用TTC染色和HE染色观察大鼠大脑中动脉闭塞后乙酰胆碱(ACh)和谷氨酸(Glu)对梗塞面积及细胞形态的影响；采用皮质脑电图记录方法，观察大鼠双侧颈总动脉夹闭后，Glu、ACh及ACh受体激动剂、拮抗剂对脑电图恢复时间的影响。结果发现：Glu可使梗塞面积扩大，ACh可使Glu的这种效应放大30%(P<0.01)；脑缺血后Glu使缺血区细胞破坏加重，ACh可加剧细胞的崩解，Glu致缺血性皮质神经元兴奋性存在量效关系，其阈值为10-2 mol/L，ACh可使之降为10-3 mol/L，ACh的这种作用可被阿托品所阻断而不被六羟季胺拮抗，可被氨甲酰胆碱呈浓度-效应模拟，而不被烟碱模拟。可见，脑缺血时，乙酰胆碱通过M型受体降低谷氨酸兴奋毒性的阈值而表现出加强谷氨酸的神经兴奋毒性作用。
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中图法分类号 R743.31， R971， R741
Study on Acetylcholine Potentiating Glutamate Neuronal Excitotoxicity and Its Mechanism of Receptors during Cerebral Ischemia
Xing Hongyi，Guan Xinmin
Department of Neurology, Xiehe Hosipital, Tongji Medical University,Wuhan 430022
Wang Caiyuan
Department of Neurobiology, Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University, Wuhan 430030
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Abstract TTC staining and HE staining were used to observe the influence of acteylcholine (ACh) and glutamate (Glu) on infarction area and cell morphology after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats, and electrocorticography (ECG) applied to investigate the influence of Glu, ACh, ACh receptor activator and ACh antagonist on restoring time of EEG during bilateral common carotid artery occlusion (CCAO) in rats. The results showed that Glu could enlarge the infart area, ACh magnified the effect of Glu about 30% (P<0.01)； Glu maked cell damage heavier in ischemic area after cerebral ischemia, ACh aggravated cell to destroy. Glu induced neocortex neuronal excitation in a dose-effect manner. The threshold of neuronal excitotoxicity induced by Glu was 10-2 mol/L, which could be lowered to 10-3 mol/L by ACh. The effect of ACh could be antagonized by atropine, rather than by hexamethonium, simulated by carbachol in a concentration-effect manner, rather than by nicotine. It was concluded that ACh potentiated glutamate induced neuronal excitotoxicity by way of m-ACh-R to lower Glu threshold.
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Key words cerebral ischemic; acetylcholine; glutamate; neuronal excitotoxicity
近年来兴奋性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)的神经兴奋毒性与缺血性脑损伤的关系基本明确[1]，乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是脑内经典的兴奋性递质，有研究表明ACh可加强谷氨酸(glutamate, Glu)诱导的培养海马神经元变性[2]，那么这两种兴奋性神经递质在脑缺血中的关系到底怎样呢?本研究从形态和机能上证实了ACh可加强Glu的神经兴奋毒性，并发现这种作用是通过M型受体来实现的。
1 材料与方法
1.1 脑缺血动物模型
由同济医科大学实验动物学部提供成年健康的Wistar大鼠，体重为200～250 g。参照Bederson[3]方法制作大脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO), 大鼠用氨基甲酸乙酯(250 g/L，1 g/kg，腹腔注射)麻醉，固定于脑立体定位仪上，在左眼与左耳孔中点作一弧形切口，充分暴露颧弓后，在颧弓与颞鳞骨交接处向前1～2 mm作一直径为4 mm的骨窗，小心暴露大脑中动脉(MCA)、大脑下静脉与嗅束，并在后二者之间用电热烧灼器轻轻烫烧MCA使其凝闭。用止血钳及玻璃分针小心分离双侧颈总动脉，穿线并用动脉夹夹闭来制作双侧颈总动脉闭塞(common carotid artery occlusion, CCAO)模型。
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1.2 主要实验试剂及给药方式
谷氨酸(北京化工厂产品，分析纯)，依色林(Fluka公司产品)，阿托品(湖北省医药公司分装室提供)，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)(E.M.K进口分装)，六烃季胺、烟碱、氨甲酰胆碱(Sigma公司产品)。所有工具药均采用侧脑室给药，参照包新民[4]图谱定位，即调整门齿平面使其较耳间线平面低2.4 mm，侧脑室位于前囱后1.5 mm、矢状缝旁开1.5 mm、脑表面下3.5 mm。所用药物均用生理盐水配制，每次侧脑室给药5 μl。
1.3 TTC染色及梗塞面积的计算
动物经MCAO处理24 h后断头取脑，于视交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔3 mm切一片，将脑片置于用0.2 mol/L pH 7.4～7.8 PB新鲜配制的20 g/L TTC染液中水浴(37℃ 20～30 min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，固定于100 g/L中性甲醛液中，以供彩色照像和进一步切片作HE染色。用求积仪计算出梗塞区的面积和整个脑片的截面积，二者之比即为梗塞区占整个脑片的相对面积百分比。
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1.4 HE染色及神经细胞形态观察
脑片置AO恒冷箱切片机中-20℃作10 μm的切片，HE染色，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察神经细胞形态，根据白希清[5]标准判断缺血性神经细胞损害。
1.5 皮质脑电图的记录
用颅骨钻在大鼠冠状缝后1 mm，矢状缝旁开1 mm左右分别开一个直径为5 mm的圆形骨窗，暴露硬脑膜，用Ag-AgCl的记录电极(Φ=1 mm)置于脑顶叶外侧(冠状缝后1 mm，矢状缝旁开5 mm)皮质感觉运动区的硬脑膜表面，在大鼠鼻子上方无脑组织处接上参考电极，作用电极接上前置放大器(时间常数0.1 s，滤波60 Hz，增益×10000)，信号输出到四导生理记录仪上描记皮质脑电图(electrocorticography, ECoG)。
2 结果
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2.1 谷氨酸和乙酰胆碱对梗塞面积的影响
选用阻断ACh水解的胆碱酯酶抑制剂(依色林，Ese)以间接提高脑内ACh水平。侧脑室给药Glu 10-1 mol/L 5 μl，Ese 10g/5 μl。结果发现生理盐水组(NS)、谷氨酸组(Glu)、谷氨酸+依色林组(Glu+Ese)大鼠MCAO梗塞面积百分比分别为(12.1±0.5)%、(15.6±0.3)%、(20.1±0.4)%(
±s，n=8)。可见Glu可使梗塞面积扩大，而Ese则使之增加约30%(P<0.01)。表明：Glu能增强缺血性损害作用，ACh能加剧Glu的神经毒性效应。2.2 大脑皮质神经元缺血性损伤的组织学观察
正常大脑皮质神经细胞排列有序，脑缺血皮质细胞排列紊乱，胞核缩小，胞浆嗜伊红变，细胞呈三角形；给谷氨酸后可见大量成片的神经元坏死，部分格子细胞出现，但纹状体细胞结构尚清晰；给谷氨酸和依色林后可见大量崩解的神经细胞，其结构模糊，并且纹状体中可见火焰状坏死灶，表明乙酰胆碱加强谷氨酸促使神经元坏死。
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2.3 乙酰胆碱加强谷氨酸毒性作用的受体药理学
采用CCAO脑缺血再灌注动物模型，以缺血后皮质脑电图(ECoG)的恢复时间为观察指标，研究ACh加强Glu毒性作用的受体机制。
2.3.1 脑缺血时乙酰胆碱对皮质神经元的作用：侧脑室注射Ese 10 μg 2 min后夹闭双侧CCA，持续3 min后放夹再灌注开始计时，观察ECoG的恢复时间，结果发现正常大鼠为(248±0.1) min，而缺血大鼠则为(7.6±0.2) min，二者比较有极显著差异(P<0.01)，提示脑缺血时ACh可能作为一种有害物质引起神经元的过度兴奋，推测可能与缺血性脑损伤有关。
2.3.2 Clu的神经兴奋毒性及ACh的加强作用：大鼠随机分为缺血+谷氨酸组(CI+Glu)和缺血+谷氨酸+依色林组(CI+Ese+Glu)，侧脑室注射，Ese(10 μg/5 μl)浓度固定不变，而Glu的浓度则递增，结果如表1示，CCAO的大鼠脑电活动变化是短暂的，放夹后1 min即恢复正常；脑缺血时Glu致神经兴奋毒性的阈值为10-2 mol/L，而加有Ese后其阈值降为10-3 mol/L。表明脑缺血时Glu致皮质神经元的兴奋毒性存在量效关系，ACh可能是通过降低Glu致神经元兴奋毒性的阈值来表现出加强Glu神经兴奋毒性作用。
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表1 ACh加强不同浓度Glu(mol/L)对缺血皮层兴奋性的影响(
, min,n=6) 组别10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
0.5
Glu
1.1±0.1
, 百拇医药
0.9±0.1
1.0±0.1
0.9±0.1
13.8±0.7▲
22.2±3.3▲
Glu+Ese
7.8±0.2
8.2±0.4
8.6±0.6
12.50.5
22.2±1.5**
, 百拇医药
22.4±1.9**
与10-2 mol/L浓度组比较 ▲ P<0.01；与10-3 mol/L浓度组比较 **P<0.01
2.3.3 ACh加强Glu神经兴奋毒性的受体机制：选用Glu致神经元兴奋的阈值浓度(10-2 mol/L)为观察点，研究了m-ACh-R激动剂(氨甲酰胆碱，CC)、拮抗剂(阿托品，AT)、n-ACh-R激动剂(烟碱，NT)、拮抗剂(六烃季胺，HM)对ACh加强Glu神经兴奋毒性效应的影响(表2)。结果发现：Ese加强Glu的兴奋性神经毒性的效应可被AT阻断而不被HM拮抗，可为CC呈浓度-效应关系所模拟，NT则无此效应。表明：ACh加强Glu兴奋毒性效应是通过m-ACh-R而发挥的。表2 ACh-R激动剂和拮抗剂对Glu神经
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,min)组 别
例数
脑电恢复时间
NS
6
1.0±0.1
Ese
6
7.6±0.2*
Ese+AT
, 百拇医药 5
1.0±0.1▲
Ese+HM
5
7.5±0.4
CC100 ng/5 μl
5
1.0±0.1
CC500 ng/5 μl
5
6.0±0.6*
CC1000 ng/5 μl
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5
31.5±2.2*
NT
5
1.0±0.1
与NS相比 *P<0.001，与Ese相比 ▲ P<0.013 讨论
评价缺血性脑损伤的方法很多，既可用形态学方法直接观察脑缺血致细胞损害的严重程度，又可用脑功能改变来早期监测细胞电活动，Kochs[6]强调了脑电活动的恢复程度和恢复时间与神经细胞功能恢复有很好的相关性，并且脑缺血后ECoG恢复神经延长，反映了缺血介导的神经元功能异常。
脑缺血急性期神经元由于对缺血的应激而出现多种化学物质和神经递质的释放，导致神经元兴奋性增加，加速了细胞能量的耗竭，细胞损害加重。兴奋性氨基酸(EEA)是已基本明确的在脑缺血中有明显神经兴奋毒性的中枢性神经递质，Olney称之为兴奋毒性作用[7]，谷氨酸是脑内EAA受体的内源性配基，也是脑内含量最多、毒性最强的兴奋性氨基酸。乙酰胆碱(ACh)是脑内一种重要的经典神经递质，在脑缺血中的作用尚未明了，有研究表明脑缺血时皮质ACh的释放明显上升[8]。
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人们早就注意到一种生物效应是多种神经递质之间相互作用、相互调制的结果，ACh与Glu都是中枢兴奋性递质，二者在脑缺血中的关系如何呢?有研究表明，Glu能够促使皮质和纹状体ACh释放[9]，而ACh则可加强Glu的神经毒性作用[2]。
本研究从形态学方面证实了ACh有加强Glu毒性的作用，使脑梗塞面积扩大、梗塞区细胞结构破坏加重，进一步用皮质脑电图方法从功能上研究了受体作用机制，发现ACh加强Glu的神经兴奋毒性是通过M型受体来发挥的，我们的结果与Gonzales[10]在培养脑片上实验的结论相似，同时还发现ACh可降低Glu致神经兴奋毒性的阈值，即从10-2 mol/L降为10-3 mol/L。鉴于乙酰胆碱是促进学习记忆维持觉醒的重要神经递质，特别是脑梗塞恢复期和多发性脑梗塞痴呆治疗方案中需增加脑内ACh含量，以改善智能，那么ACh在脑缺血急性期的这种促进Glu神经兴奋毒性作用该怎么对待?以及脑缺血恢复期ACh与Glu之间的作用如何，均有待进一步探讨。
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乙酰胆碱与谷氨酸之间的相互作用机制是很复杂的，ACh通过M型受体加强Glu的毒性作用，那么这种效应涉及怎样的信使传导系统以及M型受体的亚型，有无其他递质参与等问题，尚需进一步研究。
注：国家科委资助项目(No.92IJ26-17)
作者简介：邢宏义，男，1969年生，主治医师
参 考 文 献
1 Diemer N H, Johansen F F, Jorgersen M B. N-methy-D-aspartate and non-N-methy-D-aspartate antagonists in global cerebral ischemia. Stroke, 1990,21(suppl Ⅲ):39
2 Mattson M P. Acetylcholine potentiates glutamate-induced neurodegeneration in cultured hippocampal neurons. Brain Res, 1989,497:402
, 百拇医药
3 Bederson J B, Pitts L H, Tsujim et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evalution of the model and development of a neurologic examination. Stroke, 1986,17:472
4 包新民主编.大鼠脑受体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.1～6
5 白希清主编.病理学.北京：科学出版社，1992.1164～1165
6 Kochs E, Hoffman W E, Wemer C et al. The effects of propofol on brain electrical activity, neurologic outcome and neuronal damage following incomplete ischemia in rats. Anesthesiology, 1992,76:245
, http://www.100md.com
7 Olney J W, Sharpe L G. Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate. Science, 1969,166:386
8 Phillis J W, Smith-Barbour M, Perkins L M et al. Acetylcholine output from the ischemic rat cerebral cortex effects of adenosine agonists. Brain Res, 1993,613:337
9 Ulus I H, Buyukuysal R L, Wurtman R J. N-methyl-D-asartate increases acetylcholine release from rat stratum and cortex: its effect augmented by choline. J pharmacol Exp Ther, 1992,261:1122
10 Gonzales R A, Roper L C, Westbrook S L. Cholinergic modulation of N-methyl-d-aspartate-evoked [3H]norepinephrine release from rat cortical slices. J Pharmacol Exp Ther, 1993,264:282
(1998-07-08 收稿), http://www.100md.com