Adr亚型HBV中蛋白基因的T载体克隆及序列分析
作者：赵秀英 黄德庄 阎惠平 贺丽香 罗朝霞
单位：北京佑安医院肝炎研究所
关键词：HBsAg；前S2基因；adr亚型；PCR；T载体
首都医科大学学报990413 提要： 构建含适当限制酶切位点的adr亚型乙肝病毒(HBV)中蛋白基因克隆，比较分析序列变化，用作HBV疫苗表达及诊断试剂的研究。患者血清经蛋白酶K消化，再以酚-氯仿抽提，对提取物进行PCR扩增。回收PCR阳性产物，经琼脂糖酶消化后直接克隆至T载体。转化后提取质粒经PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果：10份血清提取物的PCR有3份获阳性产物，分别经T载体克隆后转化DH10b菌，3株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于adr亚型，与国内已发表序列的同源性大于99.6%。提示该克隆是用作HBsAg蛋白表达或探针标记研究的理想克隆。
中图分类号： R512.6
, http://www.100md.com
The T-vector Cloning of HBV Middle Protein Gene of Adr Subtype and Nucleic Acid Sequence Analysis
Zhao Xiuying, Huang Dezhuang, Yan Huiping, He Lixiang, Luo Zhaoxia
Institute of Viral Hepatitis, Beijing You′an Hospital
Abstract：T vector clones of HBV surface antigen of adr subtype which contain preS2 region were constructed and nucleic acid sequence was analyzed. Sera from hepatitis B patients were digested by protease K and HBV genomes were extracted by phenol and chloroform. The target gene was amplified from HBV genome and PCR products were collected by agrose gel electrophoresis. The amplified gene was digested with agrase and ligated with T vector directly. The ligation products were transformed into E.coli DH10b and the target sequence was analyzed. The results showed that 3 positive PCR products were obtained from 10 HBV genomes, and the positive clones belonged to HBV adr subtype, there was more than 99.6% homology with the published clone adr-1 and these clones provided a perfect contribution to the expression of vaccine and HBV adr subtype specialty.
, 百拇医药
Key words：HBsAg; preS2 gene; adr subtype; PCR; T-vector
表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒(HBV)的主要免疫因子，根据HBsAg抗原性不同，将HBV分为8个血清型，我国汉族人口中以adr亚型流行为主。完整的HBsAg基因长约1.2 kb，其编码产物为3种大小不同的蛋白颗粒：主蛋白、中蛋白和大蛋白。本研究利用PCR法，从我院乙肝病毒单纯感染者血清内扩增adr亚型HBV中蛋白基因，利用琼脂糖酶消化法将其直接与T载体连接，筛选后获得阳性克隆并进行序列分析。
1 材料和方法
1.1 材料
被检血清采自我院1997年1月至1998年6月间诊断为HBV单纯感染、病毒指标三阳(HBsAg、HBeAg、anti-HBc)的肝炎患者。
, 百拇医药
PCR引物：参照甘人宝等发表的我国adr亚型HBV全基因序列[1]，采用美国DNASIS软件包分析，双引物分别位于前S2起始及S基因终止部位。引物中引入双酶切位点，外侧分别加4 bp的保护碱基(由赛百胜公司合成)，引物序列如下：
UP Primer：5′CTAC GTCGAC (SalⅠ) CATCCT
CAGGCC ATGCAG3′
DOWN Primer：5′ACGA GGTACC (KpnⅠ)
GTAAAG TACCCC AACATC3′
T载体：(由军事医学科学院周育森博士惠赠)；DH10b菌株由北京市农林科学院细胞工程实验室保存培养；低熔点琼脂糖(华美公司)；琼脂糖酶(宝灵曼公司)；DNA Marker、内切酶、Tag酶、连接酶购自Promega公司。
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质粒连接及转化操作参见《分子克隆实验指南》有关章节[2]；DNA序列分析采用美国PE公司ABI321型测序仪。
1.2 实验方法
患者血清经蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提后，将提取的核酸溶于50 μL H2O。取5 μL上述核酸溶液作为模板进行PCR，其中加入Tag酶、dNTP、上下游引物及无菌水，使反应体积为40 μL。PCR循环参数设定为：94 ℃ 1 min、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min共32个循环，最后72 ℃ 10 min。分别采用adr亚型质粒及H2O作为阳性及阴性对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，于280 nm紫外灯下观察并照相记录。
连接：将阳性PCR产物以1%低熔点琼脂糖凝胶电泳并切割目的条带，使切割凝胶体积小于50 μL，加入I U琼脂糖酶消化1 h(操作参照厂家说明材料)。直接取7 μL琼脂糖消化产物与1 μL T载体，加入DNA连接酶及Buffer，以10 μL体积15 ℃连接12 h。另设对照组：等量PCR产物回收后经乙醇沉淀并纯化，分别以SalⅠ及KpnⅠ酶切，双酶切产物经低熔点琼脂糖电泳回收及琼脂糖酶消化，取适量与经同种酶切处理的载体质粒pBluescript SK在15 ℃连接12 h。
, 百拇医药
分别取1 μL上述2种连接产物电转化DH10b菌，经氨苄抗性及蓝-白斑筛选，挑取白色菌落扩增培养提取质粒。对所获3株阳性T载体克隆进行序列分析。测序结果以DNASIS软件包进行核苷酸同源性及蛋白表达分析。
2 结果
PCR扩增产物全长0.96 kb，共将10份血清抽提核酸进行PCR扩增，有3份产生阳性扩增带。阳性PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
图1 阳性PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳
a 阴性对照(H2O)，b 阳性对照(质粒)
d Marker PBR322/Hinfl
e Marker λDNA/EcorRI
, 百拇医药
c,f,g 阳性PCR扩增产物
PCR产物低熔点凝胶回收后的消化产物与T载体克隆1次成功，质粒鉴定超过2/3的白色菌落为阳性克隆。对照组经双酶切后与同种酶切的pBluescript SK连接，经3次克隆产生少量白色菌落，质粒鉴定失败。
3株PCR产物克隆后序列分析，显示同属于adr亚型，与国内已发表的padr-1的同源率分别为99.8%、99.9%、99.6%。
3 讨论
本研究采用PCR法对adr亚型HBV中蛋白基因进行克隆。不同亚型的HBV有免疫的特异性，开发有亚型特异性的疫苗及诊断试剂对HBV的预防及诊断有重要意义[3，4]。完整的HBsAg基因内含3个转录起始子，根据转录产物的不同将其称为S基因、前S1基因及前S2基因。单纯S基因编码蛋白称为主蛋白，前S2与S基因共同编码中蛋白，前S1与中蛋白基因编码大蛋白。早期研究认为，位于S基因124～147位氨基酸的α抗原决定簇是诱导HBV保护性免疫的决定部位，早期的HBV疫苗主要包含S蛋白。近年的研究证实，前S蛋白在HBV免疫中有重要作用。Pontiss等认为[5]，前S2蛋白内含活跃的肝细胞结合位点，并有较强的抗原决定簇。单独的前S2抗原可诱导免疫动物产生针对HBV的保护性抗体[6]。本研究构建克隆内含完整的HBV表面抗原前S2及S区，在双侧引入酶切位点，可经酶切后直接克隆入其他载体，进行抗原表达研究或用作诊断探针的制备。
, http://www.100md.com
传统的PCR产物克隆采用平端连接，或经限制酶切后与相应载体粘端连接，克隆操作复杂，效率较低。本研究采用了T载体克隆技术，将PCR产物经琼脂糖酶消化后直接与T载体连接，迅速获得阳性克隆。所谓T载体是在常用的克隆载体的EcoRV酶切位点3′端引入碱基“T”，使其切口处5′、3′端均为“T”，避免自身环化。同时，Tag酶有模板非依赖性末端转移酶活性，使得PCR产物3′端引入突出的碱基“A”，因此，PCR产物与T载体的连接成为直接粘端连接。操作简便，且效率明显提高[7]。本研究对照组PCR产物的连接采用酶切法，3次连接转化后仍未获目的克隆。T载体克隆的主要缺点是背景连接较高，载体的非特异自连及PCR产物的任何污染都可导致白色菌斑的出现，从而增加筛选工作。可以通过增大外源片断浓度及提高PCR产物的纯净度着手。T载体的保存期不宜过长，PCR产物最好新鲜制备。通过这些方法，本研究筛选的白色菌斑中2/3以上为阳性克隆。
电转化常用于相对大分子质量质粒及真核细胞的转化，近年来新被应用于对大肠杆菌的转化。此转化过程大肠杆菌的制备比钙转化法简单，但转化效率可提高10～100倍，本研究在转化过程中以1 μL连接产物转化即获得大量阳性克隆。
, 百拇医药
测序结果，3株克隆的序列与国内发表序列间同源性大于99.6%，经DNASIS软件分析显示，无插入及缺失性突变，在α抗原决定簇内未见免疫逃避性突变。由于克隆血清来自急性感染的三阳患者，表明北京地区病毒指标三阳的HBV感染仍以野生株病毒为主。
本研究PCR扩增阳性率低于人群adr亚型的流行率(60.32%)[8]，可能与扩增引物内引入酶切位点及保护碱基，或与扩增片断较长或引物结合的HBV序列内碱基突变等相关。
感谢北京市农林科学院张晓东博士，我院中心实验室闵福援主任、辛永梅老师给予的帮助。
参考文献
1 甘人宝,储美瑾.克隆的adr亚型乙肝病毒DNA的全序列.中国科学B辑,1986,1:55
2 侯云德主编.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学技术出版社,1992
, http://www.100md.com
3 蔡良婉,王年.Adr亚型乙肝病毒基因组全克隆以及其表面抗原基因的次级克隆.中国医学科学院学报,1984,6:252
4 王宇.乙型肝炎病毒adr亚型全基因组分子克隆的建立.北京医科大学学报,1986,1:44
5 Pontiss P. Human liver plasma membranes contain receptors for the hepatitis B virus preS1 region and via polymerized human serum albumin for the preS2 region. J Virol, 1989,7:63
6 Coursaget P. Anti-preS2 antibodies in natural hepatitis B virus infection and after immunization. Vaccine, 1988,6:357
7 赵秋敏,周育森.一种直接高效克隆PCR产物的载体.军事医学科学院院刊,1996,20:294
8 高寿征主编.病毒性肝炎的防治研究.北京:北京出版社,1993
收稿日期:1998-12-01, 百拇医药
单位：北京佑安医院肝炎研究所
关键词：HBsAg；前S2基因；adr亚型；PCR；T载体
首都医科大学学报990413 提要： 构建含适当限制酶切位点的adr亚型乙肝病毒(HBV)中蛋白基因克隆，比较分析序列变化，用作HBV疫苗表达及诊断试剂的研究。患者血清经蛋白酶K消化，再以酚-氯仿抽提，对提取物进行PCR扩增。回收PCR阳性产物，经琼脂糖酶消化后直接克隆至T载体。转化后提取质粒经PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果：10份血清提取物的PCR有3份获阳性产物，分别经T载体克隆后转化DH10b菌，3株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于adr亚型，与国内已发表序列的同源性大于99.6%。提示该克隆是用作HBsAg蛋白表达或探针标记研究的理想克隆。
中图分类号： R512.6
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The T-vector Cloning of HBV Middle Protein Gene of Adr Subtype and Nucleic Acid Sequence Analysis
Zhao Xiuying, Huang Dezhuang, Yan Huiping, He Lixiang, Luo Zhaoxia
Institute of Viral Hepatitis, Beijing You′an Hospital
Abstract：T vector clones of HBV surface antigen of adr subtype which contain preS2 region were constructed and nucleic acid sequence was analyzed. Sera from hepatitis B patients were digested by protease K and HBV genomes were extracted by phenol and chloroform. The target gene was amplified from HBV genome and PCR products were collected by agrose gel electrophoresis. The amplified gene was digested with agrase and ligated with T vector directly. The ligation products were transformed into E.coli DH10b and the target sequence was analyzed. The results showed that 3 positive PCR products were obtained from 10 HBV genomes, and the positive clones belonged to HBV adr subtype, there was more than 99.6% homology with the published clone adr-1 and these clones provided a perfect contribution to the expression of vaccine and HBV adr subtype specialty.
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Key words：HBsAg; preS2 gene; adr subtype; PCR; T-vector
表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒(HBV)的主要免疫因子，根据HBsAg抗原性不同，将HBV分为8个血清型，我国汉族人口中以adr亚型流行为主。完整的HBsAg基因长约1.2 kb，其编码产物为3种大小不同的蛋白颗粒：主蛋白、中蛋白和大蛋白。本研究利用PCR法，从我院乙肝病毒单纯感染者血清内扩增adr亚型HBV中蛋白基因，利用琼脂糖酶消化法将其直接与T载体连接，筛选后获得阳性克隆并进行序列分析。
1 材料和方法
1.1 材料
被检血清采自我院1997年1月至1998年6月间诊断为HBV单纯感染、病毒指标三阳(HBsAg、HBeAg、anti-HBc)的肝炎患者。
, 百拇医药
PCR引物：参照甘人宝等发表的我国adr亚型HBV全基因序列[1]，采用美国DNASIS软件包分析，双引物分别位于前S2起始及S基因终止部位。引物中引入双酶切位点，外侧分别加4 bp的保护碱基(由赛百胜公司合成)，引物序列如下：
UP Primer：5′CTAC GTCGAC (SalⅠ) CATCCT
CAGGCC ATGCAG3′
DOWN Primer：5′ACGA GGTACC (KpnⅠ)
GTAAAG TACCCC AACATC3′
T载体：(由军事医学科学院周育森博士惠赠)；DH10b菌株由北京市农林科学院细胞工程实验室保存培养；低熔点琼脂糖(华美公司)；琼脂糖酶(宝灵曼公司)；DNA Marker、内切酶、Tag酶、连接酶购自Promega公司。
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质粒连接及转化操作参见《分子克隆实验指南》有关章节[2]；DNA序列分析采用美国PE公司ABI321型测序仪。
1.2 实验方法
患者血清经蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提后，将提取的核酸溶于50 μL H2O。取5 μL上述核酸溶液作为模板进行PCR，其中加入Tag酶、dNTP、上下游引物及无菌水，使反应体积为40 μL。PCR循环参数设定为：94 ℃ 1 min、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min共32个循环，最后72 ℃ 10 min。分别采用adr亚型质粒及H2O作为阳性及阴性对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，于280 nm紫外灯下观察并照相记录。
连接：将阳性PCR产物以1%低熔点琼脂糖凝胶电泳并切割目的条带，使切割凝胶体积小于50 μL，加入I U琼脂糖酶消化1 h(操作参照厂家说明材料)。直接取7 μL琼脂糖消化产物与1 μL T载体，加入DNA连接酶及Buffer，以10 μL体积15 ℃连接12 h。另设对照组：等量PCR产物回收后经乙醇沉淀并纯化，分别以SalⅠ及KpnⅠ酶切，双酶切产物经低熔点琼脂糖电泳回收及琼脂糖酶消化，取适量与经同种酶切处理的载体质粒pBluescript SK在15 ℃连接12 h。
, 百拇医药
分别取1 μL上述2种连接产物电转化DH10b菌，经氨苄抗性及蓝-白斑筛选，挑取白色菌落扩增培养提取质粒。对所获3株阳性T载体克隆进行序列分析。测序结果以DNASIS软件包进行核苷酸同源性及蛋白表达分析。
2 结果
PCR扩增产物全长0.96 kb，共将10份血清抽提核酸进行PCR扩增，有3份产生阳性扩增带。阳性PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
图1 阳性PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳
a 阴性对照(H2O)，b 阳性对照(质粒)
d Marker PBR322/Hinfl
e Marker λDNA/EcorRI
, 百拇医药
c,f,g 阳性PCR扩增产物
PCR产物低熔点凝胶回收后的消化产物与T载体克隆1次成功，质粒鉴定超过2/3的白色菌落为阳性克隆。对照组经双酶切后与同种酶切的pBluescript SK连接，经3次克隆产生少量白色菌落，质粒鉴定失败。
3株PCR产物克隆后序列分析，显示同属于adr亚型，与国内已发表的padr-1的同源率分别为99.8%、99.9%、99.6%。
3 讨论
本研究采用PCR法对adr亚型HBV中蛋白基因进行克隆。不同亚型的HBV有免疫的特异性，开发有亚型特异性的疫苗及诊断试剂对HBV的预防及诊断有重要意义[3，4]。完整的HBsAg基因内含3个转录起始子，根据转录产物的不同将其称为S基因、前S1基因及前S2基因。单纯S基因编码蛋白称为主蛋白，前S2与S基因共同编码中蛋白，前S1与中蛋白基因编码大蛋白。早期研究认为，位于S基因124～147位氨基酸的α抗原决定簇是诱导HBV保护性免疫的决定部位，早期的HBV疫苗主要包含S蛋白。近年的研究证实，前S蛋白在HBV免疫中有重要作用。Pontiss等认为[5]，前S2蛋白内含活跃的肝细胞结合位点，并有较强的抗原决定簇。单独的前S2抗原可诱导免疫动物产生针对HBV的保护性抗体[6]。本研究构建克隆内含完整的HBV表面抗原前S2及S区，在双侧引入酶切位点，可经酶切后直接克隆入其他载体，进行抗原表达研究或用作诊断探针的制备。
, http://www.100md.com
传统的PCR产物克隆采用平端连接，或经限制酶切后与相应载体粘端连接，克隆操作复杂，效率较低。本研究采用了T载体克隆技术，将PCR产物经琼脂糖酶消化后直接与T载体连接，迅速获得阳性克隆。所谓T载体是在常用的克隆载体的EcoRV酶切位点3′端引入碱基“T”，使其切口处5′、3′端均为“T”，避免自身环化。同时，Tag酶有模板非依赖性末端转移酶活性，使得PCR产物3′端引入突出的碱基“A”，因此，PCR产物与T载体的连接成为直接粘端连接。操作简便，且效率明显提高[7]。本研究对照组PCR产物的连接采用酶切法，3次连接转化后仍未获目的克隆。T载体克隆的主要缺点是背景连接较高，载体的非特异自连及PCR产物的任何污染都可导致白色菌斑的出现，从而增加筛选工作。可以通过增大外源片断浓度及提高PCR产物的纯净度着手。T载体的保存期不宜过长，PCR产物最好新鲜制备。通过这些方法，本研究筛选的白色菌斑中2/3以上为阳性克隆。
电转化常用于相对大分子质量质粒及真核细胞的转化，近年来新被应用于对大肠杆菌的转化。此转化过程大肠杆菌的制备比钙转化法简单，但转化效率可提高10～100倍，本研究在转化过程中以1 μL连接产物转化即获得大量阳性克隆。
, 百拇医药
测序结果，3株克隆的序列与国内发表序列间同源性大于99.6%，经DNASIS软件分析显示，无插入及缺失性突变，在α抗原决定簇内未见免疫逃避性突变。由于克隆血清来自急性感染的三阳患者，表明北京地区病毒指标三阳的HBV感染仍以野生株病毒为主。
本研究PCR扩增阳性率低于人群adr亚型的流行率(60.32%)[8]，可能与扩增引物内引入酶切位点及保护碱基，或与扩增片断较长或引物结合的HBV序列内碱基突变等相关。
感谢北京市农林科学院张晓东博士，我院中心实验室闵福援主任、辛永梅老师给予的帮助。
参考文献
1 甘人宝,储美瑾.克隆的adr亚型乙肝病毒DNA的全序列.中国科学B辑,1986,1:55
2 侯云德主编.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学技术出版社,1992
, http://www.100md.com
3 蔡良婉,王年.Adr亚型乙肝病毒基因组全克隆以及其表面抗原基因的次级克隆.中国医学科学院学报,1984,6:252
4 王宇.乙型肝炎病毒adr亚型全基因组分子克隆的建立.北京医科大学学报,1986,1:44
5 Pontiss P. Human liver plasma membranes contain receptors for the hepatitis B virus preS1 region and via polymerized human serum albumin for the preS2 region. J Virol, 1989,7:63
6 Coursaget P. Anti-preS2 antibodies in natural hepatitis B virus infection and after immunization. Vaccine, 1988,6:357
7 赵秋敏,周育森.一种直接高效克隆PCR产物的载体.军事医学科学院院刊,1996,20:294
8 高寿征主编.病毒性肝炎的防治研究.北京:北京出版社,1993
收稿日期:1998-12-01, 百拇医药