硫普罗宁对急性肝损害保护作用的实验研究
作者：唐望先 虞涤霞 杜荔菁 但自力 张文英 李绍白
单位：唐望先 杜荔菁 但自力 张文英 李绍白，同济医科大学附属同济医院肝病研究所，武汉 430030；虞涤霞，武汉市第七医院肝病科，武汉 430071
关键词：硫普罗宁；D-氨基半乳糖；脂质过氧化物；超氧化物歧化酶
同济医科大学学报990421 摘要 为了研究硫普罗宁(Tiopronin)对急性肝损害是否有保护作用，应用D-氨基半乳糖(D-GalN)造成大鼠急性肝损伤模型。实验分成正常组(N)、模型组(D-GalN)、模型+硫普罗宁组(D-GalN+T)、模型+肝得健组(D-GalN+E)。观察血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、肝细胞及血浆中脂质过氧化物(LPO)和肝组织及红细胞超氧化物歧化酶(SOD)以及相关的病理变化。结果表明：模型+硫普罗宁组(D-GalN+T)及模型+肝得健组(D-GalN+E)血清中ALT、TNF-α及LPO与模型组相比明显下降(P<0.01)，而D-GalN+T和D-GalN+E两组的SOD活性明显高于模型组(D-GalN)(P<0.01)。提示：硫普罗宁能降低血清中ALT、TNF-α的含量及肝组织中氧自由基的产生，降低血浆和组织中LPO水平，并能提高细胞SOD活性，从而减轻肝损伤。其对肝细胞的保护作用与肝得健一致。
, http://www.100md.com
中图法分类号 Q532.3， Q554.9， R575
Study on Protective Effect of Tioproin on D-GalN-induced Acute Liver Injury in Rats
Tang Wangxian,Du Lijing et al
Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Yu Dixia
Wuhan No. 7 Hospital, Wuhan 430071
Abstract The protective effect of Tiopronin(T) on D-GalN-induced acute liver injury was studied. Thirty-five rats were divided into normal (N), model group (D-GalN), experimental group (D-GalN+T), and experimental control group (D-GalN+Essential forte). Serum alanine amainotransferase (ALT), TNF-α, LPO in hepatic cells, plasma and SOD in erythrocyte and hepatic tissues were determined. The experimental results showed that serum ALT, TNF-α, LPO in hepatic cells and plasma concentrations were markedly decreased in D-GalN group (P<0.01). SOD activity in erythrocyte and heptic tissues was obviously increased in the D-GalN+T group and D-GalN+E group, as compared with D-GalN group (P<0.01). These findings suggest that Tiopronin ould reduce serum ALT, TNF-α contents and the production of oxygen free-radical, decrease the LPO level in the hepatic cells and plasma and increase SOD activity in cells, so as to alleviate hepatic injury. The protective effect of Tiopronin is similar to that of essential forte.
, 百拇医药
Key words Tipronini; D-galactossamine; liproxide; superoxide dismutase
硫普罗宁是日本1963年创制的甘氨酸衍生物，毒副作用小，可用于慢性肝炎和肝硬化等治疗，已相继在日本、意大利等国家批准使用。我国医药总局建议在“八五”期间仿制，以便能广泛应用。为验证该药对肝损伤的保护作用，我们采用了D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)所引起的急性肝损伤模型，探讨硫普罗宁对抗肝细胞损伤的作用，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
①实验动物：Wistar大鼠(本校实验动物学部提供)35只，体重220～250 g，雌雄各半。②D-GalN由重庆医科大学化学教研室提供，临用前配成10%的生理盐水溶液。③硫普罗宁化学名为2-巯基丙酸甘氨酸[N-(2-mercaptopropionyl)-glycine]，由湖北医工所提供，临用前用生理盐水配成37 mg/ml。④肝得健(essential forte)，德国乐安公司生产，批号41009200，实验前用生理盐水配成50 g/L的溶液。每次均按10 ml/kg灌胃。⑤硫代巴比妥酸为北京化学试剂工厂生产，标准品1，1，3，3-四乙氧基丙烷(tetraethoxypropane TEP)为日本株式会社产品。
, 百拇医药
1.2 实验分组及处理方法
实验动物分为：正常对照组(5只)、模型组(D-GalN 10只)、模型+硫普罗宁实验组(D-GalN+T 10只)以及模型+肝得健实验组(D-GalN+E 10只)。正常组按正常饲养。D-GalN组、D-GalN+T组以及D-GalN+E组均按10 ml/kg，分别灌生理盐水、硫普罗宁及肝得健，每d 2次，共3 d。灌胃次日，所有动物均腹腔注射D-GalN 800 mg/kg，40 h后处死。
1.3 样品采集及检测方法
①血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase ALT)活性的检测：注射D-GalN后40 h，快速断头采血，分离血清，采用赖氏测定。②血清TNF-α水平的测定：采用双抗体夹心法。③超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO)水平的测定：肝组织和红细胞SOD活性采用微量快速测定法。肝组织和血浆LPO含量的测定采用TBA显色法。
, 百拇医药
1.4 病理标本的处理
电镜标本按常规方法处理，电镜下观察。
1.5 统计处理
数据用
±s表示，采用t检验测试均数差异显著性。
2 结果
2.1 血清ALT及TNF-α水平的检测结果(表1)
模型组血清中ALT及TNF-α含量明显高于正常对照组，差异有极显著意义。模型+硫普罗宁及模型+肝得健组血清的ALT及TNF-α含量均较模型组明显降低，差异有显著性意义(P<0.01)。而模型+硫普罗宁组与模型+肝得健组相比无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 肝组织和红细胞中SOD的活性测定结果(表2)
模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组肝组织及红细胞中的SOD活性明显升高，与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)，模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组相比较无显著性差异(P>0.05)。
表1 血清ALT及TNF-α的活性(
) 组别
例数
ALT(u/L)
TNF-α(ng/ml)
N
5
, 百拇医药 344.0±110.0
0.22±0.10
D-GalN
10
1465.0±267.0*
8.07±1.93
D-GalN+T
10
805.0±267.0**△
0.68±0.25**△
D-GalN+E
, 百拇医药
10
742.0±208.0**
0.76±0.35**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比 △P>0.05表2 肝组织和红细胞中SOD的活性() 组别
例数
肝组织(u/g蛋白)
红细胞(u/g Hb)
N
, 百拇医药 5
560.6±128.6
250.0±60.5
D-GalN
10
417.6±139.5*
189.3±86.0*
D-GalN+T
10
575.6±163.2**△
256.0±81.4**△
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D-GalN+E
10
535.0±174.5**
243.2±74.9**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比△P>0.052.3 肝组织及血浆LPO含量的测定
从表3可见模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组肝组织及血浆中的LPO活性明显低于模型组(P<0.01)。模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组相比较无显著性差异(P>0.05)。
表3 肝组织及血浆LPO含量() 组别
, 百拇医药
例数
肝组织(nmol/L)
血浆(nmol/L)
N
5
20.8±18.4
16.5±6.6
D-GalN
10
65.1±24.1*
38.9±14.5*
D-GalN+T
, 百拇医药
10
32.0±11.5**△
17.9±9.2**△
D-GalN+E
10
27.5±15.8**
18.6±7.7**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比 △P>0.052.4 电镜观察结果
D-GalN组可见肝细胞弥漫性肿胀，细胞核不规则，染色质凝集，线粒体肿胀，粗面内质网排列不规则，脱颗粒，糖原减少，溶酶体及脂滴增多，部分区域肝细胞可见坏死性改变，细胞膜破裂，肿胀变性的细胞器游离于细胞外。
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D-GalN+T组可见肝细胞轻度肿胀，细胞核形态规则，染色质分布均匀，线粒体轻度肿胀，嵴模糊不清，粗面内质网排列较规则，糖原分布正常，偶见脂滴，溶酶体少见，细胞完整。D-GalN+E组可见肝细胞轻度肿胀，细胞核形态规则，线粒体结构模糊，基质密度增加，粗面内质网数量减少，糖原颗粒减少，细胞膜完整。
3 讨论
在正常情况下，TNF在体内浓度较低，具有调节免疫应答，促进细胞生长等多种功能。目前认为TNF-α含量异常增高是导致肝损害的重要发病机制。本实验用D-GalN造成的大鼠急性肝坏死模型，其TNF-α含量明显升高，证明TNF-α与D-GalN所致的肝细胞坏死密切相关。血清ALT是分布在肝内最多的一种酶，当肝细胞坏死仅1%时，血清中酶的活性可增加1倍。本文模型组与正常组比较，ALT的活力明显升高。经硫普罗宁治疗后，ALT的活力明显下降，虽还未降至正常，但反映了肝细胞的坏死程度有明显改善。提示硫普罗宁能使细胞膜通透性降低，抑制细胞内酶的释放，从而改善肝损害。硫普罗宁可抑制TNF-α活性，降低血清中TNF-α含量，使其恢复至细胞因子网络的正常水平，减轻其介导的炎性反应，而对肝细胞起保护作用。
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自由基损伤和脂质过氧化在肝损伤发病机制中也占有重要的地位，使肝损伤不断加重，构成恶性循环。LPO是生物膜中有多价不饱和脂肪酸自由基作用生成的产物。本实验模型组肝组织及红细胞中的SOD活性明显降低，而模型+硫普罗宁组SOD活性明显高于模型组。模型组肝组织及血浆中LPO水平明显升高，表明其参与肝细胞损伤的病理过程。而在模型+硫普罗宁组，肝细胞及血浆中的LPO明显下降。提示硫普罗宁能增强清除自由基的能力，并具有抗氧化作用，从而保护肝细胞。
作者简介：唐望先，女，1953年生，副主任技师
参 考 文 献
1 冯学胜，汤钊猷.肿瘤坏死因子与肝病.国外医学消化系疾病分册，1994，14(4)：207
2 Ichida F, Shibasaki K, Takino T et al. Therapeutic effects of tiopronin on chronic hepatitis: A double-blind clinical study. J int Med Res, 1982,10:325
3 叶红军，张显荣，宋玉芳.丹参、辅酶Q10对脂质过氧化作用所致肝损伤作用的实验研究.临床肝胆病杂志，1989，5(2)：100
(1998-09-22 收稿), 百拇医药
单位：唐望先 杜荔菁 但自力 张文英 李绍白，同济医科大学附属同济医院肝病研究所，武汉 430030；虞涤霞，武汉市第七医院肝病科，武汉 430071
关键词：硫普罗宁；D-氨基半乳糖；脂质过氧化物；超氧化物歧化酶
同济医科大学学报990421 摘要 为了研究硫普罗宁(Tiopronin)对急性肝损害是否有保护作用，应用D-氨基半乳糖(D-GalN)造成大鼠急性肝损伤模型。实验分成正常组(N)、模型组(D-GalN)、模型+硫普罗宁组(D-GalN+T)、模型+肝得健组(D-GalN+E)。观察血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、肝细胞及血浆中脂质过氧化物(LPO)和肝组织及红细胞超氧化物歧化酶(SOD)以及相关的病理变化。结果表明：模型+硫普罗宁组(D-GalN+T)及模型+肝得健组(D-GalN+E)血清中ALT、TNF-α及LPO与模型组相比明显下降(P<0.01)，而D-GalN+T和D-GalN+E两组的SOD活性明显高于模型组(D-GalN)(P<0.01)。提示：硫普罗宁能降低血清中ALT、TNF-α的含量及肝组织中氧自由基的产生，降低血浆和组织中LPO水平，并能提高细胞SOD活性，从而减轻肝损伤。其对肝细胞的保护作用与肝得健一致。
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中图法分类号 Q532.3， Q554.9， R575
Study on Protective Effect of Tioproin on D-GalN-induced Acute Liver Injury in Rats
Tang Wangxian,Du Lijing et al
Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Yu Dixia
Wuhan No. 7 Hospital, Wuhan 430071
Abstract The protective effect of Tiopronin(T) on D-GalN-induced acute liver injury was studied. Thirty-five rats were divided into normal (N), model group (D-GalN), experimental group (D-GalN+T), and experimental control group (D-GalN+Essential forte). Serum alanine amainotransferase (ALT), TNF-α, LPO in hepatic cells, plasma and SOD in erythrocyte and hepatic tissues were determined. The experimental results showed that serum ALT, TNF-α, LPO in hepatic cells and plasma concentrations were markedly decreased in D-GalN group (P<0.01). SOD activity in erythrocyte and heptic tissues was obviously increased in the D-GalN+T group and D-GalN+E group, as compared with D-GalN group (P<0.01). These findings suggest that Tiopronin ould reduce serum ALT, TNF-α contents and the production of oxygen free-radical, decrease the LPO level in the hepatic cells and plasma and increase SOD activity in cells, so as to alleviate hepatic injury. The protective effect of Tiopronin is similar to that of essential forte.
, 百拇医药
Key words Tipronini; D-galactossamine; liproxide; superoxide dismutase
硫普罗宁是日本1963年创制的甘氨酸衍生物，毒副作用小，可用于慢性肝炎和肝硬化等治疗，已相继在日本、意大利等国家批准使用。我国医药总局建议在“八五”期间仿制，以便能广泛应用。为验证该药对肝损伤的保护作用，我们采用了D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)所引起的急性肝损伤模型，探讨硫普罗宁对抗肝细胞损伤的作用，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
①实验动物：Wistar大鼠(本校实验动物学部提供)35只，体重220～250 g，雌雄各半。②D-GalN由重庆医科大学化学教研室提供，临用前配成10%的生理盐水溶液。③硫普罗宁化学名为2-巯基丙酸甘氨酸[N-(2-mercaptopropionyl)-glycine]，由湖北医工所提供，临用前用生理盐水配成37 mg/ml。④肝得健(essential forte)，德国乐安公司生产，批号41009200，实验前用生理盐水配成50 g/L的溶液。每次均按10 ml/kg灌胃。⑤硫代巴比妥酸为北京化学试剂工厂生产，标准品1，1，3，3-四乙氧基丙烷(tetraethoxypropane TEP)为日本株式会社产品。
, 百拇医药
1.2 实验分组及处理方法
实验动物分为：正常对照组(5只)、模型组(D-GalN 10只)、模型+硫普罗宁实验组(D-GalN+T 10只)以及模型+肝得健实验组(D-GalN+E 10只)。正常组按正常饲养。D-GalN组、D-GalN+T组以及D-GalN+E组均按10 ml/kg，分别灌生理盐水、硫普罗宁及肝得健，每d 2次，共3 d。灌胃次日，所有动物均腹腔注射D-GalN 800 mg/kg，40 h后处死。
1.3 样品采集及检测方法
①血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase ALT)活性的检测：注射D-GalN后40 h，快速断头采血，分离血清，采用赖氏测定。②血清TNF-α水平的测定：采用双抗体夹心法。③超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO)水平的测定：肝组织和红细胞SOD活性采用微量快速测定法。肝组织和血浆LPO含量的测定采用TBA显色法。
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1.4 病理标本的处理
电镜标本按常规方法处理，电镜下观察。
1.5 统计处理
数据用
±s表示，采用t检验测试均数差异显著性。2 结果
2.1 血清ALT及TNF-α水平的检测结果(表1)
模型组血清中ALT及TNF-α含量明显高于正常对照组，差异有极显著意义。模型+硫普罗宁及模型+肝得健组血清的ALT及TNF-α含量均较模型组明显降低，差异有显著性意义(P<0.01)。而模型+硫普罗宁组与模型+肝得健组相比无显著性差异(P>0.05)。
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2.2 肝组织和红细胞中SOD的活性测定结果(表2)
模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组肝组织及红细胞中的SOD活性明显升高，与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)，模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组相比较无显著性差异(P>0.05)。
表1 血清ALT及TNF-α的活性(
) 组别例数
ALT(u/L)
TNF-α(ng/ml)
N
5
, 百拇医药 344.0±110.0
0.22±0.10
D-GalN
10
1465.0±267.0*
8.07±1.93
D-GalN+T
10
805.0±267.0**△
0.68±0.25**△
D-GalN+E
, 百拇医药
10
742.0±208.0**
0.76±0.35**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比 △P>0.05表2 肝组织和红细胞中SOD的活性(
) 组别例数
肝组织(u/g蛋白)
红细胞(u/g Hb)
N
, 百拇医药 5
560.6±128.6
250.0±60.5
D-GalN
10
417.6±139.5*
189.3±86.0*
D-GalN+T
10
575.6±163.2**△
256.0±81.4**△
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D-GalN+E
10
535.0±174.5**
243.2±74.9**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比△P>0.052.3 肝组织及血浆LPO含量的测定
从表3可见模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组肝组织及血浆中的LPO活性明显低于模型组(P<0.01)。模型+硫普罗宁组及模型+肝得健组相比较无显著性差异(P>0.05)。
表3 肝组织及血浆LPO含量(
) 组别, 百拇医药
例数
肝组织(nmol/L)
血浆(nmol/L)
N
5
20.8±18.4
16.5±6.6
D-GalN
10
65.1±24.1*
38.9±14.5*
D-GalN+T
, 百拇医药
10
32.0±11.5**△
17.9±9.2**△
D-GalN+E
10
27.5±15.8**
18.6±7.7**
与正常组相比 *P<0.01，与模型组相比**P<0.01，与模型+肝得健组相比 △P>0.052.4 电镜观察结果
D-GalN组可见肝细胞弥漫性肿胀，细胞核不规则，染色质凝集，线粒体肿胀，粗面内质网排列不规则，脱颗粒，糖原减少，溶酶体及脂滴增多，部分区域肝细胞可见坏死性改变，细胞膜破裂，肿胀变性的细胞器游离于细胞外。
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D-GalN+T组可见肝细胞轻度肿胀，细胞核形态规则，染色质分布均匀，线粒体轻度肿胀，嵴模糊不清，粗面内质网排列较规则，糖原分布正常，偶见脂滴，溶酶体少见，细胞完整。D-GalN+E组可见肝细胞轻度肿胀，细胞核形态规则，线粒体结构模糊，基质密度增加，粗面内质网数量减少，糖原颗粒减少，细胞膜完整。
3 讨论
在正常情况下，TNF在体内浓度较低，具有调节免疫应答，促进细胞生长等多种功能。目前认为TNF-α含量异常增高是导致肝损害的重要发病机制。本实验用D-GalN造成的大鼠急性肝坏死模型，其TNF-α含量明显升高，证明TNF-α与D-GalN所致的肝细胞坏死密切相关。血清ALT是分布在肝内最多的一种酶，当肝细胞坏死仅1%时，血清中酶的活性可增加1倍。本文模型组与正常组比较，ALT的活力明显升高。经硫普罗宁治疗后，ALT的活力明显下降，虽还未降至正常，但反映了肝细胞的坏死程度有明显改善。提示硫普罗宁能使细胞膜通透性降低，抑制细胞内酶的释放，从而改善肝损害。硫普罗宁可抑制TNF-α活性，降低血清中TNF-α含量，使其恢复至细胞因子网络的正常水平，减轻其介导的炎性反应，而对肝细胞起保护作用。
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自由基损伤和脂质过氧化在肝损伤发病机制中也占有重要的地位，使肝损伤不断加重，构成恶性循环。LPO是生物膜中有多价不饱和脂肪酸自由基作用生成的产物。本实验模型组肝组织及红细胞中的SOD活性明显降低，而模型+硫普罗宁组SOD活性明显高于模型组。模型组肝组织及血浆中LPO水平明显升高，表明其参与肝细胞损伤的病理过程。而在模型+硫普罗宁组，肝细胞及血浆中的LPO明显下降。提示硫普罗宁能增强清除自由基的能力，并具有抗氧化作用，从而保护肝细胞。
作者简介：唐望先，女，1953年生，副主任技师
参 考 文 献
1 冯学胜，汤钊猷.肿瘤坏死因子与肝病.国外医学消化系疾病分册，1994，14(4)：207
2 Ichida F, Shibasaki K, Takino T et al. Therapeutic effects of tiopronin on chronic hepatitis: A double-blind clinical study. J int Med Res, 1982,10:325
3 叶红军，张显荣，宋玉芳.丹参、辅酶Q10对脂质过氧化作用所致肝损伤作用的实验研究.临床肝胆病杂志，1989，5(2)：100
(1998-09-22 收稿), 百拇医药