白细胞抑制因子对鼠急性肺损伤时白细胞的影响
作者：付海香 潘莉莉王辉 何平
单位：中国医科大学第二临床学院(110003)内科
关键词：白细胞抑制因子；急性肺损伤；中性粒细胞；单核细胞
心肺血管病杂志990417
摘要 为探讨白细胞抑制因子(NIF)转基因后在鼠急性肺损伤时肺内、循环静脉血中白细胞的影响。本实验采用阳离子脂类，NIF基因重组法，用脂多糖(LPS)致鼠急性肺损伤，分组测定静脉血及肺泡内白细胞的变化。结果发现LPS诱发急性肺损伤后2h静脉血中白细胞明显减少(P<0.01)，在肺泡灌洗液内中性粒细胞明显增多(P<0.01)。而采用NIF/LPS注射组的肺泡灌洗液内中性粒细胞数与LPS组比较却明显降低(P<0.05)。在NIF注射组中单核细胞明显增多。NIF转基因后，对LPS诱发的急性肺损伤中白细胞浸润及肺内聚集现象有明显的抑制作用。NIF注射后对白细胞总数无明显影响，可使单核细胞数量增加，这可能是机体免疫反应的结果。
, 百拇医药
白细胞抑制因子(抗粘附糖蛋白NIF)是一种41kD糖蛋白。近年来的研究表明NIF能选择性的与白细胞表面的CD11/CD18(白细胞粘附分子)的α键结合，从而抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附作用[1]。这样，在LPS诱发的急性肺损伤过程中，防止了大量白细胞在肺组织的聚集，减轻炎性反应，也有益于炎症的消退。并可能通过NIF激活体内免疫系统，使单核细胞的数量增多以及吞噬作用增强，达到对肺的保护作用。我们采用阳离子脂类将重组的NIF基因转移给CD-1小鼠。试图探讨NIF在鼠肺内表达后对脂多糖(LPS)诱发的鼠急性肺损伤时白细胞聚集的影响以及循环血中和肺泡灌洗液中白细胞数量的变化。现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料 1.实验动物为6～12周雄性健康CD-1小鼠，体重25～30g，所有用于实验的小鼠均在无菌条件下饲养。2.试剂 PCR3(克隆媒介)，购自Inritrogen,SanDiegoCA.PBluseript-NIF由DrsMathenMoyle和Honord Soule Clorvas International ColaJolla,CA等提供；Dimothyldioctude cylammonium bromide(DDAB)购自Sigma,stLouisMo;胆固醇购自Calbiochem,Co,LaJolla,CA;LPS注射液(0111：B4)购自Sigma,stLouisMo。3.仪器 旋转式蒸气仪，购自Brikmann,Westhury,NY;肺泡灌洗分离仪(Ditt.Quik),购自BoxterHealthease,Megaropark,IL。
, 百拇医药
二、方法 1.动物分组 随机将小鼠分为4组。①正常对照组；②LPS注射组；③NIF注射组；④NIF/LPS注射组。每组16只，注射试剂前及转基因前用含有ketomine(氯胺酮)60mg/kg和xylazine(甲苯噻嗪)20mg/kg的PBS溶液肌肉注射麻醉。试验后的小鼠要求存活48h。2.NIF基因重组 将PBluescript,SKt的NIFcDNA克隆剂，PCR-3和ECoRl配置，以完成PCR3-NIF基因重组。应用PCR3-Bgal和PCR3-NIF转移给293细胞(人胚肾细胞)的方法，在体外已证实了转基因的表达。3.重组NIF在小鼠体内基因转移 将含有DDAB和胆固醇(1∶1比例)的混合物，用旋转式蒸气仪混合干燥，再以5%葡萄糖液溶解，充分混合约20min，以DNA(NIF)1mg对8nmoles的胆固醇比例构成转基因混合物，通过球后静脉将重组基因复合物注射给小鼠(500mg/只)。4.鼠肺转基因表达的证实 应用SuperScriptPreamplification试剂系统，完成PT-PCR过程，用无RNase的DNaseⅠ对肺组织的RNA样品作预处理，消除污染，用oligo-dT引物和反转录酶混合标本，42°C下孵育1h，合成cDNA，再加入0.5nM引物(5′ACACAACCTGAGGT-GC和3′-AG-CAGAGTCCGTGATC)进行多聚酶链反应(PCR)，PCR在94°C30s，55°C1min，72°C45s条件下进行。然后对每组肺组织的RNA(10μg/每个样品)样品，通过在甲酰胺和甲醛溶液中55°C，15min变性处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳。通过Northern杂交，RNA被印迹在Duralose-uv膜上；按试剂应用说明进行冲洗，再用(a-P32)dCTP(3000Ci/mmole)标化cDNA探针，最后在-80°C下进行放射自显影6h。5.急性肺损伤模型的制备 将LPS溶液200mg(以PBS0.5ml溶解，PH7.4)，分别经腹腔注射给小鼠。注射后2h处死小鼠，经右心室采血。进行白细胞总分数测定。然后气管插管，应用3mlPBS溶液反复支气管肺泡灌洗3次，再将灌洗液离心。用cytosprin染色后进行分类计数。按照常规方法，每张片子计数300个细胞，分别统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，取均值进行计算。6.对照组及实验组动物处理 为测定LPS引起肺损伤时NIF对白细胞的影响，在LPS注射前每组的16只小鼠分别经球后静脉注射PBS、NIF及NIF/脂复合物(500mg)各0.1ml，经48h后再经腹腔内注入LPS200mg。注射后2h,分别处死动物，进行有关项目的测定。
, http://www.100md.com
三、统计分析 所有数据资料以±s表示，组间比较采用t检验。
结 果
1.LPS腹腔内注入引起鼠的急性肺损伤 经正常小鼠以200mg的LPS腹腔注射，2h后发现鼠的肺泡内有明显的白细胞浸润，而采用NIF/脂复合物注射组，虽然用等剂量的LPS注射，但未见肺内有明显的白细胞聚集现象。
2.采用KT-PCR方法及Northern杂交，证明了NIF基因在小鼠肺内有较高水平表达，并证明DNA片段含有720个BP。在对照样品中用DNaseⅠ预处理而没有反转录的样品中，没有观察到这种PCR产物。
3.各组动物血液及肺泡灌洗液中白细胞的变化见表1和表2。
表1 血液中(静脉血)白细胞的变化(±s) 组 别
, 百拇医药
白细胞总数(G/L)
中性粒细胞(%)
单核细胞(%)
淋巴细胞(%)
正常对照组
6.5±0.6
29.4±2.2
3.8±0.5
65.7±6.0
LPS注射组
2.3±0.5**
45.7±7.4*
, 百拇医药
3.2±0.5
51.8±7.6
NIF注射组
5.6±0.7
20.92±5.3
20.8±7.3
53.0±6.2
NIF/脂复合物注射组
5.0±0.7
18.4±6.3△
28.7±9.7△△
52.2±6.2
, http://www.100md.com
注：与对照组比较**P<0.01，*P<0.05；与LPS组比较△△P<0.01，△P<0.05
表2 支气管肺泡灌洗液中白细胞的变化(±s) 组 别
中性粒细胞(个)
单核细胞(个)
淋巴细胞(个)
正常对照组
6.4±2.4
23.0±6.9
70.9±6.8
LPS注射组
97.2±26.2**
, 百拇医药
17.6±5.8
31.7±12.1
NIF注射组
50.3±9.3
70.9±2.3**
30.4±9.9
NIF/脂复合物注射组
20.1±7.7△△
16.7±7.8
75.0±20.9
注：与对照组比较**P<0.01，与LPS组比较△△P<0.01
, 百拇医药
从表1中可以看出，LPS腹腔内注射2h后可引起鼠血中白细胞总数减少，与正常对照组有非常显著差异。而中性粒细胞却显著升高。在NIF/脂混合物注射后48h，再腹腔内注射LPS，血中白细胞总数轻度降低，中性粒细胞则明显低于单纯LPS注射组。在NIF注射的2组，血中单核细胞明显增多。从表2中看出，肺泡灌洗液中也显示同样的结果。在肺泡灌洗液中LPS注射组显示出中性粒细胞明显增多，其与正常组及NIF/脂复合物组均有显著差异。讨 论
急性肺损伤的主要表现为呼吸窘迫综合症。它是由内毒素引起的以顽固性低氧血症为特征的急性呼吸衰竭，其发病机理复杂。治疗上也很困难，死亡率很高。过去20多年来，由于呼吸机及全身治疗的应用，早期诊断及治疗的病死率有所下降，但仍可达50%～70%。近年来随着人们对其病理生理特点认识的不断深入，开展了一些新的疗法，如外源性肺表面活性物质替代疗法[2]。随着细胞生物学及分子生物学的进展，也出现了急性肺损伤的免疫疗法[3]。尽管治疗方法诸多，但迄今为止仍无较为完善的、理想的治疗方法。本文主要研究的是急性肺损伤的基因治疗。
, http://www.100md.com
急性肺损伤的主要病理改变是中性粒细胞粘附于肺微血管内皮细胞，然后移行于肺泡腔引起渗出性肺水肿。近年来发现白细胞抑制因子(NIF)是一种抗粘附蛋白，它能选择性的与白细胞表面的CD11/CD18的α键结合[1]，从而抑制白细胞的聚集及其对血管内皮细胞的粘附作用，其机制可能为NIF竞争性的与中性粒细胞表面的粘附糖蛋白有高亲合力的结合。在体外研究中已证明抗CD11/CD18单克隆抗体可阻断多形核粒细胞对内皮细胞的粘附，并在实验动物体内有预防白细胞聚集的作用[4，5]。本项研究中，采用NIF/脂复合物静脉注射，达到鼠体内NIF转基因的目的，而且鼠肺内NIF基因有较高水平的表达。结果表明NIF转基因后的小鼠对LPS诱发的急性肺损伤有较理想的防治作用。表现在肺组织中无明显的中性粒细胞聚集现象，与单纯LPS注射组比较，在循环血中两者有明显差异(P<0.01)。说明NIF转基因后对急性肺损伤有明显的防治作用。其作用机理可能为：当LPS引起肺组织发生急性炎变时，NIF能迅速的从组织中释放并进入微循环中与白细胞表面的CD11b/CD18结合，并加速白细胞的破坏，减轻炎性反应，有学者认为白细胞浸润减轻的现象是通过肺泡-毛细血管屏障进行的[6]。本实验还显示了NIF可刺激单核巨噬细胞明显增多，并发现有大量吞噬细胞，说明NIF可激活体内免疫系统，加速了多形核细胞的破坏和消除，减轻了肺部的炎性反应。本实验结果表明NIF转基因后可有效的防治肺损伤的发生。这将为进一步NIF转基因的临床研究提供有力的理论依据，并为急性肺损伤的有效治疗创出新的途径。
, 百拇医药
潘莉莉(中心实验室)
参考文献
1 丁冠男，李树人.ARDS的治疗进展.国外医学麻醉学与复苏分册.1994，13(5)：302～304.
2 金敬顺，陈正堂，毛宝龄，等.ARDS的免疫治疗.国外医学呼吸系统分册.1995，15(3)：123～125.
3 Liu Y,Liggit D,Zhang W,et al.Cationic liposome mediated intravenous gene deli very.J Biol Chem，1995,270:24864～24870.
4 Rieu P,Suginori T,Griffith DL,et al,Solvent-accessible residues on the metal iondependent adhesion site face of integrin CR,mediate its binding to the neutro phil inhibitory factor,J Biol.1996,271:15858～15861.
, http://www.100md.com
5 Morisaki P,Goya T,Toh K,et al.The anti Mac-1 monoclonal antibody inhibits neu trophil sequestration in lung and liver in septic marine model,Immunal & Immuno pathol.1991,61:365～375.
6 Rieu T,Amaout MA.In adhesion molecules and the lung,P.J.Ward and C Fantone,e ditors.(Marcel Deuuer,Inc New York).1996,Vol 89:1～42.
(1999-03-17收稿)
(1999-06-23修回), 百拇医药
单位：中国医科大学第二临床学院(110003)内科
关键词：白细胞抑制因子；急性肺损伤；中性粒细胞；单核细胞
心肺血管病杂志990417
摘要 为探讨白细胞抑制因子(NIF)转基因后在鼠急性肺损伤时肺内、循环静脉血中白细胞的影响。本实验采用阳离子脂类，NIF基因重组法，用脂多糖(LPS)致鼠急性肺损伤，分组测定静脉血及肺泡内白细胞的变化。结果发现LPS诱发急性肺损伤后2h静脉血中白细胞明显减少(P<0.01)，在肺泡灌洗液内中性粒细胞明显增多(P<0.01)。而采用NIF/LPS注射组的肺泡灌洗液内中性粒细胞数与LPS组比较却明显降低(P<0.05)。在NIF注射组中单核细胞明显增多。NIF转基因后，对LPS诱发的急性肺损伤中白细胞浸润及肺内聚集现象有明显的抑制作用。NIF注射后对白细胞总数无明显影响，可使单核细胞数量增加，这可能是机体免疫反应的结果。
, 百拇医药
白细胞抑制因子(抗粘附糖蛋白NIF)是一种41kD糖蛋白。近年来的研究表明NIF能选择性的与白细胞表面的CD11/CD18(白细胞粘附分子)的α键结合，从而抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附作用[1]。这样，在LPS诱发的急性肺损伤过程中，防止了大量白细胞在肺组织的聚集，减轻炎性反应，也有益于炎症的消退。并可能通过NIF激活体内免疫系统，使单核细胞的数量增多以及吞噬作用增强，达到对肺的保护作用。我们采用阳离子脂类将重组的NIF基因转移给CD-1小鼠。试图探讨NIF在鼠肺内表达后对脂多糖(LPS)诱发的鼠急性肺损伤时白细胞聚集的影响以及循环血中和肺泡灌洗液中白细胞数量的变化。现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料 1.实验动物为6～12周雄性健康CD-1小鼠，体重25～30g，所有用于实验的小鼠均在无菌条件下饲养。2.试剂 PCR3(克隆媒介)，购自Inritrogen,SanDiegoCA.PBluseript-NIF由DrsMathenMoyle和Honord Soule Clorvas International ColaJolla,CA等提供；Dimothyldioctude cylammonium bromide(DDAB)购自Sigma,stLouisMo;胆固醇购自Calbiochem,Co,LaJolla,CA;LPS注射液(0111：B4)购自Sigma,stLouisMo。3.仪器 旋转式蒸气仪，购自Brikmann,Westhury,NY;肺泡灌洗分离仪(Ditt.Quik),购自BoxterHealthease,Megaropark,IL。
, 百拇医药
二、方法 1.动物分组 随机将小鼠分为4组。①正常对照组；②LPS注射组；③NIF注射组；④NIF/LPS注射组。每组16只，注射试剂前及转基因前用含有ketomine(氯胺酮)60mg/kg和xylazine(甲苯噻嗪)20mg/kg的PBS溶液肌肉注射麻醉。试验后的小鼠要求存活48h。2.NIF基因重组 将PBluescript,SKt的NIFcDNA克隆剂，PCR-3和ECoRl配置，以完成PCR3-NIF基因重组。应用PCR3-Bgal和PCR3-NIF转移给293细胞(人胚肾细胞)的方法，在体外已证实了转基因的表达。3.重组NIF在小鼠体内基因转移 将含有DDAB和胆固醇(1∶1比例)的混合物，用旋转式蒸气仪混合干燥，再以5%葡萄糖液溶解，充分混合约20min，以DNA(NIF)1mg对8nmoles的胆固醇比例构成转基因混合物，通过球后静脉将重组基因复合物注射给小鼠(500mg/只)。4.鼠肺转基因表达的证实 应用SuperScriptPreamplification试剂系统，完成PT-PCR过程，用无RNase的DNaseⅠ对肺组织的RNA样品作预处理，消除污染，用oligo-dT引物和反转录酶混合标本，42°C下孵育1h，合成cDNA，再加入0.5nM引物(5′ACACAACCTGAGGT-GC和3′-AG-CAGAGTCCGTGATC)进行多聚酶链反应(PCR)，PCR在94°C30s，55°C1min，72°C45s条件下进行。然后对每组肺组织的RNA(10μg/每个样品)样品，通过在甲酰胺和甲醛溶液中55°C，15min变性处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳。通过Northern杂交，RNA被印迹在Duralose-uv膜上；按试剂应用说明进行冲洗，再用(a-P32)dCTP(3000Ci/mmole)标化cDNA探针，最后在-80°C下进行放射自显影6h。5.急性肺损伤模型的制备 将LPS溶液200mg(以PBS0.5ml溶解，PH7.4)，分别经腹腔注射给小鼠。注射后2h处死小鼠，经右心室采血。进行白细胞总分数测定。然后气管插管，应用3mlPBS溶液反复支气管肺泡灌洗3次，再将灌洗液离心。用cytosprin染色后进行分类计数。按照常规方法，每张片子计数300个细胞，分别统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，取均值进行计算。6.对照组及实验组动物处理 为测定LPS引起肺损伤时NIF对白细胞的影响，在LPS注射前每组的16只小鼠分别经球后静脉注射PBS、NIF及NIF/脂复合物(500mg)各0.1ml，经48h后再经腹腔内注入LPS200mg。注射后2h,分别处死动物，进行有关项目的测定。
, http://www.100md.com
三、统计分析 所有数据资料以±s表示，组间比较采用t检验。
结 果
1.LPS腹腔内注入引起鼠的急性肺损伤 经正常小鼠以200mg的LPS腹腔注射，2h后发现鼠的肺泡内有明显的白细胞浸润，而采用NIF/脂复合物注射组，虽然用等剂量的LPS注射，但未见肺内有明显的白细胞聚集现象。
2.采用KT-PCR方法及Northern杂交，证明了NIF基因在小鼠肺内有较高水平表达，并证明DNA片段含有720个BP。在对照样品中用DNaseⅠ预处理而没有反转录的样品中，没有观察到这种PCR产物。
3.各组动物血液及肺泡灌洗液中白细胞的变化见表1和表2。
表1 血液中(静脉血)白细胞的变化(±s) 组 别
, 百拇医药
白细胞总数(G/L)
中性粒细胞(%)
单核细胞(%)
淋巴细胞(%)
正常对照组
6.5±0.6
29.4±2.2
3.8±0.5
65.7±6.0
LPS注射组
2.3±0.5**
45.7±7.4*
, 百拇医药
3.2±0.5
51.8±7.6
NIF注射组
5.6±0.7
20.92±5.3
20.8±7.3
53.0±6.2
NIF/脂复合物注射组
5.0±0.7
18.4±6.3△
28.7±9.7△△
52.2±6.2
, http://www.100md.com
注：与对照组比较**P<0.01，*P<0.05；与LPS组比较△△P<0.01，△P<0.05
表2 支气管肺泡灌洗液中白细胞的变化(±s) 组 别
中性粒细胞(个)
单核细胞(个)
淋巴细胞(个)
正常对照组
6.4±2.4
23.0±6.9
70.9±6.8
LPS注射组
97.2±26.2**
, 百拇医药
17.6±5.8
31.7±12.1
NIF注射组
50.3±9.3
70.9±2.3**
30.4±9.9
NIF/脂复合物注射组
20.1±7.7△△
16.7±7.8
75.0±20.9
注：与对照组比较**P<0.01，与LPS组比较△△P<0.01
, 百拇医药
从表1中可以看出，LPS腹腔内注射2h后可引起鼠血中白细胞总数减少，与正常对照组有非常显著差异。而中性粒细胞却显著升高。在NIF/脂混合物注射后48h，再腹腔内注射LPS，血中白细胞总数轻度降低，中性粒细胞则明显低于单纯LPS注射组。在NIF注射的2组，血中单核细胞明显增多。从表2中看出，肺泡灌洗液中也显示同样的结果。在肺泡灌洗液中LPS注射组显示出中性粒细胞明显增多，其与正常组及NIF/脂复合物组均有显著差异。讨 论
急性肺损伤的主要表现为呼吸窘迫综合症。它是由内毒素引起的以顽固性低氧血症为特征的急性呼吸衰竭，其发病机理复杂。治疗上也很困难，死亡率很高。过去20多年来，由于呼吸机及全身治疗的应用，早期诊断及治疗的病死率有所下降，但仍可达50%～70%。近年来随着人们对其病理生理特点认识的不断深入，开展了一些新的疗法，如外源性肺表面活性物质替代疗法[2]。随着细胞生物学及分子生物学的进展，也出现了急性肺损伤的免疫疗法[3]。尽管治疗方法诸多，但迄今为止仍无较为完善的、理想的治疗方法。本文主要研究的是急性肺损伤的基因治疗。
, http://www.100md.com
急性肺损伤的主要病理改变是中性粒细胞粘附于肺微血管内皮细胞，然后移行于肺泡腔引起渗出性肺水肿。近年来发现白细胞抑制因子(NIF)是一种抗粘附蛋白，它能选择性的与白细胞表面的CD11/CD18的α键结合[1]，从而抑制白细胞的聚集及其对血管内皮细胞的粘附作用，其机制可能为NIF竞争性的与中性粒细胞表面的粘附糖蛋白有高亲合力的结合。在体外研究中已证明抗CD11/CD18单克隆抗体可阻断多形核粒细胞对内皮细胞的粘附，并在实验动物体内有预防白细胞聚集的作用[4，5]。本项研究中，采用NIF/脂复合物静脉注射，达到鼠体内NIF转基因的目的，而且鼠肺内NIF基因有较高水平的表达。结果表明NIF转基因后的小鼠对LPS诱发的急性肺损伤有较理想的防治作用。表现在肺组织中无明显的中性粒细胞聚集现象，与单纯LPS注射组比较，在循环血中两者有明显差异(P<0.01)。说明NIF转基因后对急性肺损伤有明显的防治作用。其作用机理可能为：当LPS引起肺组织发生急性炎变时，NIF能迅速的从组织中释放并进入微循环中与白细胞表面的CD11b/CD18结合，并加速白细胞的破坏，减轻炎性反应，有学者认为白细胞浸润减轻的现象是通过肺泡-毛细血管屏障进行的[6]。本实验还显示了NIF可刺激单核巨噬细胞明显增多，并发现有大量吞噬细胞，说明NIF可激活体内免疫系统，加速了多形核细胞的破坏和消除，减轻了肺部的炎性反应。本实验结果表明NIF转基因后可有效的防治肺损伤的发生。这将为进一步NIF转基因的临床研究提供有力的理论依据，并为急性肺损伤的有效治疗创出新的途径。
, 百拇医药
潘莉莉(中心实验室)
参考文献
1 丁冠男，李树人.ARDS的治疗进展.国外医学麻醉学与复苏分册.1994，13(5)：302～304.
2 金敬顺，陈正堂，毛宝龄，等.ARDS的免疫治疗.国外医学呼吸系统分册.1995，15(3)：123～125.
3 Liu Y,Liggit D,Zhang W,et al.Cationic liposome mediated intravenous gene deli very.J Biol Chem，1995,270:24864～24870.
4 Rieu P,Suginori T,Griffith DL,et al,Solvent-accessible residues on the metal iondependent adhesion site face of integrin CR,mediate its binding to the neutro phil inhibitory factor,J Biol.1996,271:15858～15861.
, http://www.100md.com
5 Morisaki P,Goya T,Toh K,et al.The anti Mac-1 monoclonal antibody inhibits neu trophil sequestration in lung and liver in septic marine model,Immunal & Immuno pathol.1991,61:365～375.
6 Rieu T,Amaout MA.In adhesion molecules and the lung,P.J.Ward and C Fantone,e ditors.(Marcel Deuuer,Inc New York).1996,Vol 89:1～42.
(1999-03-17收稿)
(1999-06-23修回), 百拇医药