Amp-FLP连锁分析对DMD 基因诊断的价值
作者：王修海 张 锋 王培林 杜嗣廉 王 兰2
单位：王修海 张 锋 王培林 杜嗣：廉青岛医学院生 物学教研室(青岛 266021)王 兰:青岛市市北区医院五官科
关键词：肌营养不良；基因诊断；连锁；聚合酶链反应
青岛医学院990403 【摘 要】 ①目的 探讨扩增片段长度多态性(Amp-FLP)连锁分析对杜氏进行性肌营养不良(DMD)基因诊断中的 价值。②方法 运用多重聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳银染 法，对10个DMD家系成员的抗肌营养不良蛋白基因内9个基因区进行了Amp-FLP连锁分析。③结果 10个DMD家系中的9个先证者，6例为外显子缺失，1例为内含 子缺失，2例为非缺失型。④结论 Amp-FLP连锁分析是对DMD进行 基因诊断的实用方法。
中国图书馆分类法分类号 Q7
, http://www.100md.com
APPLICATION OF AMP-FLP LINKAGE AN ALYSIS IN
GENE DIAGNOSIS OF DMD
Wang Xiuhai, Zhang Feng, Wang Peilin, et al
Department of Biology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To explore the value of Amp-FLP Lin kage analysis on gene diagnosis of Duchenne muscular dysdrophin(DMD). Methods The amplified fragment length polymorphism of 9 gene regi ons of the dysdtrophin gene in 10 DMD families was linkedly analyzed by multiple x PCR, PAGE and silver staining. Results 6 exon, 1 intro deletion and 2 non-deletion were detecte d in 9 probands of 10 DMD families. Conclusion Amp-FLP linkage analysis is a useful method in gene d iagnosis of DMD.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 muscular dystrophy; gene diagnosis; linkage; polymerase chain reaction
杜氏进行性肌营养不良(DMD)是较常见的X连锁隐性遗传性疾病，是由于抗肌营养不良蛋白 基因缺陷使骨骼肌中抗肌萎缩蛋白缺失或功能异常所致。约2/3病人的基因突变为部分片 段缺失，其余为非缺失性改变。目前采用cDNA探针或多重聚合酶链反应(PCR)技术 可检测大部分缺失或重复性基因突变，对非缺失型家系可通过限制性片段长度多态性(RFLP )进行连锁分析〔1〕。近年发现，肌营养不良蛋白基因内有数个具有长度多态性的CA 重复序列，其扩增片段长度多态性(Amp-FLP)信息量大，杂合率高，是进行基因连锁分析 的理想位点〔2〕。许顺斌等〔3〕根据DMD基因结构特点，应用PCR技术 扩增DMD基因的3个外显子和6个CA重复序列，建立了一套能同时检测基因缺失和 非缺失型的快速检测体系。我们应用此检测体系对10个DMD家系进行了基因分析和产前 诊断。现报告如下。
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1 对象与方法
1.1 研究对象
选择10个DMD家系，包括先证者及其父母同胞共26例，先证者均为男性，年龄3～17岁。均具 有典型的临床症状和体征，病人来自青岛医学院附属医院。其中3个家系 进行了胎儿产前基因诊断。每个家系的受检对象包括先证者及其父母和同胞。
1.2 DNA提取
取病人及有关亲属外周静脉血5mL，产前诊断时，同时取孕妇孕中期羊水20mL ，按常规方法进行蛋白酶K消化4h以上，用饱和盐析法提取DNA〔1〕.
1.3 PCR扩增
PCR扩增引物及试剂均由中国医学科学院基础所医学遗传室提供。引物共有9对，分别 扩增抗肌萎缩蛋白基因5′脑组织特异性启动子附近(5′CA)和3′非翻译区(MP1P)、内 含子44，45，49，50中的CA重复序列以及3个基因缺失热点外显子12(A)，17(B),1 9(C).此9对引物分成3组，分别以D1(A,5′CA,MP1P),D2(B,i44,i49),D3(C,i45,i 50)标明，每个标本均用3个反应体系同时扩增。在25μL反应体系中含10×TBE缓冲液(50 mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,1.5mmol/L MgCl2,1g/L Triton-X100) 2.5μL,4×dNT P(100μmmol/L)2μL,引物(各0.5μmmol/L)2.5μL,Taq DNA聚合酶1μL(2U),基因 组DNA 2μL.PCR反应在美国PE公司产480 DNA扩增仪中进行。反应条件为：95℃预变性 5min,94℃ 30s,55℃ 30s,70℃ 1min,最后置70℃延伸5min.
, 百拇医药
1.4 Amp-FLP检测
每一标本的扩增均取7μL,并同时进行80g/L聚丙烯酰胺非变性凝胶(胶厚0.8mm)电泳分离 ，缓冲体系1×TBE，电压600V，室温下电泳，待二甲苯蓝泳至胶下5/6处时(约电泳2.5h) 停止电泳。凝胶用硝酸银染色法显示结果〔4〕。
2 结 果
9对引物的扩增产物经凝胶银染后可获得清晰的DNA条带，由于各引物扩增的基因片段不同(A:360bp,5′CA:190bp,MP1P:68bp,B:416bp,i44:190bp,i49:240bp,C:46 8bp,i45:170bp,i50:240bp),在凝胶上可以明显辨别每一标本各扩增片段的位置。一般情 况下，正常个体的DNA扩增标本应在凝胶上显示9条以上的扩增条带，除A，B，C三个外显子 扩增带为单一条带外，其他6个CA重复序列扩增带的位置上可出现1～6条不等的条带，有时 女性标本可出现2～3条带，而男性标本一般只出现1条带。由于是4个标本扩增产物同时电泳 ，有利于不同个体的基因扩增情况在同一凝胶上进行对比分析。对于缺失型病人，可通 过观察相应扩增条带的丢失情况判断；对非缺失型病人则根据家系各成员6个CA重复序列扩 增的长度多态性进行单体型分析并判断。经Amp-FLP检测，本组9例先证者中发现外显子 缺失型6例，内含子缺失型1例，2例为非缺失型。3例产前诊断胎儿中，发现1例女胎为携带 者，1例男胎为缺失型，1例男胎为正常。
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3 讨 论
抗肌营养不良蛋白基因是至今所认识的最大的致病基因，含有79个外显子。根据DMD基 因变异性质可分为缺失型和非缺失型，变异范围较大。其中缺失型约占60%，目前已可采用 多重PCR的方法快速检测，诊断率高达98%以上。对非缺失型的检测一般采用基因内某一点或 两端的RFLP位点进行连锁分析。但由于传统的RFLP方法步骤繁琐，样品需要量大，检查费用 高，而且所用位点多态信息量不高，诊断的准确性差。1990年以来，为了在基因内部和 两侧寻找信息量充足的多态位点，国内外陆续报道了DMD基因两侧及基因内数个具有长度多 态性的CA重复序列〔5～7〕，其扩增片段多态性的信息量大。有学者对中国人DMD基因 中的 CA多态位点的研究表明，这些位点的多态信息含量很高。由这些位点组成的单体型对X染色 体的分辨能力很高。特别是位于基因突变高发区的4个内含子位点，信息量高〔3〕。 在此基础上建立的DMD基因诊断新体系——Amp-FLP单体型连锁分析快速基因诊断程序，将 缺失型基因检测和非缺失型基因的连锁分析同步完成，具有简便、快速、灵敏的优点。本检 测体系的另一优点就是凝胶用硝酸银染色，实验结果可在凝胶上直接判断，避免了放射线和 有毒物质的伤害，且凝胶结果可用干胶或保鲜膜封胶后长期保存。本文结果表明，只要先证 者的临床诊断正确，对先证者和携带者的基因诊断都会得到鉴定，同时对症状前诊断和产前 诊断也会起重要作用，这对症状前治疗和选择性流产具有指导意义。
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参考文献
1 陈 凡，黄尚志，方炳良，等. 限制酶切片段长度多态性连锁分析检测进行性 肌营养不良基因携带者.中华医学杂志，1991，71：339
2 Litt M,Luty JA. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro a mplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet,1989,44:397
3 许顺斌，黄尚志，罗会元. DMD/BMD基因诊断的新体系——Amp-FLP连锁分析. 中国医学科学院学报，1993，15：405
4 Brandt B, Greger V, Yandell D, et al. A simple and nonradioactive met hod for detecting the Rbl.20 DNA polymorphism in the retioblastoma gene. Am J Hum Genet, 1992,51:1450
, 百拇医药
5 Roberts GR, Montandon AJ, Bobrow M, et al. Detection of novel genetic markers by mismatch analysis. Nucleic Acids Res,1989,17:5961
6 Clements PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in D/BMD families,using dinucleotide repeat polymorphisms. Am J Hum Genet,1991,49:51
7 许顺斌，黄尚志，卢 珊，等. Dystrophin基因5′及3′区域CA重复序列的多 态性分析及其在DMA/BMD基因诊断中的应用. 中华医学遗传学杂志，1993，10( 6)：324
(1999-04-15收稿 1999-08-20修回), 百拇医药(作者：王修海 张 锋 王培林 杜嗣廉 王 兰2)
单位：王修海 张 锋 王培林 杜嗣：廉青岛医学院生 物学教研室(青岛 266021)王 兰:青岛市市北区医院五官科
关键词：肌营养不良；基因诊断；连锁；聚合酶链反应
青岛医学院990403 【摘 要】 ①目的 探讨扩增片段长度多态性(Amp-FLP)连锁分析对杜氏进行性肌营养不良(DMD)基因诊断中的 价值。②方法 运用多重聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳银染 法，对10个DMD家系成员的抗肌营养不良蛋白基因内9个基因区进行了Amp-FLP连锁分析。③结果 10个DMD家系中的9个先证者，6例为外显子缺失，1例为内含 子缺失，2例为非缺失型。④结论 Amp-FLP连锁分析是对DMD进行 基因诊断的实用方法。
中国图书馆分类法分类号 Q7
, http://www.100md.com
APPLICATION OF AMP-FLP LINKAGE AN ALYSIS IN
GENE DIAGNOSIS OF DMD
Wang Xiuhai, Zhang Feng, Wang Peilin, et al
Department of Biology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To explore the value of Amp-FLP Lin kage analysis on gene diagnosis of Duchenne muscular dysdrophin(DMD). Methods The amplified fragment length polymorphism of 9 gene regi ons of the dysdtrophin gene in 10 DMD families was linkedly analyzed by multiple x PCR, PAGE and silver staining. Results 6 exon, 1 intro deletion and 2 non-deletion were detecte d in 9 probands of 10 DMD families. Conclusion Amp-FLP linkage analysis is a useful method in gene d iagnosis of DMD.
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【KEY WORDS】 muscular dystrophy; gene diagnosis; linkage; polymerase chain reaction
杜氏进行性肌营养不良(DMD)是较常见的X连锁隐性遗传性疾病，是由于抗肌营养不良蛋白 基因缺陷使骨骼肌中抗肌萎缩蛋白缺失或功能异常所致。约2/3病人的基因突变为部分片 段缺失，其余为非缺失性改变。目前采用cDNA探针或多重聚合酶链反应(PCR)技术 可检测大部分缺失或重复性基因突变，对非缺失型家系可通过限制性片段长度多态性(RFLP )进行连锁分析〔1〕。近年发现，肌营养不良蛋白基因内有数个具有长度多态性的CA 重复序列，其扩增片段长度多态性(Amp-FLP)信息量大，杂合率高，是进行基因连锁分析 的理想位点〔2〕。许顺斌等〔3〕根据DMD基因结构特点，应用PCR技术 扩增DMD基因的3个外显子和6个CA重复序列，建立了一套能同时检测基因缺失和 非缺失型的快速检测体系。我们应用此检测体系对10个DMD家系进行了基因分析和产前 诊断。现报告如下。
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1 对象与方法
1.1 研究对象
选择10个DMD家系，包括先证者及其父母同胞共26例，先证者均为男性，年龄3～17岁。均具 有典型的临床症状和体征，病人来自青岛医学院附属医院。其中3个家系 进行了胎儿产前基因诊断。每个家系的受检对象包括先证者及其父母和同胞。
1.2 DNA提取
取病人及有关亲属外周静脉血5mL，产前诊断时，同时取孕妇孕中期羊水20mL ，按常规方法进行蛋白酶K消化4h以上，用饱和盐析法提取DNA〔1〕.
1.3 PCR扩增
PCR扩增引物及试剂均由中国医学科学院基础所医学遗传室提供。引物共有9对，分别 扩增抗肌萎缩蛋白基因5′脑组织特异性启动子附近(5′CA)和3′非翻译区(MP1P)、内 含子44，45，49，50中的CA重复序列以及3个基因缺失热点外显子12(A)，17(B),1 9(C).此9对引物分成3组，分别以D1(A,5′CA,MP1P),D2(B,i44,i49),D3(C,i45,i 50)标明，每个标本均用3个反应体系同时扩增。在25μL反应体系中含10×TBE缓冲液(50 mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl,1.5mmol/L MgCl2,1g/L Triton-X100) 2.5μL,4×dNT P(100μmmol/L)2μL,引物(各0.5μmmol/L)2.5μL,Taq DNA聚合酶1μL(2U),基因 组DNA 2μL.PCR反应在美国PE公司产480 DNA扩增仪中进行。反应条件为：95℃预变性 5min,94℃ 30s,55℃ 30s,70℃ 1min,最后置70℃延伸5min.
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1.4 Amp-FLP检测
每一标本的扩增均取7μL,并同时进行80g/L聚丙烯酰胺非变性凝胶(胶厚0.8mm)电泳分离 ，缓冲体系1×TBE，电压600V，室温下电泳，待二甲苯蓝泳至胶下5/6处时(约电泳2.5h) 停止电泳。凝胶用硝酸银染色法显示结果〔4〕。
2 结 果
9对引物的扩增产物经凝胶银染后可获得清晰的DNA条带，由于各引物扩增的基因片段不同(A:360bp,5′CA:190bp,MP1P:68bp,B:416bp,i44:190bp,i49:240bp,C:46 8bp,i45:170bp,i50:240bp),在凝胶上可以明显辨别每一标本各扩增片段的位置。一般情 况下，正常个体的DNA扩增标本应在凝胶上显示9条以上的扩增条带，除A，B，C三个外显子 扩增带为单一条带外，其他6个CA重复序列扩增带的位置上可出现1～6条不等的条带，有时 女性标本可出现2～3条带，而男性标本一般只出现1条带。由于是4个标本扩增产物同时电泳 ，有利于不同个体的基因扩增情况在同一凝胶上进行对比分析。对于缺失型病人，可通 过观察相应扩增条带的丢失情况判断；对非缺失型病人则根据家系各成员6个CA重复序列扩 增的长度多态性进行单体型分析并判断。经Amp-FLP检测，本组9例先证者中发现外显子 缺失型6例，内含子缺失型1例，2例为非缺失型。3例产前诊断胎儿中，发现1例女胎为携带 者，1例男胎为缺失型，1例男胎为正常。
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3 讨 论
抗肌营养不良蛋白基因是至今所认识的最大的致病基因，含有79个外显子。根据DMD基 因变异性质可分为缺失型和非缺失型，变异范围较大。其中缺失型约占60%，目前已可采用 多重PCR的方法快速检测，诊断率高达98%以上。对非缺失型的检测一般采用基因内某一点或 两端的RFLP位点进行连锁分析。但由于传统的RFLP方法步骤繁琐，样品需要量大，检查费用 高，而且所用位点多态信息量不高，诊断的准确性差。1990年以来，为了在基因内部和 两侧寻找信息量充足的多态位点，国内外陆续报道了DMD基因两侧及基因内数个具有长度多 态性的CA重复序列〔5～7〕，其扩增片段多态性的信息量大。有学者对中国人DMD基因 中的 CA多态位点的研究表明，这些位点的多态信息含量很高。由这些位点组成的单体型对X染色 体的分辨能力很高。特别是位于基因突变高发区的4个内含子位点，信息量高〔3〕。 在此基础上建立的DMD基因诊断新体系——Amp-FLP单体型连锁分析快速基因诊断程序，将 缺失型基因检测和非缺失型基因的连锁分析同步完成，具有简便、快速、灵敏的优点。本检 测体系的另一优点就是凝胶用硝酸银染色，实验结果可在凝胶上直接判断，避免了放射线和 有毒物质的伤害，且凝胶结果可用干胶或保鲜膜封胶后长期保存。本文结果表明，只要先证 者的临床诊断正确，对先证者和携带者的基因诊断都会得到鉴定，同时对症状前诊断和产前 诊断也会起重要作用，这对症状前治疗和选择性流产具有指导意义。
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参考文献
1 陈 凡，黄尚志，方炳良，等. 限制酶切片段长度多态性连锁分析检测进行性 肌营养不良基因携带者.中华医学杂志，1991，71：339
2 Litt M,Luty JA. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro a mplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet,1989,44:397
3 许顺斌，黄尚志，罗会元. DMD/BMD基因诊断的新体系——Amp-FLP连锁分析. 中国医学科学院学报，1993，15：405
4 Brandt B, Greger V, Yandell D, et al. A simple and nonradioactive met hod for detecting the Rbl.20 DNA polymorphism in the retioblastoma gene. Am J Hum Genet, 1992,51:1450
, 百拇医药
5 Roberts GR, Montandon AJ, Bobrow M, et al. Detection of novel genetic markers by mismatch analysis. Nucleic Acids Res,1989,17:5961
6 Clements PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in D/BMD families,using dinucleotide repeat polymorphisms. Am J Hum Genet,1991,49:51
7 许顺斌，黄尚志，卢 珊，等. Dystrophin基因5′及3′区域CA重复序列的多 态性分析及其在DMA/BMD基因诊断中的应用. 中华医学遗传学杂志，1993，10( 6)：324
(1999-04-15收稿 1999-08-20修回), 百拇医药(作者：王修海 张 锋 王培林 杜嗣廉 王 兰2)