白细胞介素10基因转移抑制肾小球系膜细胞诱生
作者：
单位：李锦华 中山医科大学附属第一医院急诊科；余学清 陈永雄 张仕光 肾内科(广州510080)
关键词：基因；白细胞介素10；肾小球系膜；炎症；转染
白细胞介素10基因转移抑制肾小球系膜细胞诱生炎症细胞因子 摘 要 目的：通过建立白细胞介素10(IL-10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统，观察IL-10对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesengial cell, GMC)中细胞因子的产生及其基因表达的影响。方法：通过构建的重组逆转录病毒载体pLX(IL-10)SN将外源基因IL-10转移至大鼠GMC：(1)应用聚合酶链反应(PCR)，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA检测IL-10基因的整合和表达；(2)以RT-PCR观察IL-10基因转移对LPS诱导的GMC肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达的影响，以ELISA测定白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的蛋白质表达。结果：外源性IL-10基因已整合到靶细胞染色体DNA并有效地表达，它能抑制LPS诱生GMC过度产生IL-1β，TNF-α。结论：外源性IL-10基因可以转移到GMC并稳定表达，它能抑制GMC炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达。
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Effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines by rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro
LI Jin-Hua1, YU Xue-Qing2, CHEN Yong-Xiong2, ZHANG Shi-Guang2
1Emergency Department, 2Nephrology Department, the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510080)
, 百拇医药
Abstract AIM:To investigate the effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines in rat glomerular mesangial cells (GMC) induced by LPS in vitro.METHODS：We used constructed retroviral vector pLX(IL-10) SN to transfer exogenous gene interleukin 10 into rat GMC after gene transfer 72 hours, DNA and RNA were prepared from rat transfected GMC for the polymerase chain reaction (PCR) and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Expression of IL-10 in transfected GMC was checked by ELISA. RT-PCR and ELISA were performed to observe the effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines in rat GMC cells induced by LPS in vitro.RESULTS：Exogenous IL-10 gene had been integrated into the chromosal DNA of the transfected GMC cells. RT-PCR and ELLSA showed that exogenous IL-10 gene was expressed in the transfected GMC after transfection 48 hours and lasting for over 28 days. Exogenous IL-10 gene transfer can inhibit the secretion of the inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α in the transfected GMC at mRNA and protein level induced by LPS.CONCLUSION：Exogenous interleukin 10 gene transfer can inhibit the secretion of inflammatory cytokines in GMC.
, 百拇医药
MeSH Genes; Interleukin-10; Glomerular mesangium; Inflammation; Transfection
白细胞介素10(interleukin10,IL-10)由Fiorentino等于1989年首次发现[1]，最初称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor,CSIF)，后来称为IL-10，其cDNA序列中含有一个编码178个氨基酸的开放读码框架，分子量为18.7×103[2]。随后的研究发现，它能抑制Th1细胞亚群细胞因子γIFN，IL-2，TNF-α，GM-CSF，LT等的合成；抑制细胞粘附分子ICAM-1，B7的表达[3]。这些特性表明IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用。本实验通过建立在大鼠GMC表达IL-10的重组逆转录病毒载体基因转移系统，观察IL-10基因转移对LPS诱导的大鼠GMC中细胞因子IL-1和TNF-α的产生及其基因表达的影响，以探讨IL-10基因转移作为抗炎治疗手段的可能性。
, 百拇医药
材料与方法
(一)材料：含IL-10全长cDNA(0.61kb)的逆转录病毒载体pLX(IL-10)SN由本室构建[4]；重组逆转录病毒包装细胞PA317、NIH3T3，军事医学科学院；Wistar大鼠，中山医科大学实验动物中心；PCR kit，华美公司；RT-PCR kit， Promega; Lipofection(DOTAP)，Boehringer Mannheim; Geniticin(G418)，GIBCO BRL; Lipopolysaccharide(LPS) E coli Olll:B4，Difco Laboratory; IL-10、Rat IL-1β、Rat TNF-α ELISA kit，深圳晶美公司。
(二)方法：
1.重组逆转录病毒载体的包装与重组病毒感染滴度测定：将重组载体pLX(IL-10)SN和空白载体pLXSN用DOTAP导入PA317，用G418进行筛选；以NIH3T3细胞测定重组病毒感染滴度。单位为CFU/mL(集落形成单位/毫升)。
, 百拇医药
2.大鼠GMC的转染：按文献[5]的方法培养Wistar大鼠GMC。抗G418抗性克隆pLX(IL-10)SN和pLXSN感染大鼠GMC，120h后取GMC按文献[6]的方法提取DNA和RNA。
3.目的基因IL-10在GMC表达的检测：①PCR：引物A：5′-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3′，引物C：5′-CCTGATGGT CTCAGTTTCGTATC-3′检测目的基因IL-10在大鼠GMC的整合，产物679bp。②RT-PCR：上游引物B：5′-TCT CCG AGA TGC CTT TCA GCA GA-3′，引物C(见上)作RT-PCR检测目的基因IL-10在大鼠GMC的转录，产物418 bp。以一对引物(Sense: 5′-CAT AGA CAA GAT GGT GAA GG-3′，Anti-sense:5′-TCC ACA GTC TTC TGA GTG GC-3′)扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照，产物570 bp。 ③ELISA检测目的基因IL-10在大鼠GMC的蛋白质表达。
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4.IL-10基因转移对LPS诱导大鼠GMC分泌细胞因子的作用：将第二代培养的GMC实验分组：(1)对照组：未加LPS；(2)诱导组：加LPS(10 mg/L)；(3)转染抗G418抗性克隆pLX(IL-10)SN,72 h后加LPS(10 μg/mL)。然后分别于3、6、12、24 h收集上清液和细胞备检。①按文献[6]的方法提取总RNA。反转录后行PCR。以引物(Sense:5′-CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′,Anti-sense:5′-GTG CTT GAT CTG TTG TTT CC-3′)扩增大鼠GMC的TNFα mRNA，产物398bp。以一对引物(Sense,5′-CAT AGA CAA GAT GGT GAA GG-3′,Anti-sense 5′-GAC AAT CTT GAG GGA GTT GTC-3′扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照，产物445bp。用薄层扫描仪(CS-9000，岛津，日本)检测DNA带的含量，计算每一样品的TNFα/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。②ELISA检测GMC培养上清液各实验组IL-1β，TNFα含量。
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(三)资料统计：每个样品重复测定6次，求其均值，实验数据用
±s表示。采用计算机医用统计程序(SPSS/PC)对数据进行F及q检验。
结果
(一)经NIH3T3测定，重组病毒最高感染滴度为6×108 CFU/L。
(二)目的基因在转染大鼠GMC的表达：(1)IL-10基因整合至转染的大鼠GMC DNA的PCR检测：扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染pLX(IL-10)SN载体的有特异性扩增的pLXSN(1511bp)至IL-10 cDNA的片段，为679 bp，而转染空白载体pLXSN的大鼠肾小球系膜细胞则没有(如图1所示)。(2)IL-10基因在大鼠GMC的转录产物的检测：电泳分析显示转染载体pLX(IL-10)SN有特异扩增的IL-10mRNA片段：418 bp，而转染空白载体pLXSN的大鼠GMC则没有(如图2所示)。(3)ELISA检测显示IL-10基因在pLX(IL-10)SN转染大鼠肾小球系膜细胞48 h(d 2)后开始表达，达836 ng/106 cells.24h-1，高峰在d3，为1843 ng/106 cells.24h-1。d 7\,d 14\,d 28分别为1551、1323、1255、938 ng/106 cells.24h-1。
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(三)IL-10基因转移对大鼠GMC产生IL-1β，TNF-α蛋白质含量的影响，见表1和表2。
表1 IL-10基因转移对大鼠GMC产生IL-1β的影响
Tab 1 The effect of IL-10 gene transfer on the secretion of proinflammatory
cytokine IL-1β in rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro(ng/mL) (
±s,n=6)
Group
, 百拇医药
IL-1β
3 h
6 h
12 h
24 h
Control
121.0±10.2
150.0±14.0
146.0±13.8
141.0±11.3
LPS 10 μg/mL
389.0±32.4
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554.0±38.1
887.0±30.7
845.0±23.5
IL-10 gene transfer+LPS 10 μg/mL
153.0±12.4*
172.0±15.6*
185.0±17.7*
198.0±14.9*
* P<0.05，vs LPS 10 μg/mL 表2 IL-10基因转移对大鼠GMC产生TNF-α的影响
, 百拇医药
Tab 2 The effect of IL-10 gene transfer on the secretion of proinflammatory cytokine TNF-α
in rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro(ng/mL)(
±s,n=6)
Group
IL-1β
3 h
6 h
12 h
, 百拇医药
24 h
Control
133.0±12.9
167.0±14.2
201.0±18.8
197.0±14.5
LPS 10 μg/mL
445.0±34.1
1001.0±98.3
843.0±45.4
677.0±56.2
, 百拇医药 IL-10 gene transfer+LPS 10 μg/mL
204.0±19.7*
298.0±28.9*
310.0±29.9*
223.0±21.0*
*P<0.05，vs LPS 10 μg/mL
从表1和表2可看出：①对照组，正常大鼠GMC IL-1β，TNF-α分泌量极低；②诱导组，LPS诱导IL-1β，TNF-α蛋白质的产生明显增加；诱导组与对照组相比差异有显著(P<0.05)；③IL-10基因转移+LPS 10 μg/mL组各个时点IL-1β，TNF-α的产生与诱导组相比均减少，有明显的抑制作用(P<0.05)。
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IL-10基因转移对大鼠GMC TNF-α mRNA表达的影响：对照组，正常大鼠GMC TNF-α分泌量极低，经LPS诱导后TNF-α/GAPDH于3，6，12，24 h为0.432，0.937，0.794和0.638，说明TNF-α mRNA表达显著增加，IL-10基因转移后，用LPS诱导，TNF-α/GAPDH于3，6，12，24 h为0.195，0.286，0.304和0.210，说明IL-10基因转移能显著抑制LPS诱导大鼠GMC产生TNF-α。
Fig 1 GMC DNA of transfected rat PCR determination
Lane 1: PCR marker;Lane 2: PCR product of Rat GMC DNA [transfected with pLX(IL-10)SN vector]:679bp； Lane 3： PCR product of Rat GMC DNA (transfected with pLXSN vector)
, 百拇医药
图1 转染大鼠GMC DNA的PCR检测
Fig 2 GMC mRNA of transfected rat RT-PCR determination
Lane 1:PCR marker;Lane 2:RT-PCR product of Rat GMC mRNA [transfected with pLX(IL-10)SN vector]:418 bp; Lane 3:RT-PCR product of Rat GMC mRNA (transfected with pLXSN vector);Lane 4:Internal control:RT-PCR product of Rat GAPDH mRNA:570bp
, 百拇医药
图2 转染大鼠GMC RNA的RT-PCR检测
讨论
GMC是肾小球内非常活跃的固有细胞，在肾小球炎症与硬化的发病过程中，它既是靶细胞，又通过多种途径成为参与者，其中通过分泌IL-1，TNF-α，ICAM-1，活性氧等是它的重要效应[7]。而细胞因子的自分泌和旁分泌作用所导致的不断放大的炎症效应是慢性肾炎持续发展和难以治愈的重要原因。IL-1能刺激GMC增生，释放活性氧，分泌胶原及含硫细胞外胶质，刺激肾小球脏层上皮细胞增生，合成胶原IV，刺激成纤维细胞，分泌胶原导制纤维化等效应；TNF-α能刺激肾小球系膜细胞分泌IL-1，IL-6，ICAM-1，PAF等，TNF-α还具有细胞毒效应引起系膜细胞和上皮细胞溶解[8]。有报道[9]IL-10能抑制系膜细胞IL-1和TNF等炎症因子的释放，因而有可能利用IL-10抑制炎症因子所致的不断放大的炎症效应，在肾小球炎症反应中发挥抗炎作用。
, 百拇医药
Fig 3 GMC TNFα mRNA of rat RT-PCR determination
Lane 1,3, 7,9: RT-PCR products of Rat GMC TNFα mRNA after adding LPS (10 μg/mL) 3,6,12,24 hours respectively [transfected with anti-G418 clone pLX(IL-10)SN]；Lane 2,4,8,10: RT-PCR products of Rat GMC TNFα mRNA after adding LPS(10 μg/mL) 3,6,12,24 hours respectively [NOT transfected with anti-G418 clone pLX(IL-10)SN]；Lane 5: Control；Lane 6: PCR marker: 1543, 994, 695, 515, 377, 237bp
, 百拇医药 图3 大鼠GMC TNFα mRNA的RT-PCR表达检测
Kitamura等[10]通过逆转录病毒载体将LACZ基因转移到体外培养的大鼠GMC然后将GMC回注肾脏，有44%～70%肾小球表达beta-galactosidase,持续4周，从而实现了外源的LACZ基因的转移和表达。这提示：在人类有可能通过肾脏活检，体外培养GMC，用逆转录病毒载体将所需外源基因转入GMC再注回肾脏，发挥外源基因的治疗作用。
本研究构建表达IL-10的逆转录病毒重组体pLX(IL-10)SN，通过转染包装细胞PA317获得对大鼠GMC的感染性，外源性IL-10基因可以转移到大鼠GMC并稳定表达，它能抑制GMC炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达，从而为今后研究通过IL-10基因转移入GMC再注回肾脏，发挥外源基因治疗肾脏疾病的作用提供了可能性。
参考文献
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1 Fiorentino DF, Bond MW, Mosmann TR, et al. Two types of mouse T helper cell IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokines production by Th1 clones. J Exp Med, 1989,170(6):2081.
2 Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF, et al. Homology of cytokine synthesis inhibitory factor to the Epstein-Barr Virus gene BCRF. Science, 1990,250(4982):830.
3 Chang CH, Furue M, Tamaki K. Selective regulation of ICAM-l and major histocompatibility complex class l and Ⅱ molecular expression on epidermal Langerhans cells by some of the cytokines released by keratinocytes and T cells. Eur J Immunol, 1994,24:2889.
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4 李锦华，陈永雄，刘军，等.表达白细胞介素10的逆转录病毒载体的构建.现代临床医学生物工程学杂志，1998，(2)：80.
5 赵志辉，高 进，王海燕，等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学学报，1989，4：335.
6 王申五，主编.基因诊断技术—非放射性操作手册.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1992.39，46，109.
7 Band L, Oudient JP, Bens M, et al. Production of tumor necrosis factor by rat mesangial cells in response to bacterial lipopolysaccharide. Kidney Int, 1989,35:1111.
8 王海燕，主编.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.481.
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9 Fouqueray B, Boutard V, Philippe C, et al. Mesangial cell-derived interleukin-10 modulates mesangial cell response to lipopolysaccharide. Am J Pathol,1995,147(1):176.
10 Masanori Kitamura, Shurley Talor, Robert Unwin, et al. Gene transfer into the rat renal glomerulus via a mesangial cell vector: site-specific delivery, in situ amplification, and sustained expression of an exogenous gene in vivo. J Clin Invest, 1994,94:497.
1998年6月15日收稿，1998年12月15日修回, 百拇医药
单位：李锦华 中山医科大学附属第一医院急诊科；余学清 陈永雄 张仕光 肾内科(广州510080)
关键词：基因；白细胞介素10；肾小球系膜；炎症；转染
白细胞介素10基因转移抑制肾小球系膜细胞诱生炎症细胞因子 摘 要 目的：通过建立白细胞介素10(IL-10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统，观察IL-10对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesengial cell, GMC)中细胞因子的产生及其基因表达的影响。方法：通过构建的重组逆转录病毒载体pLX(IL-10)SN将外源基因IL-10转移至大鼠GMC：(1)应用聚合酶链反应(PCR)，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA检测IL-10基因的整合和表达；(2)以RT-PCR观察IL-10基因转移对LPS诱导的GMC肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达的影响，以ELISA测定白细胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的蛋白质表达。结果：外源性IL-10基因已整合到靶细胞染色体DNA并有效地表达，它能抑制LPS诱生GMC过度产生IL-1β，TNF-α。结论：外源性IL-10基因可以转移到GMC并稳定表达，它能抑制GMC炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达。
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Effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines by rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro
LI Jin-Hua1, YU Xue-Qing2, CHEN Yong-Xiong2, ZHANG Shi-Guang2
1Emergency Department, 2Nephrology Department, the First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510080)
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Abstract AIM:To investigate the effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines in rat glomerular mesangial cells (GMC) induced by LPS in vitro.METHODS：We used constructed retroviral vector pLX(IL-10) SN to transfer exogenous gene interleukin 10 into rat GMC after gene transfer 72 hours, DNA and RNA were prepared from rat transfected GMC for the polymerase chain reaction (PCR) and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Expression of IL-10 in transfected GMC was checked by ELISA. RT-PCR and ELISA were performed to observe the effects of interleukin 10 gene transfer on the secretion of inflammatory cytokines in rat GMC cells induced by LPS in vitro.RESULTS：Exogenous IL-10 gene had been integrated into the chromosal DNA of the transfected GMC cells. RT-PCR and ELLSA showed that exogenous IL-10 gene was expressed in the transfected GMC after transfection 48 hours and lasting for over 28 days. Exogenous IL-10 gene transfer can inhibit the secretion of the inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α in the transfected GMC at mRNA and protein level induced by LPS.CONCLUSION：Exogenous interleukin 10 gene transfer can inhibit the secretion of inflammatory cytokines in GMC.
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MeSH Genes; Interleukin-10; Glomerular mesangium; Inflammation; Transfection
白细胞介素10(interleukin10,IL-10)由Fiorentino等于1989年首次发现[1]，最初称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor,CSIF)，后来称为IL-10，其cDNA序列中含有一个编码178个氨基酸的开放读码框架，分子量为18.7×103[2]。随后的研究发现，它能抑制Th1细胞亚群细胞因子γIFN，IL-2，TNF-α，GM-CSF，LT等的合成；抑制细胞粘附分子ICAM-1，B7的表达[3]。这些特性表明IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用。本实验通过建立在大鼠GMC表达IL-10的重组逆转录病毒载体基因转移系统，观察IL-10基因转移对LPS诱导的大鼠GMC中细胞因子IL-1和TNF-α的产生及其基因表达的影响，以探讨IL-10基因转移作为抗炎治疗手段的可能性。
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材料与方法
(一)材料：含IL-10全长cDNA(0.61kb)的逆转录病毒载体pLX(IL-10)SN由本室构建[4]；重组逆转录病毒包装细胞PA317、NIH3T3，军事医学科学院；Wistar大鼠，中山医科大学实验动物中心；PCR kit，华美公司；RT-PCR kit， Promega; Lipofection(DOTAP)，Boehringer Mannheim; Geniticin(G418)，GIBCO BRL; Lipopolysaccharide(LPS) E coli Olll:B4，Difco Laboratory; IL-10、Rat IL-1β、Rat TNF-α ELISA kit，深圳晶美公司。
(二)方法：
1.重组逆转录病毒载体的包装与重组病毒感染滴度测定：将重组载体pLX(IL-10)SN和空白载体pLXSN用DOTAP导入PA317，用G418进行筛选；以NIH3T3细胞测定重组病毒感染滴度。单位为CFU/mL(集落形成单位/毫升)。
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2.大鼠GMC的转染：按文献[5]的方法培养Wistar大鼠GMC。抗G418抗性克隆pLX(IL-10)SN和pLXSN感染大鼠GMC，120h后取GMC按文献[6]的方法提取DNA和RNA。
3.目的基因IL-10在GMC表达的检测：①PCR：引物A：5′-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3′，引物C：5′-CCTGATGGT CTCAGTTTCGTATC-3′检测目的基因IL-10在大鼠GMC的整合，产物679bp。②RT-PCR：上游引物B：5′-TCT CCG AGA TGC CTT TCA GCA GA-3′，引物C(见上)作RT-PCR检测目的基因IL-10在大鼠GMC的转录，产物418 bp。以一对引物(Sense: 5′-CAT AGA CAA GAT GGT GAA GG-3′，Anti-sense:5′-TCC ACA GTC TTC TGA GTG GC-3′)扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照，产物570 bp。 ③ELISA检测目的基因IL-10在大鼠GMC的蛋白质表达。
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4.IL-10基因转移对LPS诱导大鼠GMC分泌细胞因子的作用：将第二代培养的GMC实验分组：(1)对照组：未加LPS；(2)诱导组：加LPS(10 mg/L)；(3)转染抗G418抗性克隆pLX(IL-10)SN,72 h后加LPS(10 μg/mL)。然后分别于3、6、12、24 h收集上清液和细胞备检。①按文献[6]的方法提取总RNA。反转录后行PCR。以引物(Sense:5′-CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′,Anti-sense:5′-GTG CTT GAT CTG TTG TTT CC-3′)扩增大鼠GMC的TNFα mRNA，产物398bp。以一对引物(Sense,5′-CAT AGA CAA GAT GGT GAA GG-3′,Anti-sense 5′-GAC AAT CTT GAG GGA GTT GTC-3′扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照，产物445bp。用薄层扫描仪(CS-9000，岛津，日本)检测DNA带的含量，计算每一样品的TNFα/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。②ELISA检测GMC培养上清液各实验组IL-1β，TNFα含量。
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(三)资料统计：每个样品重复测定6次，求其均值，实验数据用
±s表示。采用计算机医用统计程序(SPSS/PC)对数据进行F及q检验。结果
(一)经NIH3T3测定，重组病毒最高感染滴度为6×108 CFU/L。
(二)目的基因在转染大鼠GMC的表达：(1)IL-10基因整合至转染的大鼠GMC DNA的PCR检测：扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染pLX(IL-10)SN载体的有特异性扩增的pLXSN(1511bp)至IL-10 cDNA的片段，为679 bp，而转染空白载体pLXSN的大鼠肾小球系膜细胞则没有(如图1所示)。(2)IL-10基因在大鼠GMC的转录产物的检测：电泳分析显示转染载体pLX(IL-10)SN有特异扩增的IL-10mRNA片段：418 bp，而转染空白载体pLXSN的大鼠GMC则没有(如图2所示)。(3)ELISA检测显示IL-10基因在pLX(IL-10)SN转染大鼠肾小球系膜细胞48 h(d 2)后开始表达，达836 ng/106 cells.24h-1，高峰在d3，为1843 ng/106 cells.24h-1。d 7\,d 14\,d 28分别为1551、1323、1255、938 ng/106 cells.24h-1。
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(三)IL-10基因转移对大鼠GMC产生IL-1β，TNF-α蛋白质含量的影响，见表1和表2。
表1 IL-10基因转移对大鼠GMC产生IL-1β的影响
Tab 1 The effect of IL-10 gene transfer on the secretion of proinflammatory
cytokine IL-1β in rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro(ng/mL) (
±s,n=6)Group
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IL-1β
3 h
6 h
12 h
24 h
Control
121.0±10.2
150.0±14.0
146.0±13.8
141.0±11.3
LPS 10 μg/mL
389.0±32.4
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554.0±38.1
887.0±30.7
845.0±23.5
IL-10 gene transfer+LPS 10 μg/mL
153.0±12.4*
172.0±15.6*
185.0±17.7*
198.0±14.9*
* P<0.05，vs LPS 10 μg/mL 表2 IL-10基因转移对大鼠GMC产生TNF-α的影响
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Tab 2 The effect of IL-10 gene transfer on the secretion of proinflammatory cytokine TNF-α
in rat glomerular mesangial cells induced by LPS in vitro(ng/mL)(
±s,n=6)Group
IL-1β
3 h
6 h
12 h
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24 h
Control
133.0±12.9
167.0±14.2
201.0±18.8
197.0±14.5
LPS 10 μg/mL
445.0±34.1
1001.0±98.3
843.0±45.4
677.0±56.2
, 百拇医药 IL-10 gene transfer+LPS 10 μg/mL
204.0±19.7*
298.0±28.9*
310.0±29.9*
223.0±21.0*
*P<0.05，vs LPS 10 μg/mL
从表1和表2可看出：①对照组，正常大鼠GMC IL-1β，TNF-α分泌量极低；②诱导组，LPS诱导IL-1β，TNF-α蛋白质的产生明显增加；诱导组与对照组相比差异有显著(P<0.05)；③IL-10基因转移+LPS 10 μg/mL组各个时点IL-1β，TNF-α的产生与诱导组相比均减少，有明显的抑制作用(P<0.05)。
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IL-10基因转移对大鼠GMC TNF-α mRNA表达的影响：对照组，正常大鼠GMC TNF-α分泌量极低，经LPS诱导后TNF-α/GAPDH于3，6，12，24 h为0.432，0.937，0.794和0.638，说明TNF-α mRNA表达显著增加，IL-10基因转移后，用LPS诱导，TNF-α/GAPDH于3，6，12，24 h为0.195，0.286，0.304和0.210，说明IL-10基因转移能显著抑制LPS诱导大鼠GMC产生TNF-α。
Fig 1 GMC DNA of transfected rat PCR determination
Lane 1: PCR marker;Lane 2: PCR product of Rat GMC DNA [transfected with pLX(IL-10)SN vector]:679bp； Lane 3： PCR product of Rat GMC DNA (transfected with pLXSN vector)
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图1 转染大鼠GMC DNA的PCR检测
Fig 2 GMC mRNA of transfected rat RT-PCR determination
Lane 1:PCR marker;Lane 2:RT-PCR product of Rat GMC mRNA [transfected with pLX(IL-10)SN vector]:418 bp; Lane 3:RT-PCR product of Rat GMC mRNA (transfected with pLXSN vector);Lane 4:Internal control:RT-PCR product of Rat GAPDH mRNA:570bp
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图2 转染大鼠GMC RNA的RT-PCR检测
讨论
GMC是肾小球内非常活跃的固有细胞，在肾小球炎症与硬化的发病过程中，它既是靶细胞，又通过多种途径成为参与者，其中通过分泌IL-1，TNF-α，ICAM-1，活性氧等是它的重要效应[7]。而细胞因子的自分泌和旁分泌作用所导致的不断放大的炎症效应是慢性肾炎持续发展和难以治愈的重要原因。IL-1能刺激GMC增生，释放活性氧，分泌胶原及含硫细胞外胶质，刺激肾小球脏层上皮细胞增生，合成胶原IV，刺激成纤维细胞，分泌胶原导制纤维化等效应；TNF-α能刺激肾小球系膜细胞分泌IL-1，IL-6，ICAM-1，PAF等，TNF-α还具有细胞毒效应引起系膜细胞和上皮细胞溶解[8]。有报道[9]IL-10能抑制系膜细胞IL-1和TNF等炎症因子的释放，因而有可能利用IL-10抑制炎症因子所致的不断放大的炎症效应，在肾小球炎症反应中发挥抗炎作用。
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Fig 3 GMC TNFα mRNA of rat RT-PCR determination
Lane 1,3, 7,9: RT-PCR products of Rat GMC TNFα mRNA after adding LPS (10 μg/mL) 3,6,12,24 hours respectively [transfected with anti-G418 clone pLX(IL-10)SN]；Lane 2,4,8,10: RT-PCR products of Rat GMC TNFα mRNA after adding LPS(10 μg/mL) 3,6,12,24 hours respectively [NOT transfected with anti-G418 clone pLX(IL-10)SN]；Lane 5: Control；Lane 6: PCR marker: 1543, 994, 695, 515, 377, 237bp
, 百拇医药 图3 大鼠GMC TNFα mRNA的RT-PCR表达检测
Kitamura等[10]通过逆转录病毒载体将LACZ基因转移到体外培养的大鼠GMC然后将GMC回注肾脏，有44%～70%肾小球表达beta-galactosidase,持续4周，从而实现了外源的LACZ基因的转移和表达。这提示：在人类有可能通过肾脏活检，体外培养GMC，用逆转录病毒载体将所需外源基因转入GMC再注回肾脏，发挥外源基因的治疗作用。
本研究构建表达IL-10的逆转录病毒重组体pLX(IL-10)SN，通过转染包装细胞PA317获得对大鼠GMC的感染性，外源性IL-10基因可以转移到大鼠GMC并稳定表达，它能抑制GMC炎症效应中细胞因子的产生及其基因表达，从而为今后研究通过IL-10基因转移入GMC再注回肾脏，发挥外源基因治疗肾脏疾病的作用提供了可能性。
参考文献
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10 Masanori Kitamura, Shurley Talor, Robert Unwin, et al. Gene transfer into the rat renal glomerulus via a mesangial cell vector: site-specific delivery, in situ amplification, and sustained expression of an exogenous gene in vivo. J Clin Invest, 1994,94:497.
1998年6月15日收稿，1998年12月15日修回, 百拇医药