HPLC法测定壮颈康复合剂中黄芪甲苷的含量
作者：尹 华
单位：杭州 310009 浙江中医学院中药系
关键词：
中国现代应用药学990426 壮颈康复合剂系由炙黄芪、当归、川芎、丹参等多味中药材组成的复方制剂，具有补气养血、祛风通络之功效，临床上广泛用于治疗颈椎病、骨刺增生、头晕乏力等症，疗效显著。黄芪为本方君药，其主要有效成分为黄芪甲苷(又称黄芪皂苷Ⅳ，Astragaloside Ⅳ)。本文考察了多种测定条件，采用高效液相色谱法测定壮颈康复合剂中黄芪甲苷的含量，以研究该制剂质量控制的定量方法。
1 仪器与试药
LC-4A高效液相色谱仪、SPD-2AS紫外检测器、C-R2AX数据处理器(日本岛津)。
壮颈康复合剂(浙江省中医院制剂室，杭卫制准字94第2853号)；黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所)；乙腈(国营浙江黄岩化学试剂厂，色谱纯)；其余所用试剂均为分析纯；水为超纯水。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Zorbax-ODS柱(4.6mm×250mm,10μm);流动相：乙腈-水(30∶70);检测波长:200nm;流速:1.0ml/min;灵敏度:0.08AUFS;柱温:40℃;柱压:80atm;纸速:3mm/min;进样量:10μl。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000。
2.2 标准曲线的绘制
精密称取黄芪甲苷对照品7.90mg,以甲醇溶解并定容于20ml量瓶中，分别吸取此溶液0.2,0.4,0.6,0.8和1.0ml,用甲醇稀释并定容于1ml量瓶中，该标准系列浓度为79,158,237,316和395μg/ml。分别进样10μl,按上述色谱条件进行测定。以峰面积的积分值为纵坐标(Y),黄芪甲苷含量(μg/ml)为横坐标(X),，绘制标准曲线，回归方程为:Y=1 076.3X+4 253,r=0.9999;线性范围为0.79～3.95μg。
, 百拇医药
2.3 精密度试验
精密吸取237μg/ml黄芪甲苷对照品溶液10μl,重复进样5次，测定峰面积，其RSD为1.1%。取同一供试品溶液，连续进样5次，每次10μl,测定峰面积，其RSD为1.7%。精密吸取同一批号样品5份，每份10ml，分别按样品测定项下方法操作，测定峰面积，其RSD为2.3%。
2.4 回收率试验
采用加样回收法，精密吸取5份已测黄芪甲苷含量的壮颈康复合剂5.00ml,分别准确加入395μg/ml黄芪甲苷对照品溶液2.00ml,按样品测定项下方法操作，计算回收率，其平均回收率为98.6%,RSD=2.0%(n=5),结果见表1。
2.5 空白试验
按处方配比投入缺黄芪的其它中药和辅料，制成空白中药制剂，按样品测定项下的色谱条件测试，结果在黄芪甲苷对照品峰(50min)处未出现色谱峰，因此不干扰测定。
, http://www.100md.com
2.6 样品测定
精密吸取壮颈康复合剂10.00ml置于分液漏斗中，用等体积乙醚提取2次，弃去乙醚液。水层用水饱和的正丁醇提取5次，每次10ml,合并正丁醇液，用1% NaOH水溶液洗涤2次，每次10ml,再用正丁醇饱和水洗至中性，回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容于10ml量瓶中。用微孔滤膜过滤后，进样10μl,按上述色谱条件测定，由回归方程计算含量。3批样品平行测定5次，结果见表 2，对照品及样品的色谱图见图1。
表1 加样回收率试验结果(样品批号:981209)
制剂中黄芪
甲苷量(mg)
添加黄芪甲
苷量(mg)
, 百拇医药
测得黄芪甲
苷量(mg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1
0.830
0.790
1.601
97.6
, 百拇医药
2
0.830
0.790
1.618
99.7
3
0.830
0.790
1.590
96.2
98.6
2.0
4
, http://www.100md.com
0.830
0.790
1.631
101.4
5
0.830
0.790
1.606
98.2
表2 样品测定结果(n=5) 批 号
含量(μg/ml)
RSD(%)
, http://www.100md.com
981209
166
1.1
990116
175
2.0
990223
159
2.3
图1 黄芪甲苷的色谱图
A-标准品；B-壮颈康复合剂样品；C-空白制剂；1-黄芪甲苷(Rt=5.0min)
3 讨 论
, http://www.100md.com
3.1 黄芪甲苷含量测定方法的研究：黄芪甲苷的含量测定方法通常有比色法[1]、分光光度法[2]、薄层扫描法[3]。与其它分析方法相比，高效液相色谱法对样品的分离鉴定不受挥发度、热稳定性及分子量的影响，分离效能高，分析速度快，方法较简单，数据的获得和解释较容易，在中成药分析中可同时分离和分析样品，已成为中药制剂质量监控的一种有力手段。
3.2 提取工艺的研究：壮颈康复合剂为中药复方制剂，所含成分复杂，干扰成分多，因而样品溶液的前处理为本方法的技术关键。本实验考察有关文献资料，从提取纯化方法、溶剂等方面进行试验，确定以乙醚脱脂、正丁醇提取,1% NaOH液洗涤正丁醇提取液以除去黄芪等药中所含色素、氨基酸等成分，减少干扰，不需上大孔吸附树脂就得到了较好的分离提取效果，大大简化了操作步骤。
3.3 测定波长的选择
黄芪甲苷仅在紫外区200nm左右有吸收，本文试验了200～210nm波长范围，为保证足够的灵敏度，本实验选择200nm为测定波长。
, http://www.100md.com
3.4 流动相的选择：根据有关文献[4],本文分别考察了甲醇-水、乙腈-水流动相体系，结果发现，由于黄芪甲苷仅在低波长下测定才有足够灵敏度，而波长太低用甲醇作流动相本底就很高，所以采用乙腈-水体系作为流动相。分别试验了乙腈-水(25∶75,30∶70,33∶67,40∶60)等多种比例，实验结果表明以乙腈-水(30∶70)作流动相，得到了较理想的效果，且分析时间短，只需5min,故本文选择乙腈-水(30∶70)为流动相。
本文以Zorbax ODS为色谱柱，乙腈-水(30∶70)为流动相，采用HPLC法在200nm处测定了壮颈康复合剂中主要有效成分黄芪甲苷的含量，方法简便可靠，结果准确，可用于控制该制剂的内在质量。
参考文献
[1] 熊义涛，蒋启明，陶福华.夕阳春口服液中黄芪总皂苷的含量测定.中国医院药学杂志，1995，15(2)∶553.
[2] 杜薇.黄芪中黄芪甲苷的提取及含量测定.时珍国药研究，1996，7(4)∶217.
[3] 李玲，苏健，王宝琴.黄芪及其复方制剂中黄芪甲苷的薄层扫描法测定.中成药，1993，15(6)∶11.
[4] 余灏，杨胜华.黄芪皂苷分析方法研究近况.华西药学杂志，1993，8(3)∶163.
收稿日期：1998-04-18, 百拇医药
单位：杭州 310009 浙江中医学院中药系
关键词：
中国现代应用药学990426 壮颈康复合剂系由炙黄芪、当归、川芎、丹参等多味中药材组成的复方制剂，具有补气养血、祛风通络之功效，临床上广泛用于治疗颈椎病、骨刺增生、头晕乏力等症，疗效显著。黄芪为本方君药，其主要有效成分为黄芪甲苷(又称黄芪皂苷Ⅳ，Astragaloside Ⅳ)。本文考察了多种测定条件，采用高效液相色谱法测定壮颈康复合剂中黄芪甲苷的含量，以研究该制剂质量控制的定量方法。
1 仪器与试药
LC-4A高效液相色谱仪、SPD-2AS紫外检测器、C-R2AX数据处理器(日本岛津)。
壮颈康复合剂(浙江省中医院制剂室，杭卫制准字94第2853号)；黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所)；乙腈(国营浙江黄岩化学试剂厂，色谱纯)；其余所用试剂均为分析纯；水为超纯水。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Zorbax-ODS柱(4.6mm×250mm,10μm);流动相：乙腈-水(30∶70);检测波长:200nm;流速:1.0ml/min;灵敏度:0.08AUFS;柱温:40℃;柱压:80atm;纸速:3mm/min;进样量:10μl。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000。
2.2 标准曲线的绘制
精密称取黄芪甲苷对照品7.90mg,以甲醇溶解并定容于20ml量瓶中，分别吸取此溶液0.2,0.4,0.6,0.8和1.0ml,用甲醇稀释并定容于1ml量瓶中，该标准系列浓度为79,158,237,316和395μg/ml。分别进样10μl,按上述色谱条件进行测定。以峰面积的积分值为纵坐标(Y),黄芪甲苷含量(μg/ml)为横坐标(X),，绘制标准曲线，回归方程为:Y=1 076.3X+4 253,r=0.9999;线性范围为0.79～3.95μg。
, 百拇医药
2.3 精密度试验
精密吸取237μg/ml黄芪甲苷对照品溶液10μl,重复进样5次，测定峰面积，其RSD为1.1%。取同一供试品溶液，连续进样5次，每次10μl,测定峰面积，其RSD为1.7%。精密吸取同一批号样品5份，每份10ml，分别按样品测定项下方法操作，测定峰面积，其RSD为2.3%。
2.4 回收率试验
采用加样回收法，精密吸取5份已测黄芪甲苷含量的壮颈康复合剂5.00ml,分别准确加入395μg/ml黄芪甲苷对照品溶液2.00ml,按样品测定项下方法操作，计算回收率，其平均回收率为98.6%,RSD=2.0%(n=5),结果见表1。
2.5 空白试验
按处方配比投入缺黄芪的其它中药和辅料，制成空白中药制剂，按样品测定项下的色谱条件测试，结果在黄芪甲苷对照品峰(50min)处未出现色谱峰，因此不干扰测定。
, http://www.100md.com
2.6 样品测定
精密吸取壮颈康复合剂10.00ml置于分液漏斗中，用等体积乙醚提取2次，弃去乙醚液。水层用水饱和的正丁醇提取5次，每次10ml,合并正丁醇液，用1% NaOH水溶液洗涤2次，每次10ml,再用正丁醇饱和水洗至中性，回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容于10ml量瓶中。用微孔滤膜过滤后，进样10μl,按上述色谱条件测定，由回归方程计算含量。3批样品平行测定5次，结果见表 2，对照品及样品的色谱图见图1。
表1 加样回收率试验结果(样品批号:981209)
制剂中黄芪
甲苷量(mg)
添加黄芪甲
苷量(mg)
, 百拇医药
测得黄芪甲
苷量(mg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1
0.830
0.790
1.601
97.6
, 百拇医药
2
0.830
0.790
1.618
99.7
3
0.830
0.790
1.590
96.2
98.6
2.0
4
, http://www.100md.com
0.830
0.790
1.631
101.4
5
0.830
0.790
1.606
98.2
表2 样品测定结果(n=5) 批 号
含量(μg/ml)
RSD(%)
, http://www.100md.com
981209
166
1.1
990116
175
2.0
990223
159
2.3
图1 黄芪甲苷的色谱图
A-标准品；B-壮颈康复合剂样品；C-空白制剂；1-黄芪甲苷(Rt=5.0min)
3 讨 论
, http://www.100md.com
3.1 黄芪甲苷含量测定方法的研究：黄芪甲苷的含量测定方法通常有比色法[1]、分光光度法[2]、薄层扫描法[3]。与其它分析方法相比，高效液相色谱法对样品的分离鉴定不受挥发度、热稳定性及分子量的影响，分离效能高，分析速度快，方法较简单，数据的获得和解释较容易，在中成药分析中可同时分离和分析样品，已成为中药制剂质量监控的一种有力手段。
3.2 提取工艺的研究：壮颈康复合剂为中药复方制剂，所含成分复杂，干扰成分多，因而样品溶液的前处理为本方法的技术关键。本实验考察有关文献资料，从提取纯化方法、溶剂等方面进行试验，确定以乙醚脱脂、正丁醇提取,1% NaOH液洗涤正丁醇提取液以除去黄芪等药中所含色素、氨基酸等成分，减少干扰，不需上大孔吸附树脂就得到了较好的分离提取效果，大大简化了操作步骤。
3.3 测定波长的选择
黄芪甲苷仅在紫外区200nm左右有吸收，本文试验了200～210nm波长范围，为保证足够的灵敏度，本实验选择200nm为测定波长。
, http://www.100md.com
3.4 流动相的选择：根据有关文献[4],本文分别考察了甲醇-水、乙腈-水流动相体系，结果发现，由于黄芪甲苷仅在低波长下测定才有足够灵敏度，而波长太低用甲醇作流动相本底就很高，所以采用乙腈-水体系作为流动相。分别试验了乙腈-水(25∶75,30∶70,33∶67,40∶60)等多种比例，实验结果表明以乙腈-水(30∶70)作流动相，得到了较理想的效果，且分析时间短，只需5min,故本文选择乙腈-水(30∶70)为流动相。
本文以Zorbax ODS为色谱柱，乙腈-水(30∶70)为流动相，采用HPLC法在200nm处测定了壮颈康复合剂中主要有效成分黄芪甲苷的含量，方法简便可靠，结果准确，可用于控制该制剂的内在质量。
参考文献
[1] 熊义涛，蒋启明，陶福华.夕阳春口服液中黄芪总皂苷的含量测定.中国医院药学杂志，1995，15(2)∶553.
[2] 杜薇.黄芪中黄芪甲苷的提取及含量测定.时珍国药研究，1996，7(4)∶217.
[3] 李玲，苏健，王宝琴.黄芪及其复方制剂中黄芪甲苷的薄层扫描法测定.中成药，1993，15(6)∶11.
[4] 余灏，杨胜华.黄芪皂苷分析方法研究近况.华西药学杂志，1993，8(3)∶163.
收稿日期：1998-04-18, 百拇医药