伤寒沙门氏菌肠毒素基因突变株的构建
作者：李铁民 江崎孝行
单位：李铁民：辽宁大学生物系微生物学教研室(沈阳，110036)；江崎孝行：日本岐阜大学医学部微生物学教研室
关键词：伤寒沙门氏菌；肠毒素基因；自杀质粒；同源重组
中国人兽共患病杂志990504 摘 要 目的 为探讨伤寒沙门氏菌肠毒素的致病机理。方法 根据已知的鼠伤寒沙门氏菌的肠毒素基因序列，设计 PCR 引物，扩增并克隆了伤寒沙门氏菌的肠毒素结构基因。双酶切造成部分序列缺失，亚克隆于自杀质粒后，通过电穿孔转化，同源重组替换野生型肠毒素基因。结果 PCR 及序列分析证实，缺失突变株的肠毒素基因缺失403个碱基。经血清学鉴定，该突变株保持母系菌株的 Vi 抗原表型。 结论 该突变株的构建为研究肠毒素基因在至于致病机制中的作用奠定了基础。
MUTANT CONSTRUCTION OF SALMONELLA TYPHI ENTEROTOXIN GENE
, http://www.100md.com
Li Tiemin1 Takayuke Ezaki2
(1Department of Biology,Liaoning University,Shenyang 110036.
2 Department of Microbiology,Gifu University School of medicine,Japan)
ABSTRACT Aim Mutant of S.typhi enterotoxin gene was constructed to understand the pathogenic mechanisms of enterotoxin from S.typhi.Methods The structure gene of S.typhi was amplified and cloned by PCR with the primers derived from S.typhimurium.Some of the bases were deleted by double digestion.Wild type gene was replaced through homologous recombination with a suicide vector containing the deleted gene.Results A 403 bp deletion of the enterotoxin gene was confirmed by PCR and sequencing analysis.The Vi antigen phenotype of the mutant did not change in contrast to wild strain with serological method. Conclusion The construction of mutant of S.typhi lays a fundation for the study of pathogenic mechanism of enterotoxin gene.
, 百拇医药
KEY WORDS Salmonella typhi Enterotoxin Gene Suicide Vector Homologous Recombination
伤寒沙门氏菌 (S.typhi) 是引起人类伤寒病的革兰氏阴性肠杆菌。现已发现多种与伤寒沙门氏菌感染有关的毒力因子[1，2]，肠毒素是其毒力因子之一。它具有和典型的霍乱毒素(CT)相似的生物学活性[3]。克隆的鼠伤寒沙门氏菌肠毒素基因的研究表明，虽然该肠毒素蛋白分子能被CT抗血清中和但在结构上不同于 CT[4]。新近的报道表明，鼠伤寒沙门氏菌与上皮细胞接触增强诱导肠毒素基因表达[5]。然而，在伤寒沙门氏菌感染中宿主细胞如何应答肠毒素尚不清楚，为此，本研究首先构建了伤寒沙门氏菌肠毒素基因突变株。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 菌株和质粒 研究中使用的菌株和质粒(见表1)伤寒沙门氏菌生长在 SOB 平板上，37℃、5%CO2 条件下培养。大肠杆菌生长在LB平板或肉汤中，37℃条件下培养。
1.2 肠毒素基因片段的 PCR 扩增 由于伤寒沙门氏菌肠毒素基因尚未发表，所以，我们根据已知的鼠伤寒沙门氏菌肠毒素基因序列设计 PCR 引物[3]。常规方法提取出发菌 (Gifu10007) 菌体 DNA，PCR 扩增肠毒素基因片段。设计的 PCR 引物序列的上游引物为：5′ TGA GCG CTT TAA TCT CCT TC 3′;下游引物为：5′ TTA CTG GCG TTT TTT TGG CA 3′。PCR 反应条件为，变性94℃3Os；煺火55℃3Os；链延伸72℃6Os，扩增反应为30个循环，最后72℃ 7min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR 产物克隆到PGEM-T EASY载体上。
, 百拇医药
表1本研究使用的菌株和质粒
Table 1.Bacterial strains and plasmids used in this study Strains or plasmids
菌株或质粒
Description
特性描述
Source or reference
来源或文献
S.typhi
.
.
, 百拇医药 GIFU 10007
wild type,Vi(+)
7,8
GIFU 10388
mutant fom GIFU 10007,Vi(-)
7,8
GIFU 3p345
GIFU 10007 carrying enterotoxin deletion mutatio
This study
GIFU 3p346
, 百拇医药 GIFU 10388 carrying enterotoxin deletion mutatio
This study
E.coli
.
.
XL1-blue
host strain for pGEM-T Easy vector
Promega
SY 327 λpir
host strain for suicide vector
, http://www.100md.com
9
Plasmids
.
.
pGEM-T Easy
cloning vector for PCR product
Promeha
pKNG101
suicide vector,oriR6K,strAB,sacBR
10,11
pGBM151
, http://www.100md.com
suicide vector,ampicillin gene(bla)cassette
.
.
inserted in XbaI site of pKNG101
This tudy
pGBM571
pGEM-T Easy derivative carrying 975bp
.
.
enterotoxin gene
, 百拇医药
This study
pGBM573
403bp enterotoxin gene was deleted from
.
.
pGBM571
This study
pGBM574
deleted enterotoxin gene from pGBM573 was
.
.
, http://www.100md.com
cloned in pGBM151
This study
1.3 重组质粒构建 质粒提取、酶切、DNA 片段连接以及转化按常规方法[6]或按产品推荐的条件进行。构建过程见图1。
图1 自杀质粒 pGBM 574 的构建
Fig.1 Construction of suicide plasmid pGBM 574
1.4 DNA 序列测定 采用 Dye Primer 法，按产品推荐的条件进行操作。
1.5 野生型伤寒沙门氏菌肠毒素基因的替换 重组质粒pGBM574通过电穿孔方法(电压为2.4kV/0.4cm)引入到 Gifu10007 和 Gifu10388菌株中。首先在氨苄青霉素和链霉素平板上筛选抗性菌落，SOB 肉汤增殖抗性菌落后，在5%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，最后，通过PCR扩增反应鉴定肠毒素基因突变株。
, 百拇医药
1.6 试剂与仪器 PCR引物由日本理科研株式会社合成，PCR试剂盒购自Pharmacia Biotech 公司，限制性核酸内切酶 Stu1、Bal1、Apa1 和 Sal1 以及 T4 DNA 连接酶购自日本宝酒造株式会社，DNA 扩增仪为 PE 产品，电穿孔仪为 Boi-Rad 产品，DNA 测序仪及测序试剂盒均为美国 ABI 产品。
2 结果
2.1 肠毒素基因的缺失和鉴定 肠毒素基因全序列由1333bp 组成，我们选择克隆了975bp 的结构基因作为靶序列。克隆的肠毒素基因序列分别用限制性内切酶 Stu1 和 Bal1 酶切473和876位点，琼脂糖凝胶电泳分离最大的 DNA 酶切片段，经纯化、连接和转化，得到缺失的质粒PGBM573(见图2，B和C泳道)。为了进一步证实克隆的肠毒素基因缺失，我们对缺失后的基因片段进行核苷酸序列的测定。经 DNAsis 软件分析，结果表明，403bp的 Stu1-Bal1 双酶切片段已被去除(见图3)。
, 百拇医药
图2 肠毒素基因片段的克隆及缺失质粒的鉴定
Fig.2 Cloning of enterotoxin gene fragment and determination of deleted plasmid
Lane A.Circulated pGEM-T Easy vector.Lane B and C.Recombinant plasmid carrying deleted enterotoxin gene fragment on pGEM-T Easy.Lane D.Recombinant plasmid carrying enterotoxin gene fragment on pGEM-T Easy.
图3野生型肠毒素基因和缺失基因的序列比较
Fig.3 Comparison between enterotoxin gene from S.typhimurium and the deleted gene from S.typhi.
, 百拇医药
The underlined sequences are primer areas for PCR.The“-”represents the deleted fragment.The numbers are from published sequence
2.2 缺失的肠毒素基因亚克隆 pKNG101是近年构建的自杀质粒，它具有在伤寒沙门氏菌中不增殖的特点，所以，在有同源序列存在的情况下，便于发生重组。由于伤寒沙门氏菌 Gifu10007 和 Gifu10388 是链霉素抗性的，而 pKNG101只含链霉素抗性选择基因，所以我们通过引入氨苄青霉素基因得到改建后的自杀质粒pGBM151(见图1)。pGBM573 和自杀质粒pGBM151分别经限制性内切酶 Sal1 和 Apa1 酶切，纯化后，经连接、转化，从而得重组质粒pGBM574。
, 百拇医药
2.3 肠毒素基因突变株的建立 为了使缺失的肠毒素基因片段在野生型菌株中经同源重组替换野生型肠毒素基因，我们采用高效的电穿孔转化方法，将质粒pGBM574引入到野生菌株中，接着通过两步筛选法得缺失突变株。生长在含有氨苄青霉素和链霉素平板上的菌落是染色体含有野生型肠毒素基因和缺失的肠毒素基因的单重组菌株(图4，C泳道)，该菌株经增殖后，生长在5%蔗糖平板上的菌落为双重组菌株(图4，D和E泳道)。本实验最终经PCR扩增鉴定筛选到两株肠毒素基因缺失突变株，分别定名为3P345和3P346。经血清学鉴定两突变株的 Vi 抗原表型均未发生改变。
图4 PCR 鉴定肠毒素基因突变株
Fig.4 Confirmation of enterotoxin gene mutant by PCR
Lane A and F.100bp DNA ladder marker.Lane B.Amplicon from wild type S.typhi.
, 百拇医药
Lane C.Amplicon from single crossover strain.Lane D and E.Amplecon from enterotoxin gene deletion mutant strain.
3 讨 论
伤寒沙门氏菌作为一种胞内寄生菌，其致病机制尚不十分清楚。虽然对鼠伤寒沙门氏菌的致病机制研究的较多，但由于两者的宿主特异性不同，而且尚未找到用于研究伤寒沙门氏菌的合适动物模型，所以给其致病机制的研究带来了一定困难。尽管如此，一些研究者应用组织培养方法对伤寒沙门氏菌的致病性进行了多方面研究。
据研究表明，侵袭性和胞内存活是伤寒沙门氏菌病性的两个重要环节，在某些毒力方面相似于鼠伤寒沙门氏菌[1，2]。Yabuuchi 等人的研究表明，伤寒沙门氏菌是高侵袭的，而且是需活菌的主动侵袭过程[7]。我们最近的研究表明，伤寒沙门氏菌的 Vi 抗原与其胞内存活有关[1，3]。
, 百拇医药
Dinjus 等人实验发现，鼠伤寒沙门氏菌接触培养的上皮细胞增强肠毒素产生[1，4]。新近他们证实该菌与上皮细胞接触后增强诱导肠毒素基因的表达[5]。然而，伤寒沙门氏菌肠毒素在其致病性中的作用尚不清楚，为此，我们构建了该菌株的肠毒素基因突变型。该突变株的构建将为我们研究肠毒素对宿主细胞的功能影响奠定基础。对该突变株研究的初步实验结果表明，肠毒素对伤寒沙门氏菌的胞内存活没有影响，但它在细胞水平上如何影响宿主细胞的功能，我们正在研究之中。
4 参考文献
1.Chen LM,et al.Salmonella spp.are cytotoxic for cultured macrophages.Mol microbiol,1996,21:1101.
2.Finly BB,et al.Common theme in microbial pathogenicity revisited.Microbiol Mol Biol Rev,1997,61:136.
, 百拇医药
3.Chary P,et al.Localization of the enterotoxin gene from salmonella typhimurium and characterization of the gene product.FEMS Microbiol Lett,1993,111:87.
4.Chopra AK,et al.Molecular characterization of an enterotoxin from salmonella typhimurium.Microbiol Pathogenesis,1994,16:85.
5.Dinjus U,et al.Detection of the induction of salmonella enterotoxin gene expression by contact with epithelial cells with RT-PCR.FEMS microbiol Lett,1997,146:175.
, 百拇医药
6.Sambrook J,et al.Molecular cloning,A laboratory mannual,2nd.New York.CSH press,1878,1～21.
7.Yabuuchi E,et al.Invasiveness of salmonlla typhi strains in HeLa S3 monolayer cells.Microbiol Immunol,1986,30:1213.
8.Hashimoto Y,et al.Complete nucleotide sequence and molecular characterization of ViaB region encoding Vi antigen in salmonella typhi.J Bacteriol,1993,175:4456.
9.Miller VL,et al.A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutation:osmoregulation of other membrane proteins and virulence determinants in vibrio cholerae requires tox R.J Bacteriol,1988,170:2575.
, http://www.100md.com
10.Kaniga K,et al.A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetic in Gram-negative bacteria:inactivation of blaA gene of Yersinia enterocolitica.Gene,1991,109:137.
11.Sarker MR,et al.An improved version of pKNG101 for gene replacement in Gram-negative bacteria.Mol Microbiol,1997,23:409.
12.Mills SD,et al.Comparison of salmonella typhi and salmonella typhimurium invasion,intracellular growth and localization in cultured human epithelial cells.Microbiol Pathogenesis,1994,17:409.
, 百拇医药
13.Hirose K,et al.Survival of Vi-capsulated and Vi-deleted salmonella typhi strains in cultured macrophage expressing different levels of CD14 antigen.FEMS Microliol Lett,1997,147:295.
14.Dinjus U,et al.Cultivation of salmonella in contact with epithelial cells.Microbiol Res,1995,150:99.
1999年1月18日收稿 1999年4月20日修回, 百拇医药
单位：李铁民：辽宁大学生物系微生物学教研室(沈阳，110036)；江崎孝行：日本岐阜大学医学部微生物学教研室
关键词：伤寒沙门氏菌；肠毒素基因；自杀质粒；同源重组
中国人兽共患病杂志990504 摘 要 目的 为探讨伤寒沙门氏菌肠毒素的致病机理。方法 根据已知的鼠伤寒沙门氏菌的肠毒素基因序列，设计 PCR 引物，扩增并克隆了伤寒沙门氏菌的肠毒素结构基因。双酶切造成部分序列缺失，亚克隆于自杀质粒后，通过电穿孔转化，同源重组替换野生型肠毒素基因。结果 PCR 及序列分析证实，缺失突变株的肠毒素基因缺失403个碱基。经血清学鉴定，该突变株保持母系菌株的 Vi 抗原表型。 结论 该突变株的构建为研究肠毒素基因在至于致病机制中的作用奠定了基础。
MUTANT CONSTRUCTION OF SALMONELLA TYPHI ENTEROTOXIN GENE
, http://www.100md.com
Li Tiemin1 Takayuke Ezaki2
(1Department of Biology,Liaoning University,Shenyang 110036.
2 Department of Microbiology,Gifu University School of medicine,Japan)
ABSTRACT Aim Mutant of S.typhi enterotoxin gene was constructed to understand the pathogenic mechanisms of enterotoxin from S.typhi.Methods The structure gene of S.typhi was amplified and cloned by PCR with the primers derived from S.typhimurium.Some of the bases were deleted by double digestion.Wild type gene was replaced through homologous recombination with a suicide vector containing the deleted gene.Results A 403 bp deletion of the enterotoxin gene was confirmed by PCR and sequencing analysis.The Vi antigen phenotype of the mutant did not change in contrast to wild strain with serological method. Conclusion The construction of mutant of S.typhi lays a fundation for the study of pathogenic mechanism of enterotoxin gene.
, 百拇医药
KEY WORDS Salmonella typhi Enterotoxin Gene Suicide Vector Homologous Recombination
伤寒沙门氏菌 (S.typhi) 是引起人类伤寒病的革兰氏阴性肠杆菌。现已发现多种与伤寒沙门氏菌感染有关的毒力因子[1，2]，肠毒素是其毒力因子之一。它具有和典型的霍乱毒素(CT)相似的生物学活性[3]。克隆的鼠伤寒沙门氏菌肠毒素基因的研究表明，虽然该肠毒素蛋白分子能被CT抗血清中和但在结构上不同于 CT[4]。新近的报道表明，鼠伤寒沙门氏菌与上皮细胞接触增强诱导肠毒素基因表达[5]。然而，在伤寒沙门氏菌感染中宿主细胞如何应答肠毒素尚不清楚，为此，本研究首先构建了伤寒沙门氏菌肠毒素基因突变株。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 菌株和质粒 研究中使用的菌株和质粒(见表1)伤寒沙门氏菌生长在 SOB 平板上，37℃、5%CO2 条件下培养。大肠杆菌生长在LB平板或肉汤中，37℃条件下培养。
1.2 肠毒素基因片段的 PCR 扩增 由于伤寒沙门氏菌肠毒素基因尚未发表，所以，我们根据已知的鼠伤寒沙门氏菌肠毒素基因序列设计 PCR 引物[3]。常规方法提取出发菌 (Gifu10007) 菌体 DNA，PCR 扩增肠毒素基因片段。设计的 PCR 引物序列的上游引物为：5′ TGA GCG CTT TAA TCT CCT TC 3′;下游引物为：5′ TTA CTG GCG TTT TTT TGG CA 3′。PCR 反应条件为，变性94℃3Os；煺火55℃3Os；链延伸72℃6Os，扩增反应为30个循环，最后72℃ 7min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR 产物克隆到PGEM-T EASY载体上。
, 百拇医药
表1本研究使用的菌株和质粒
Table 1.Bacterial strains and plasmids used in this study Strains or plasmids
菌株或质粒
Description
特性描述
Source or reference
来源或文献
S.typhi
.
.
, 百拇医药 GIFU 10007
wild type,Vi(+)
7,8
GIFU 10388
mutant fom GIFU 10007,Vi(-)
7,8
GIFU 3p345
GIFU 10007 carrying enterotoxin deletion mutatio
This study
GIFU 3p346
, 百拇医药 GIFU 10388 carrying enterotoxin deletion mutatio
This study
E.coli
.
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XL1-blue
host strain for pGEM-T Easy vector
Promega
SY 327 λpir
host strain for suicide vector
, http://www.100md.com
9
Plasmids
.
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pGEM-T Easy
cloning vector for PCR product
Promeha
pKNG101
suicide vector,oriR6K,strAB,sacBR
10,11
pGBM151
, http://www.100md.com
suicide vector,ampicillin gene(bla)cassette
.
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inserted in XbaI site of pKNG101
This tudy
pGBM571
pGEM-T Easy derivative carrying 975bp
.
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enterotoxin gene
, 百拇医药
This study
pGBM573
403bp enterotoxin gene was deleted from
.
.
pGBM571
This study
pGBM574
deleted enterotoxin gene from pGBM573 was
.
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, http://www.100md.com
cloned in pGBM151
This study
1.3 重组质粒构建 质粒提取、酶切、DNA 片段连接以及转化按常规方法[6]或按产品推荐的条件进行。构建过程见图1。
图1 自杀质粒 pGBM 574 的构建
Fig.1 Construction of suicide plasmid pGBM 574
1.4 DNA 序列测定 采用 Dye Primer 法，按产品推荐的条件进行操作。
1.5 野生型伤寒沙门氏菌肠毒素基因的替换 重组质粒pGBM574通过电穿孔方法(电压为2.4kV/0.4cm)引入到 Gifu10007 和 Gifu10388菌株中。首先在氨苄青霉素和链霉素平板上筛选抗性菌落，SOB 肉汤增殖抗性菌落后，在5%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，最后，通过PCR扩增反应鉴定肠毒素基因突变株。
, 百拇医药
1.6 试剂与仪器 PCR引物由日本理科研株式会社合成，PCR试剂盒购自Pharmacia Biotech 公司，限制性核酸内切酶 Stu1、Bal1、Apa1 和 Sal1 以及 T4 DNA 连接酶购自日本宝酒造株式会社，DNA 扩增仪为 PE 产品，电穿孔仪为 Boi-Rad 产品，DNA 测序仪及测序试剂盒均为美国 ABI 产品。
2 结果
2.1 肠毒素基因的缺失和鉴定 肠毒素基因全序列由1333bp 组成，我们选择克隆了975bp 的结构基因作为靶序列。克隆的肠毒素基因序列分别用限制性内切酶 Stu1 和 Bal1 酶切473和876位点，琼脂糖凝胶电泳分离最大的 DNA 酶切片段，经纯化、连接和转化，得到缺失的质粒PGBM573(见图2，B和C泳道)。为了进一步证实克隆的肠毒素基因缺失，我们对缺失后的基因片段进行核苷酸序列的测定。经 DNAsis 软件分析，结果表明，403bp的 Stu1-Bal1 双酶切片段已被去除(见图3)。
, 百拇医药
图2 肠毒素基因片段的克隆及缺失质粒的鉴定
Fig.2 Cloning of enterotoxin gene fragment and determination of deleted plasmid
Lane A.Circulated pGEM-T Easy vector.Lane B and C.Recombinant plasmid carrying deleted enterotoxin gene fragment on pGEM-T Easy.Lane D.Recombinant plasmid carrying enterotoxin gene fragment on pGEM-T Easy.
图3野生型肠毒素基因和缺失基因的序列比较
Fig.3 Comparison between enterotoxin gene from S.typhimurium and the deleted gene from S.typhi.
, 百拇医药
The underlined sequences are primer areas for PCR.The“-”represents the deleted fragment.The numbers are from published sequence
2.2 缺失的肠毒素基因亚克隆 pKNG101是近年构建的自杀质粒，它具有在伤寒沙门氏菌中不增殖的特点，所以，在有同源序列存在的情况下，便于发生重组。由于伤寒沙门氏菌 Gifu10007 和 Gifu10388 是链霉素抗性的，而 pKNG101只含链霉素抗性选择基因，所以我们通过引入氨苄青霉素基因得到改建后的自杀质粒pGBM151(见图1)。pGBM573 和自杀质粒pGBM151分别经限制性内切酶 Sal1 和 Apa1 酶切，纯化后，经连接、转化，从而得重组质粒pGBM574。
, 百拇医药
2.3 肠毒素基因突变株的建立 为了使缺失的肠毒素基因片段在野生型菌株中经同源重组替换野生型肠毒素基因，我们采用高效的电穿孔转化方法，将质粒pGBM574引入到野生菌株中，接着通过两步筛选法得缺失突变株。生长在含有氨苄青霉素和链霉素平板上的菌落是染色体含有野生型肠毒素基因和缺失的肠毒素基因的单重组菌株(图4，C泳道)，该菌株经增殖后，生长在5%蔗糖平板上的菌落为双重组菌株(图4，D和E泳道)。本实验最终经PCR扩增鉴定筛选到两株肠毒素基因缺失突变株，分别定名为3P345和3P346。经血清学鉴定两突变株的 Vi 抗原表型均未发生改变。
图4 PCR 鉴定肠毒素基因突变株
Fig.4 Confirmation of enterotoxin gene mutant by PCR
Lane A and F.100bp DNA ladder marker.Lane B.Amplicon from wild type S.typhi.
, 百拇医药
Lane C.Amplicon from single crossover strain.Lane D and E.Amplecon from enterotoxin gene deletion mutant strain.
3 讨 论
伤寒沙门氏菌作为一种胞内寄生菌，其致病机制尚不十分清楚。虽然对鼠伤寒沙门氏菌的致病机制研究的较多，但由于两者的宿主特异性不同，而且尚未找到用于研究伤寒沙门氏菌的合适动物模型，所以给其致病机制的研究带来了一定困难。尽管如此，一些研究者应用组织培养方法对伤寒沙门氏菌的致病性进行了多方面研究。
据研究表明，侵袭性和胞内存活是伤寒沙门氏菌病性的两个重要环节，在某些毒力方面相似于鼠伤寒沙门氏菌[1，2]。Yabuuchi 等人的研究表明，伤寒沙门氏菌是高侵袭的，而且是需活菌的主动侵袭过程[7]。我们最近的研究表明，伤寒沙门氏菌的 Vi 抗原与其胞内存活有关[1，3]。
, 百拇医药
Dinjus 等人实验发现，鼠伤寒沙门氏菌接触培养的上皮细胞增强肠毒素产生[1，4]。新近他们证实该菌与上皮细胞接触后增强诱导肠毒素基因的表达[5]。然而，伤寒沙门氏菌肠毒素在其致病性中的作用尚不清楚，为此，我们构建了该菌株的肠毒素基因突变型。该突变株的构建将为我们研究肠毒素对宿主细胞的功能影响奠定基础。对该突变株研究的初步实验结果表明，肠毒素对伤寒沙门氏菌的胞内存活没有影响，但它在细胞水平上如何影响宿主细胞的功能，我们正在研究之中。
4 参考文献
1.Chen LM,et al.Salmonella spp.are cytotoxic for cultured macrophages.Mol microbiol,1996,21:1101.
2.Finly BB,et al.Common theme in microbial pathogenicity revisited.Microbiol Mol Biol Rev,1997,61:136.
, 百拇医药
3.Chary P,et al.Localization of the enterotoxin gene from salmonella typhimurium and characterization of the gene product.FEMS Microbiol Lett,1993,111:87.
4.Chopra AK,et al.Molecular characterization of an enterotoxin from salmonella typhimurium.Microbiol Pathogenesis,1994,16:85.
5.Dinjus U,et al.Detection of the induction of salmonella enterotoxin gene expression by contact with epithelial cells with RT-PCR.FEMS microbiol Lett,1997,146:175.
, 百拇医药
6.Sambrook J,et al.Molecular cloning,A laboratory mannual,2nd.New York.CSH press,1878,1～21.
7.Yabuuchi E,et al.Invasiveness of salmonlla typhi strains in HeLa S3 monolayer cells.Microbiol Immunol,1986,30:1213.
8.Hashimoto Y,et al.Complete nucleotide sequence and molecular characterization of ViaB region encoding Vi antigen in salmonella typhi.J Bacteriol,1993,175:4456.
9.Miller VL,et al.A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutation:osmoregulation of other membrane proteins and virulence determinants in vibrio cholerae requires tox R.J Bacteriol,1988,170:2575.
, http://www.100md.com
10.Kaniga K,et al.A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetic in Gram-negative bacteria:inactivation of blaA gene of Yersinia enterocolitica.Gene,1991,109:137.
11.Sarker MR,et al.An improved version of pKNG101 for gene replacement in Gram-negative bacteria.Mol Microbiol,1997,23:409.
12.Mills SD,et al.Comparison of salmonella typhi and salmonella typhimurium invasion,intracellular growth and localization in cultured human epithelial cells.Microbiol Pathogenesis,1994,17:409.
, 百拇医药
13.Hirose K,et al.Survival of Vi-capsulated and Vi-deleted salmonella typhi strains in cultured macrophage expressing different levels of CD14 antigen.FEMS Microliol Lett,1997,147:295.
14.Dinjus U,et al.Cultivation of salmonella in contact with epithelial cells.Microbiol Res,1995,150:99.
1999年1月18日收稿 1999年4月20日修回, 百拇医药