重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定*
作者：刘礼初 梁国栋 杜靖远 付士红 陈飞 郑启新 肖宝筠 侯云德
单位：刘礼初 杜靖远 郑启新 肖宝筠，同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022 ；梁国栋 付士红 陈飞 侯云德，中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052
关键词：人骨形态发生蛋白-2/7融合基因；构建和表达；成骨样细胞；碱性磷酸酶
同济医科大学学报990407 摘要 构建重组人骨形态发生蛋白-2/7融合体，研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用DNA重组技术，将编码人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)成熟肽的0.36 kb基因片段与编码人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)成熟肽的0.44 kb基因片段连接，得到重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因； 经测序鉴定后，将其克隆到表达载体pBV222中，转化大肠杆菌 DH5α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。 克隆质粒转化的工程菌，经42℃诱导4～6 h后，高效表达重组人骨形态发生蛋白-2/7，在SDS- PAGE上出现一新的蛋白带, 分子量约 29 ku，约占菌体总蛋白的20%，表达蛋白以包涵体的形式存在，经初步纯化、裂解、复性后的BMP-2/7 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。BMP-2/7融合基因的构建和表达，可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白。
, 百拇医药
中图法分类号 Q343.1, R 394, Q 556.1
Construction and Expression of rhBMP-2/7 Fusion Protein in E.coli and Bioassay in Vitro
Liu Lichu, Du Jingyuan et al
Department of Orthopedics, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Liang Guodong Chen Fei
National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Beijing 100052
, 百拇医药
Abstract A fusion gene was constructed in a plasmid in which the coding regions of human BMP-2 and BMP-7 mature peptide were connected by a synthetic linker sequence encoding a short peptides GGGGS through DNA recombinant techniques. It was then subcloned into the pBV222 expression vector, and expressed in E.coli DH5α after transformation and temperature induction. SDS-PAGE revealed a new protein band near 29kd after 5h induction. The BMP-2/7 fusion protein in inclusion bodies made 20% of the total bacteria proteins and was purified with the Chelating Sepharose Fast Flow. Bioassay in vitro showed that rhBMP-2/7 induced both chondroblastic and osteoblastic differentiation of osteoprogenitor cells derived from newborn rat calvaria and significantly increased the alkaline phosphatase-specific activity. These results suggest that the rhBMP-2/7 is likely to have natural biological functions.
, http://www.100md.com
Key words rhBMP-2/7 fusion gene; construction and expression; osteoblast; alkaline phosphatase
骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)具有诱导未分化间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，促进新骨形成的作用[1,2 ]。目前，BMP家族已发现的十多种成员中，以BMP-2和BMP-7的活性最强。体内BMPs多为同源二聚体，但亦发现存在少量的异源二聚体[ 3 ]。文献报道BMPs异源二聚体比同源二聚体的活性要高，尤其BMP-2/7异源二聚体活性提高20倍以上[4]，其作用机理有待深入研究。本实验设计一编码GGGGS 5个氨基酸的接头，将编码BMP-2和BMP-7成熟肽的基因连接，得到BMP-2/7融合基因，再将其克隆到大肠杆菌表达载体pBV222中。转化大肠杆菌DH5α后进行温度诱导表达。表达蛋白经分离、纯化、复性后，观察其对培养鼠成骨样细胞分化、增殖及碱性磷酸酶活性的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种、工具酶
pGEM/BMP-2、 pGEM/BMP-7质粒为本室自行克隆。大肠杆菌DH5α、表达载体pBV222由病毒基因工程国家重点试验室保存；克隆载体pGEM-T、工具酶 EcoRI、 BamH I、 Pst I及T4 DNA连接酶(Promega)分别购于东方公司和天象人公司。细胞培养试剂及其它：DMEM(GIBCO公司产品)、胎牛血清、金属亲和层析介质(Chelating Sepharose Fast Flow)、 AKP检测试剂盒购于东方公司；动物：试验用新生大鼠购于中国预防医学科学院。引物设计: 经计算机分析设计下列两对引物用于PCR扩增BMP-2 和BMP-7成熟肽的基因。
引物Ⅰ 5′ AAGAATTCATGAAACGTCAAGCCAAACAC 3′；
引物Ⅱ 5′ AAGGATCCACCTCCGCCGCGACACCCAC 3′；
, http://www.100md.com
引物Ⅲ 5′ AACTGCAGCTAGTGGCAGCC 3′ ；
引物Ⅳ 5′ CGGGATCCACGGGGAGCAAA 3′。
引物I在BMP-2成熟肽基因5′端加ATG; 引物II 在3′端去终止密码子TAG。BMP-2和BMP-7基因间用一编码GGGGS 5个氨基酸的接头连接。 BMP-2/7融合基因的构建：用引物I 、II经PCR扩增BMP-2成熟肽的基因片段；用引物III、IV扩增BMP-7成熟肽的基因片段，分别克隆在pGEM-T 载体。用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切后，T4 DNA连接酶连接片段，即得BMP-2/7融合基因。测序正确后转至表达载体pBV222中。
1.2 蛋白的诱导表达
以含BMP-2/7融合基因的质粒(pBV222/BMP-2/7)转化DH5α，在含100μg/ml Amp 的固体培养基中培养12～16 h；挑单菌落在LB液培养基中(含100 μg/ml Amp) 30℃培养；当OD值达0.6时，迅速转入42℃水浴摇床培养4～6 h。
, 百拇医药
1.3 SDS聚丙烯酰胺电泳
4℃离心收集菌体，加100 μl 1×蛋白加样缓冲液，100℃ 3 min，150 g/L的分离胶，8～12mA 3 h电泳，考马斯亮蓝染色。
1.4 包涵体纯化
离心收集菌体，用裂解液(20 mmol/L PB)悬浮，冰浴条件下超声破碎。沉淀经洗涤液(0.5% Triton-100, 0.15 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris.HCl PH8.5) 4℃洗涤。用8 mol/L脲变性溶解；再在6 mol/L脲 20 mmol/L Tris.HCl, PH7.4透析液中4℃透析过夜；过金属亲和层析柱，收集活性峰；最后用20 mmol/L Tris.HCl 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L还原型谷胱甘肽复性，透析浓缩并低温冷冻干燥。
1.5 BMP-2/7活性的初步测定
, 百拇医药
无菌条件下取1 d龄大鼠颅盖骨细胞作原代培养，培养液DMEM 中加100 ml/L的胎牛血清，10 mg/L谷胺酰胺，100 μg/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。37℃ 5% CO2培养3～5 d，细胞基本长满，按约2×104 传代至24孔板，倒置显微镜下每天观察细胞形态2～3次，3 d后更换无血清培养基，按0、12.5、25、50、 100、200、 400 ng/ml不同浓度加入纯化了的重组人骨形态发生蛋白-2/7。继续培养2 d后，按改良Lowry法测定细胞碱性磷酸酶活性。
2 结果
2.1 pBV222/BMP-2/7表达质粒的构建及鉴定
按方法1.4 扩增、重组的BMP-2/7融合基因, 先克隆在pGEM-T 载体, 经荧光染料标记, Sanger双脱氧链终止法测序鉴定正确后，再转移到原核表达载体pBV222中；得到融合蛋白表达质粒pBV222/BMP-2/7(图1)。进一步用EcoR I、 BamH I、Pst I酶切鉴定，可切下0.36及0.44 kb大小的片段(图2)。
, http://www.100md.com
2.2 pBV222/BMP-2/7在大肠杆菌中的表达和包涵体纯化
pBV222/BMP-2/7重组质粒转化DH5α，按方法1.5进行温度诱导表达，42℃诱导4～6 h，培养的工程菌经还原处理后作SDS-PAGE电泳，结果显示在分子量29 ku处出现一新蛋白带(图3)。对菌体超声破碎后上清与沉淀作SDS-PAGE电泳分析，发现表达蛋白主要存在于沉淀的包涵体中。包涵体经洗涤、裂解、复性、纯化、冻干后，进一步作活化测定。
2.3 BMP-2/7对培养成骨细胞及碱性磷酸酶活性的影响
促进培养鼠成骨样细胞分化、增殖。当培养液中BMP-2/7的浓度达50ng/ml以上时，细胞分化增殖加快；碱性磷酸酶活性升高，其增加值与BMP-2/7浓度呈正相关。当BMP-2/7达200 ng/ml时，AKP含量约为空白对照组的3倍(P<0.01)；低浓度的BMP-2/7(<50 ng/ml)对AKP的影响无显著性差异(P>0.05) (图4)。
, 百拇医药
图1 BMP-2/7融合蛋白表达质粒pBV222/BMP-2/7构建简图
图2 pBV222/BMP-2/7表达质粒酶切鉴定
A: λDNA分子量标准(λDNA/EcoRI/HindIII)，B: EcoRI 与PstI酶切质粒pBV222/BMP-2/7，C: BamHI与PstI 酶切质粒pBV222/BMP-2/7 ， D: EcoRI与BamHI酶切质粒 pBV222/BMP-2/7，E: DNA分子量标准(2000, 1000, 750, 500, 250, 100)bp。
图3 融合蛋白SDS- PAGE电泳
, http://www.100md.com A：重组质粒转化的工程菌；B: 包涵体；C：pBV222转化的大肠杆菌；D: 大肠杆菌DH5α。 E: 蛋白质分子量标准。
图4 BMP-2/7对培养鼠成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响(* P<0.05, ** P<0.01)。
3 讨论
骨形成发生蛋白(BMPs)至今已发现有13种以上成员, 结构上除BMP-1外，其余均属于TGF-β超家族成员[5 ]。BMPs能诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，促进新骨形成；在骨、软骨缺损的修复中起着重要作用。其中BMP-2和BMP-7的成骨作用最强，研究较深入[6,7 ]。从体内分离的BMPs多由两条相同的肽链经二硫键连接而成同源二聚体。1990年Sampath等报道牛骨中存在有成骨活性的BMP-2和BMP-7异源二聚体[3 ]。进一步研究发现，某些BMPs异源二聚体比相应的同源二聚体更强，而BMP-2/7异源二聚体活性提高20倍[4 ]，其机理有待更深一步的研究。
, 百拇医药
为探讨BMPs结构与功能的关系，我们利用DNA重组技术，将编码BMP-2成熟肽的基因和BMP-7成熟肽的基因融合，得到了同时表达BMP-2和BMP-7成熟肽的重组体，并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。连接BMP-2和BMP-7基因的接头编码GGGGS 5个中性氨基酸，使表达的融合蛋白在复性时可能折叠成类似于BMP-2/7异源二聚体的空间结构。重组基因受控于温度诱导启动子PLPR，只需改变温度，即可诱导表达，成本低，有利于生产。
表达产物为包涵体，并带有6个组氨酸，为进一步纯化带来了极大便利。BMP-2和BMP-7均为糖蛋白，尽管大肠杆菌缺乏糖基化系统，但文献报道大肠杆菌表达的无糖基化的rhBMP-2和 rhBMP-7成熟肽经纯化后，仍具有很强的诱导成骨活性[8,9 ]。我们在实验室中亦发现包涵体的裂解、复性和纯化对BMP-2/7活性的影响极为重要。未经纯化的包涵体未见生物学活性。纯化、复性后的BMP-2/7融合蛋白促进鼠成骨样细胞增殖，明显提高其碱性磷酸酶活性，提示BMP-2/7融合体可能有较强的诱导成骨活性。对BMP-2/7融合体及其单体异位诱导成骨活性的研究正在进行之中。
, http://www.100md.com
注：863国家高科技生物技术领域基金资助
作者简介：刘礼初， 男， 1965年生， 医学博士。
参 考 文 献
1 Urist M R. Bone: formation by auto-induction. Science, 1965, 150:893
2 Wozney J M, Rosen V, Celeste A J et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science, 1988, 242:1528
3 Sampath T, Coughlin J E, Whetstone R M et al. Bovine osteogenic protein is composed of dimers of OP-1 and BMP-2A, two members of Transforming growth factor-β superfamily. J Biol Chem, 1990, 265: 13198
, 百拇医药
4 Israel D I, Nove J, Kerns K M et al. Heterodimeric Bone Morphogenetic Proteins show Enhanced activity in Vitro and in Vivo. Growth Factor, 1996, 13:192
5 陈 棣，叶伟胜. 骨形成发生蛋白的成骨功能及临床应用. 中华外科杂志, 1996，34(10):602
6 Riley E H, Lane J M, Urist M R et al. Bone Morphogenetic Protein-2. Clin Orthop Rel Res, 1996, 324:39
7 Cook S D, Rueger D C. Osteogenic protein-1, Biology and applications. Clin Orthop Rel Res, 1996, 324:29
8 赵 明,王会信,周廷冲. 重组人骨形成蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性. 生物化学杂志, 1994, 10(5): 319
9 陈 文，付士红，史俊南等. 人OP-1成熟肽基因的克隆及其序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1997, 7(2):12
(1998-10-23 收稿), http://www.100md.com
单位：刘礼初 杜靖远 郑启新 肖宝筠，同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022 ；梁国栋 付士红 陈飞 侯云德，中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052
关键词：人骨形态发生蛋白-2/7融合基因；构建和表达；成骨样细胞；碱性磷酸酶
同济医科大学学报990407 摘要 构建重组人骨形态发生蛋白-2/7融合体，研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用DNA重组技术，将编码人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)成熟肽的0.36 kb基因片段与编码人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)成熟肽的0.44 kb基因片段连接，得到重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因； 经测序鉴定后，将其克隆到表达载体pBV222中，转化大肠杆菌 DH5α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。 克隆质粒转化的工程菌，经42℃诱导4～6 h后，高效表达重组人骨形态发生蛋白-2/7，在SDS- PAGE上出现一新的蛋白带, 分子量约 29 ku，约占菌体总蛋白的20%，表达蛋白以包涵体的形式存在，经初步纯化、裂解、复性后的BMP-2/7 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。BMP-2/7融合基因的构建和表达，可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白。
, 百拇医药
中图法分类号 Q343.1, R 394, Q 556.1
Construction and Expression of rhBMP-2/7 Fusion Protein in E.coli and Bioassay in Vitro
Liu Lichu, Du Jingyuan et al
Department of Orthopedics, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Liang Guodong Chen Fei
National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Beijing 100052
, 百拇医药
Abstract A fusion gene was constructed in a plasmid in which the coding regions of human BMP-2 and BMP-7 mature peptide were connected by a synthetic linker sequence encoding a short peptides GGGGS through DNA recombinant techniques. It was then subcloned into the pBV222 expression vector, and expressed in E.coli DH5α after transformation and temperature induction. SDS-PAGE revealed a new protein band near 29kd after 5h induction. The BMP-2/7 fusion protein in inclusion bodies made 20% of the total bacteria proteins and was purified with the Chelating Sepharose Fast Flow. Bioassay in vitro showed that rhBMP-2/7 induced both chondroblastic and osteoblastic differentiation of osteoprogenitor cells derived from newborn rat calvaria and significantly increased the alkaline phosphatase-specific activity. These results suggest that the rhBMP-2/7 is likely to have natural biological functions.
, http://www.100md.com
Key words rhBMP-2/7 fusion gene; construction and expression; osteoblast; alkaline phosphatase
骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)具有诱导未分化间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，促进新骨形成的作用[1,2 ]。目前，BMP家族已发现的十多种成员中，以BMP-2和BMP-7的活性最强。体内BMPs多为同源二聚体，但亦发现存在少量的异源二聚体[ 3 ]。文献报道BMPs异源二聚体比同源二聚体的活性要高，尤其BMP-2/7异源二聚体活性提高20倍以上[4]，其作用机理有待深入研究。本实验设计一编码GGGGS 5个氨基酸的接头，将编码BMP-2和BMP-7成熟肽的基因连接，得到BMP-2/7融合基因，再将其克隆到大肠杆菌表达载体pBV222中。转化大肠杆菌DH5α后进行温度诱导表达。表达蛋白经分离、纯化、复性后，观察其对培养鼠成骨样细胞分化、增殖及碱性磷酸酶活性的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种、工具酶
pGEM/BMP-2、 pGEM/BMP-7质粒为本室自行克隆。大肠杆菌DH5α、表达载体pBV222由病毒基因工程国家重点试验室保存；克隆载体pGEM-T、工具酶 EcoRI、 BamH I、 Pst I及T4 DNA连接酶(Promega)分别购于东方公司和天象人公司。细胞培养试剂及其它：DMEM(GIBCO公司产品)、胎牛血清、金属亲和层析介质(Chelating Sepharose Fast Flow)、 AKP检测试剂盒购于东方公司；动物：试验用新生大鼠购于中国预防医学科学院。引物设计: 经计算机分析设计下列两对引物用于PCR扩增BMP-2 和BMP-7成熟肽的基因。
引物Ⅰ 5′ AAGAATTCATGAAACGTCAAGCCAAACAC 3′；
引物Ⅱ 5′ AAGGATCCACCTCCGCCGCGACACCCAC 3′；
, http://www.100md.com
引物Ⅲ 5′ AACTGCAGCTAGTGGCAGCC 3′ ；
引物Ⅳ 5′ CGGGATCCACGGGGAGCAAA 3′。
引物I在BMP-2成熟肽基因5′端加ATG; 引物II 在3′端去终止密码子TAG。BMP-2和BMP-7基因间用一编码GGGGS 5个氨基酸的接头连接。 BMP-2/7融合基因的构建：用引物I 、II经PCR扩增BMP-2成熟肽的基因片段；用引物III、IV扩增BMP-7成熟肽的基因片段，分别克隆在pGEM-T 载体。用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切后，T4 DNA连接酶连接片段，即得BMP-2/7融合基因。测序正确后转至表达载体pBV222中。
1.2 蛋白的诱导表达
以含BMP-2/7融合基因的质粒(pBV222/BMP-2/7)转化DH5α，在含100μg/ml Amp 的固体培养基中培养12～16 h；挑单菌落在LB液培养基中(含100 μg/ml Amp) 30℃培养；当OD值达0.6时，迅速转入42℃水浴摇床培养4～6 h。
, 百拇医药
1.3 SDS聚丙烯酰胺电泳
4℃离心收集菌体，加100 μl 1×蛋白加样缓冲液，100℃ 3 min，150 g/L的分离胶，8～12mA 3 h电泳，考马斯亮蓝染色。
1.4 包涵体纯化
离心收集菌体，用裂解液(20 mmol/L PB)悬浮，冰浴条件下超声破碎。沉淀经洗涤液(0.5% Triton-100, 0.15 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris.HCl PH8.5) 4℃洗涤。用8 mol/L脲变性溶解；再在6 mol/L脲 20 mmol/L Tris.HCl, PH7.4透析液中4℃透析过夜；过金属亲和层析柱，收集活性峰；最后用20 mmol/L Tris.HCl 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L还原型谷胱甘肽复性，透析浓缩并低温冷冻干燥。
1.5 BMP-2/7活性的初步测定
, 百拇医药
无菌条件下取1 d龄大鼠颅盖骨细胞作原代培养，培养液DMEM 中加100 ml/L的胎牛血清，10 mg/L谷胺酰胺，100 μg/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。37℃ 5% CO2培养3～5 d，细胞基本长满，按约2×104 传代至24孔板，倒置显微镜下每天观察细胞形态2～3次，3 d后更换无血清培养基，按0、12.5、25、50、 100、200、 400 ng/ml不同浓度加入纯化了的重组人骨形态发生蛋白-2/7。继续培养2 d后，按改良Lowry法测定细胞碱性磷酸酶活性。
2 结果
2.1 pBV222/BMP-2/7表达质粒的构建及鉴定
按方法1.4 扩增、重组的BMP-2/7融合基因, 先克隆在pGEM-T 载体, 经荧光染料标记, Sanger双脱氧链终止法测序鉴定正确后，再转移到原核表达载体pBV222中；得到融合蛋白表达质粒pBV222/BMP-2/7(图1)。进一步用EcoR I、 BamH I、Pst I酶切鉴定，可切下0.36及0.44 kb大小的片段(图2)。
, http://www.100md.com
2.2 pBV222/BMP-2/7在大肠杆菌中的表达和包涵体纯化
pBV222/BMP-2/7重组质粒转化DH5α，按方法1.5进行温度诱导表达，42℃诱导4～6 h，培养的工程菌经还原处理后作SDS-PAGE电泳，结果显示在分子量29 ku处出现一新蛋白带(图3)。对菌体超声破碎后上清与沉淀作SDS-PAGE电泳分析，发现表达蛋白主要存在于沉淀的包涵体中。包涵体经洗涤、裂解、复性、纯化、冻干后，进一步作活化测定。
2.3 BMP-2/7对培养成骨细胞及碱性磷酸酶活性的影响
促进培养鼠成骨样细胞分化、增殖。当培养液中BMP-2/7的浓度达50ng/ml以上时，细胞分化增殖加快；碱性磷酸酶活性升高，其增加值与BMP-2/7浓度呈正相关。当BMP-2/7达200 ng/ml时，AKP含量约为空白对照组的3倍(P<0.01)；低浓度的BMP-2/7(<50 ng/ml)对AKP的影响无显著性差异(P>0.05) (图4)。
, 百拇医药
图1 BMP-2/7融合蛋白表达质粒pBV222/BMP-2/7构建简图
图2 pBV222/BMP-2/7表达质粒酶切鉴定
A: λDNA分子量标准(λDNA/EcoRI/HindIII)，B: EcoRI 与PstI酶切质粒pBV222/BMP-2/7，C: BamHI与PstI 酶切质粒pBV222/BMP-2/7 ， D: EcoRI与BamHI酶切质粒 pBV222/BMP-2/7，E: DNA分子量标准(2000, 1000, 750, 500, 250, 100)bp。
图3 融合蛋白SDS- PAGE电泳
, http://www.100md.com A：重组质粒转化的工程菌；B: 包涵体；C：pBV222转化的大肠杆菌；D: 大肠杆菌DH5α。 E: 蛋白质分子量标准。
图4 BMP-2/7对培养鼠成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响(* P<0.05, ** P<0.01)。
3 讨论
骨形成发生蛋白(BMPs)至今已发现有13种以上成员, 结构上除BMP-1外，其余均属于TGF-β超家族成员[5 ]。BMPs能诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，促进新骨形成；在骨、软骨缺损的修复中起着重要作用。其中BMP-2和BMP-7的成骨作用最强，研究较深入[6,7 ]。从体内分离的BMPs多由两条相同的肽链经二硫键连接而成同源二聚体。1990年Sampath等报道牛骨中存在有成骨活性的BMP-2和BMP-7异源二聚体[3 ]。进一步研究发现，某些BMPs异源二聚体比相应的同源二聚体更强，而BMP-2/7异源二聚体活性提高20倍[4 ]，其机理有待更深一步的研究。
, 百拇医药
为探讨BMPs结构与功能的关系，我们利用DNA重组技术，将编码BMP-2成熟肽的基因和BMP-7成熟肽的基因融合，得到了同时表达BMP-2和BMP-7成熟肽的重组体，并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。连接BMP-2和BMP-7基因的接头编码GGGGS 5个中性氨基酸，使表达的融合蛋白在复性时可能折叠成类似于BMP-2/7异源二聚体的空间结构。重组基因受控于温度诱导启动子PLPR，只需改变温度，即可诱导表达，成本低，有利于生产。
表达产物为包涵体，并带有6个组氨酸，为进一步纯化带来了极大便利。BMP-2和BMP-7均为糖蛋白，尽管大肠杆菌缺乏糖基化系统，但文献报道大肠杆菌表达的无糖基化的rhBMP-2和 rhBMP-7成熟肽经纯化后，仍具有很强的诱导成骨活性[8,9 ]。我们在实验室中亦发现包涵体的裂解、复性和纯化对BMP-2/7活性的影响极为重要。未经纯化的包涵体未见生物学活性。纯化、复性后的BMP-2/7融合蛋白促进鼠成骨样细胞增殖，明显提高其碱性磷酸酶活性，提示BMP-2/7融合体可能有较强的诱导成骨活性。对BMP-2/7融合体及其单体异位诱导成骨活性的研究正在进行之中。
, http://www.100md.com
注：863国家高科技生物技术领域基金资助
作者简介：刘礼初， 男， 1965年生， 医学博士。
参 考 文 献
1 Urist M R. Bone: formation by auto-induction. Science, 1965, 150:893
2 Wozney J M, Rosen V, Celeste A J et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science, 1988, 242:1528
3 Sampath T, Coughlin J E, Whetstone R M et al. Bovine osteogenic protein is composed of dimers of OP-1 and BMP-2A, two members of Transforming growth factor-β superfamily. J Biol Chem, 1990, 265: 13198
, 百拇医药
4 Israel D I, Nove J, Kerns K M et al. Heterodimeric Bone Morphogenetic Proteins show Enhanced activity in Vitro and in Vivo. Growth Factor, 1996, 13:192
5 陈 棣，叶伟胜. 骨形成发生蛋白的成骨功能及临床应用. 中华外科杂志, 1996，34(10):602
6 Riley E H, Lane J M, Urist M R et al. Bone Morphogenetic Protein-2. Clin Orthop Rel Res, 1996, 324:39
7 Cook S D, Rueger D C. Osteogenic protein-1, Biology and applications. Clin Orthop Rel Res, 1996, 324:29
8 赵 明,王会信,周廷冲. 重组人骨形成蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性. 生物化学杂志, 1994, 10(5): 319
9 陈 文，付士红，史俊南等. 人OP-1成熟肽基因的克隆及其序列分析. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1997, 7(2):12
(1998-10-23 收稿), http://www.100md.com