疟原虫PCR诊断技术实验条件的探讨
作者：周蕾 诸欣平 高欣
单位：首都医科大学细胞生物系寄生虫学教研室
关键词：
首都医科大学学报990419 近年来快速发展的聚合酶链反应(PCR)技术，由于其高度敏感性及特异性，在临床疟疾诊断及现场大规模流行病学调查中发挥了重要作用。为优化基因诊断试剂盒的条件，使其更加简便实用，本研究进行了关键步骤的优化工作。
1 材料和方法
采集云南恶性疟流行区病人血样。用采血针刺破指尖后挤出1～2滴血(约20～40 μL全血)，滴于1 mL RPMI 1640贮存液中，混匀后置于冰箱保存。样本DNA制备参见文献[1]。
套式PCR扩增反应：反应总体积为20 μL，其中包括2 mmol/L氯化镁，125 μmol/L dNTP(脱氧三磷酸核苷)，自行设计的扩增恶性疟原虫的2对引物，引物序列参见文献[2]。耐热Taq聚合酶，模板萃取液1 μL加入含1对外引物的上述反应系统，进行第1次扩增：95 ℃ 5 min，58 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，经25个循环后取1.2 μL反应液加入另一含1对特异内引物的反应体系中(20 μL)，继续扩增30个循环。
, 百拇医药
2%琼脂糖凝胶电泳后用UVP GDS 8000凝胶分析仪观察和记录分析结果。
2 结果和讨论
含Taq酶的PCR扩增体系在不同室温下的活性变化实验：将含有30 U/mL Taq酶的PCR反应液置于15 ℃室温，分别放置1、2、3、4 h的各管同时进行扩增反应，均可见到200 bp左右一清晰的扩增带。说明含Taq酶的反应体系在15 ℃放至4 h后仍不影响结果。
将含上述Taq酶总液置于25 ℃室温中，分别于1、2、3、4 h后同时扩增，结果显示：室温放置3 h，仍可扩增出清晰可见的特异片段。但放置4 h后，扩增效果减弱，所以室温25 ℃放置的Taq酶其高活性至少可保持3 h。
不同Taq酶含量的影响：在25 ℃时，当Taq酶含量从30 U/mL增加到50 U/mL时，含Taq酶的PCR反应液在室温放置4 h，仍可扩增出清晰的条带。
, 百拇医药
为了简化PCR基因诊断的操作步骤，我们摸索使用肼黄(C16H9N4Na3O9S2)做为指示剂。将同一样品分别做2管，其中1管是在PCR前加入肼黄的上样缓冲液，另1管是在PCR反应后加入肼黄的上样缓冲液，结果2管均显示出同样清晰的扩增条带。说明在PCR反应液中加入含肼黄指示剂的上样缓冲液，不影响扩增效果。
Taq酶的活性对于基因扩增反应至关重要。本实验对不同室温下的Taq酶活性及含量进行了研究。结果显示在室温下(25 ℃)Taq酶高活性可至少维持3 h。适量增加Taq酶的含量，可增加扩增反应的效果。在PCR反应液中加入肼黄上样缓冲液并不影响基因扩增的效果，简化了PCR后再加入上样液的繁琐步骤。上述条件的摸索和优化为疟原虫基因诊断在临床的应用提供了实用可行的必备条件。
北京市教育科技发展基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 诸欣平,李明,董洁,等.套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究.中国寄生虫病防治杂志,1998,11(2):92
2 Snounou G, Viriyakosol S, Zhu X P, et al. High sensitivity of human malaria parasites by the use of detection of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem Parasitol, 1993,61:315
收稿日期：1999-08-31, 百拇医药
单位：首都医科大学细胞生物系寄生虫学教研室
关键词：
首都医科大学学报990419 近年来快速发展的聚合酶链反应(PCR)技术，由于其高度敏感性及特异性，在临床疟疾诊断及现场大规模流行病学调查中发挥了重要作用。为优化基因诊断试剂盒的条件，使其更加简便实用，本研究进行了关键步骤的优化工作。
1 材料和方法
采集云南恶性疟流行区病人血样。用采血针刺破指尖后挤出1～2滴血(约20～40 μL全血)，滴于1 mL RPMI 1640贮存液中，混匀后置于冰箱保存。样本DNA制备参见文献[1]。
套式PCR扩增反应：反应总体积为20 μL，其中包括2 mmol/L氯化镁，125 μmol/L dNTP(脱氧三磷酸核苷)，自行设计的扩增恶性疟原虫的2对引物，引物序列参见文献[2]。耐热Taq聚合酶，模板萃取液1 μL加入含1对外引物的上述反应系统，进行第1次扩增：95 ℃ 5 min，58 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，经25个循环后取1.2 μL反应液加入另一含1对特异内引物的反应体系中(20 μL)，继续扩增30个循环。
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2%琼脂糖凝胶电泳后用UVP GDS 8000凝胶分析仪观察和记录分析结果。
2 结果和讨论
含Taq酶的PCR扩增体系在不同室温下的活性变化实验：将含有30 U/mL Taq酶的PCR反应液置于15 ℃室温，分别放置1、2、3、4 h的各管同时进行扩增反应，均可见到200 bp左右一清晰的扩增带。说明含Taq酶的反应体系在15 ℃放至4 h后仍不影响结果。
将含上述Taq酶总液置于25 ℃室温中，分别于1、2、3、4 h后同时扩增，结果显示：室温放置3 h，仍可扩增出清晰可见的特异片段。但放置4 h后，扩增效果减弱，所以室温25 ℃放置的Taq酶其高活性至少可保持3 h。
不同Taq酶含量的影响：在25 ℃时，当Taq酶含量从30 U/mL增加到50 U/mL时，含Taq酶的PCR反应液在室温放置4 h，仍可扩增出清晰的条带。
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为了简化PCR基因诊断的操作步骤，我们摸索使用肼黄(C16H9N4Na3O9S2)做为指示剂。将同一样品分别做2管，其中1管是在PCR前加入肼黄的上样缓冲液，另1管是在PCR反应后加入肼黄的上样缓冲液，结果2管均显示出同样清晰的扩增条带。说明在PCR反应液中加入含肼黄指示剂的上样缓冲液，不影响扩增效果。
Taq酶的活性对于基因扩增反应至关重要。本实验对不同室温下的Taq酶活性及含量进行了研究。结果显示在室温下(25 ℃)Taq酶高活性可至少维持3 h。适量增加Taq酶的含量，可增加扩增反应的效果。在PCR反应液中加入肼黄上样缓冲液并不影响基因扩增的效果，简化了PCR后再加入上样液的繁琐步骤。上述条件的摸索和优化为疟原虫基因诊断在临床的应用提供了实用可行的必备条件。
北京市教育科技发展基金资助项目
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参考文献
1 诸欣平,李明,董洁,等.套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究.中国寄生虫病防治杂志,1998,11(2):92
2 Snounou G, Viriyakosol S, Zhu X P, et al. High sensitivity of human malaria parasites by the use of detection of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem Parasitol, 1993,61:315
收稿日期：1999-08-31, 百拇医药