反相高效液相色谱法测定血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度
作者：吴闯 杨正鸿 林贵业* 陆泰远*
单位：广西医科大学第一附属医院 南宁530027
关键词：甲氨蝶呤；反相高效液相色谱法；药物浓度
中国医院药学杂志990508 摘要 目的:建立测定血浆和脑脊液中甲氨蝶呤的反相高效液相色谱方法。方法:采用ODS不锈钢柱，流动相：甲醇∶0.025 mol.L-1磷酸盐缓冲液(21∶79，pH6.70)，检测波长：306 nm，样品经沉淀蛋白质后直接进样。结果:血浆和脑脊液样品回收率分别为97.5%±4.1%和100.8%±1.5%，日内和日间误差(RSD)均<7%，最低检测浓度4.75×10-8 mol.L-1，血浆中在1.10×10-7～2.2×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.76×10-4 mol.L-1；脑脊液中在1.10×10-7～2.20×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.10×10-3 mol.L-1浓度范围内有良好线性关系，r=0.999 6～0.999 9。结论:本法简便、准确、灵敏。
, 百拇医药
Determination of methotrexate level in plasma and cereberospinal fluid by HPLC
Wu Chuang,Yang Zhenhong,Lin Guiyi,et al(The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530027)
ABSTRACT OBJECTIVE:To establish an HPLC method for the determination of methotrexate level in plasma and cereberospinal fluid (CSF).METHODS:The separation was performed in a Shim-pack CLC-C18 column (15cm×6.0mm ID) with a mobile phase of methanol:0.025 mol.L-1,phosphate buffer (21∶79,pH6.70) and determinated at 306 nm.RESULTS:The measurable lowest concentration was 4.75×10-8 mol.L-1.The good linear relationship between peak and methotrexate concentration in plasma and in CFS was found.The experiment showed that the recovery from plasma and CSF were 97.5%±4.1% and 100.8%±1.5%,respectively.The RSD(%) of within day and between-day were less than 7%.CONCLUSIONS:The method is simple,accurate.
, 百拇医药
KEY WORDS methotrexate,HPLC,drug concentration
甲氨蝶呤(Methotrexate,简称MTX)为叶酸类抗肿瘤药，目前临床采用大剂量MTX，并用甲酰四氢叶酸钙(Calcium Folinate,简称CF)解救治疗法，MTX用量较常用量大数10倍，对非常增殖细胞特别是肝细胞有直接毒性作用[1]。MTX血药浓度与毒性有密切关系[2.3]，进行血药浓度监测非常必要，国内未见反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定脑脊液中MTX浓度的报道。本文应用RP-HPLC法，同时测定血浆和脑脊液中MTX浓度，指导临床安全有效用药，避免了毒性反应的发生。
1 仪器与试剂
日本岛津HPLC系统，包括LC-6A双泵、SPD-6A检测器、SCL-6B系统控制器、CR-4A数据处理机；LGR16-W型高速离心机(北京医用离心机厂)；MTX对照品(由广西药检所提供)；甲醇优级纯(北京化工厂生产)；其余试剂为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Shimpack CLC-ODS(0.6 mm ID×150mm)柱，可换芯C18保护柱(大连化学物理研究所)，流动相甲醇：0.025 mol.L-1磷酸缓冲液(21∶79，pH6.70)，流速1.0 ml.min-1，柱温40℃，检测波长306 nm。
2.2 色谱行为 空白血浆、脑脊液以及MTX和其代谢物的色谱图见图1，2。MTX保留时间为10.20 min，MTX代谢物为12.03 min，两峰均显为对称，陡尖，分离良好，不受血浆和脑脊液杂峰干扰。
图 1 血浆样品色谱图
a：空白血浆；b：空白血浆+MTX；c：用MTX后病人血浆
, 百拇医药
1，2：血浆杂峰；3：MTX；4：MTX代谢物峰
图 2 脑脊液样品色谱图
a空白血浆；b空白脑脊液+MTX；c鞘注MTX后病人脑脊液
1，2杂峰；3MTX；4MTX代谢物
2.3 样品预处理
2.3.1 血浆样品 取肝素抗凝的血浆0.25 ml，逐滴加入10%高氯酸溶液40 μl，置旋涡振荡器边振边加，然后离心10 min(10 000 r.min-1)。上清液加2 mol.L-1氢氧化钠溶液5 μl，混匀后进样40 μl。
2.3.2 脑脊液样品 取脑脊液0.5 ml，直接离心10 min(10000 r.min-1)，上清液进样40 μl。
, 百拇医药
2.4 标准曲线
2.4.1 血浆样品 取空白肝素抗凝血浆0.25 ml，准确加入一系列的MTX对照品，使配成(1.10，2.20，11，22，110，220，660，1 100，1 760)×10-7mol.L-19种浓度，照样品预处理操作。结果在1.10×10-7～2.20×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.76×10-3 mol.L-1两范围内呈良好线性关系，r=0.999 9。
2.4.2 脑脊液样品 取空白脑脊液0.5 ml，精确加入一系列MTX对照样品，配成(1.10，2.20，11，22，110，220，660，1 100，1 760，3 301，11 002)×10-7 mol.L-111种浓度，照样品预处理操作。结果在1.10×10-7～2.20×10-7 mol.L-1和2.20×10-6～1.10×10-3 mol.L-1两范围内呈良好线性关系，r=0.999 1和0.999 7。
, 百拇医药
2.5 计算 外标法，以峰高计算。
2.6 方法回收率 在标准曲线范围内，选择平均分布的6～7个浓度考查回收率。结果，血浆样品在(1.54，6.60，15.4，110，440，1 540)×10-7 mol.L-16个浓度的平均方法回收率为97.5%±4.1%(n=4)，脑脊液样品在(1.54，6.60，15.4，66.0，440，2 200，8 800)×10-7 mol.L-17个浓度的平均方法回收率为100.8%±1.5%(n=4)。
2.7 日内、日间误差试验 在标准曲线范围内，选择平均分布的6～7个浓度，每个浓度平行测量4次，结果见表1，2。
表1 血浆样品误差试验 加入量
, 百拇医药 日内误差(n=4)
日间误差(n=4)
×10-7 mol.L-1
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
%
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
, 百拇医药
%
1.54
1.52±0.02
1.3
1.59±0.09
5.7
6.60
6.89±0.22
3.2
6.54±0.33
5.0
15.4
14.1±0.04
, 百拇医药
2.8
14.9±0.6
3.9
110
111±2
2.3
107±6
5.4
440
425±10
2.3
398±26
6.6
, http://www.100md.com
1540
1546±43
3.0
1513±46
3.0
表1显示，血浆样品日内误差<3.2%，日间误差<6.7%。表2显示，脑脊液样品日内误差<7.0%，日间误差<6.5%。表2 脑脊液样品误差试验 加入量
日内误差(n=4)
日间误差(n=4)
×10-7 mol.L-1
测定值
, 百拇医药
×10-7 mol.L-1
RSD
%
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
%
1.54
1.56±0.06
3.8
1.53±0.03
, 百拇医药
1.2
6.60
6.54±0.24
3.7
6.56±0.22
3.4
15.4
15.4±0.5
3.3
15.5±0.4
2.4
66.0
69.5±2.7
, 百拇医药
3.8
67.0±3.9
5.8
440
450±31
6.9
452±28
6.3
2200
215±75
3.5
2260±146
6.5
, http://www.100md.com
8800
8754±225
2.6
8742±258
3.0
2.8 干扰实验 MTX大剂量冲击疗法中，常用的药有地塞米松和阿糖胞苷，前者出峰时间7 min，后者12 min，对测定无干扰。
2.9 灵敏度 当S/N=2，最低检测限为0.862 ng，最低检测浓度4.75×10-8 mol.L-1。3 临床应用
12例急性淋巴细胞白血病患者，给药方法为MTX 3 g.m-2，先给总量的1/5～1/3，静脉快速滴注30 min，剩余量持续静脉滴注12 h。滴毕后2 h，又于鞘内注入MTX 15 mg.m-2，地塞米松5 mg，阿糖胞苷50 mg。给MTX后28 h(即滴毕MTX15.5 h)，开始用CF解救，首剂30 mg.m-2肌内注射，以后每8 h一次，每次15 mg.m-2，共8～10次。12名患者血浆中的MTX浓度，静脉滴注MTX后0 h为8.9±4.2×10-8 mol.L-1，2 h为2.9±1.5×10-5 mol.L-1，5 h为1.0±0.7×10-5 mol.L-1，24 h(给MTX后36 h，即CF解救后8 h)为1.6±3.0×10-6 mol.L-1，48 h4.0±0.9×10-7 mol.L-1，72 h1.6±2.9×10-7 mol.L-1。脑脊液MTX浓度，鞘注后为6.2±3.0×10-4 mol.L-1。
, 百拇医药
4 讨论
4.1 控制基线漂移 MTX不溶于甲醇和乙腈，故甲醇和乙腈不能做为蛋白质沉淀剂，用三氯醋酸则血浆杂峰较多。用高氯酸杂物峰少，但可引起基线漂移，经氢氧化钠调节pH值后，基线漂移可得到明显改善。
4.2 标准曲线处理 MTX大剂量的冲击疗法，样品高低浓度相差甚大，标准曲线范围要求太宽，只有将标准曲线分为两段处理后，才可减少测定误差。
4.3 代谢峰的出现 本实验条件下，病人血浆和脑脊液的MTX峰后，均有一代谢峰出现。据文献[5]报道，MTX代谢物主要为7-OH MTX，此峰是否就是7-OH MTX，有待进一步研究。
4.4 临床应用结果 MTX的有效浓度为10-5～10-4 mol.L-1[5]，本组病例在滴毕5 h内MTX血浆浓度仍在此范围，CF解救后立即降至安全范围，达到解救目的。
, 百拇医药
* 广西桂林医学院毕业实习生
参考文献
1 陈新谦，金有豫主编.新编药物学.第十三版.北京：人民卫生出版社，1992：437
2 刘桂兰，李红丽，殷惠君等.儿童髓外白血病中氨甲喋呤防治剂量的研究：附13例报告.临床儿科杂志，1993，11(3)：17
3 李照民，陆婉琴，孔令琪等.甲氨蝶呤的临床药理-血药浓度与毒性相关的初步观察.上海第一医学院学报，1980，7：406
4 张志义，孙燕主编.恶性肿瘤化学治疗等.第1版.上海：上海科学技术出版，1981：138
5 Erttmann R, Bielack S, Landbeck G.Determination of 7-Hydroxymethotrexate in Human plasma by reversed phase high-performance liquid chromatography.Omcology,1986,43:86
(1998年6月21日收稿), http://www.100md.com(作者：吴闯 杨正鸿 林贵业* 陆泰远*)
单位：广西医科大学第一附属医院 南宁530027
关键词：甲氨蝶呤；反相高效液相色谱法；药物浓度
中国医院药学杂志990508 摘要 目的:建立测定血浆和脑脊液中甲氨蝶呤的反相高效液相色谱方法。方法:采用ODS不锈钢柱，流动相：甲醇∶0.025 mol.L-1磷酸盐缓冲液(21∶79，pH6.70)，检测波长：306 nm，样品经沉淀蛋白质后直接进样。结果:血浆和脑脊液样品回收率分别为97.5%±4.1%和100.8%±1.5%，日内和日间误差(RSD)均<7%，最低检测浓度4.75×10-8 mol.L-1，血浆中在1.10×10-7～2.2×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.76×10-4 mol.L-1；脑脊液中在1.10×10-7～2.20×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.10×10-3 mol.L-1浓度范围内有良好线性关系，r=0.999 6～0.999 9。结论:本法简便、准确、灵敏。
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Determination of methotrexate level in plasma and cereberospinal fluid by HPLC
Wu Chuang,Yang Zhenhong,Lin Guiyi,et al(The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530027)
ABSTRACT OBJECTIVE:To establish an HPLC method for the determination of methotrexate level in plasma and cereberospinal fluid (CSF).METHODS:The separation was performed in a Shim-pack CLC-C18 column (15cm×6.0mm ID) with a mobile phase of methanol:0.025 mol.L-1,phosphate buffer (21∶79,pH6.70) and determinated at 306 nm.RESULTS:The measurable lowest concentration was 4.75×10-8 mol.L-1.The good linear relationship between peak and methotrexate concentration in plasma and in CFS was found.The experiment showed that the recovery from plasma and CSF were 97.5%±4.1% and 100.8%±1.5%,respectively.The RSD(%) of within day and between-day were less than 7%.CONCLUSIONS:The method is simple,accurate.
, 百拇医药
KEY WORDS methotrexate,HPLC,drug concentration
甲氨蝶呤(Methotrexate,简称MTX)为叶酸类抗肿瘤药，目前临床采用大剂量MTX，并用甲酰四氢叶酸钙(Calcium Folinate,简称CF)解救治疗法，MTX用量较常用量大数10倍，对非常增殖细胞特别是肝细胞有直接毒性作用[1]。MTX血药浓度与毒性有密切关系[2.3]，进行血药浓度监测非常必要，国内未见反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定脑脊液中MTX浓度的报道。本文应用RP-HPLC法，同时测定血浆和脑脊液中MTX浓度，指导临床安全有效用药，避免了毒性反应的发生。
1 仪器与试剂
日本岛津HPLC系统，包括LC-6A双泵、SPD-6A检测器、SCL-6B系统控制器、CR-4A数据处理机；LGR16-W型高速离心机(北京医用离心机厂)；MTX对照品(由广西药检所提供)；甲醇优级纯(北京化工厂生产)；其余试剂为分析纯。
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2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Shimpack CLC-ODS(0.6 mm ID×150mm)柱，可换芯C18保护柱(大连化学物理研究所)，流动相甲醇：0.025 mol.L-1磷酸缓冲液(21∶79，pH6.70)，流速1.0 ml.min-1，柱温40℃，检测波长306 nm。
2.2 色谱行为 空白血浆、脑脊液以及MTX和其代谢物的色谱图见图1，2。MTX保留时间为10.20 min，MTX代谢物为12.03 min，两峰均显为对称，陡尖，分离良好，不受血浆和脑脊液杂峰干扰。
图 1 血浆样品色谱图
a：空白血浆；b：空白血浆+MTX；c：用MTX后病人血浆
, 百拇医药
1，2：血浆杂峰；3：MTX；4：MTX代谢物峰
图 2 脑脊液样品色谱图
a空白血浆；b空白脑脊液+MTX；c鞘注MTX后病人脑脊液
1，2杂峰；3MTX；4MTX代谢物
2.3 样品预处理
2.3.1 血浆样品 取肝素抗凝的血浆0.25 ml，逐滴加入10%高氯酸溶液40 μl，置旋涡振荡器边振边加，然后离心10 min(10 000 r.min-1)。上清液加2 mol.L-1氢氧化钠溶液5 μl，混匀后进样40 μl。
2.3.2 脑脊液样品 取脑脊液0.5 ml，直接离心10 min(10000 r.min-1)，上清液进样40 μl。
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2.4 标准曲线
2.4.1 血浆样品 取空白肝素抗凝血浆0.25 ml，准确加入一系列的MTX对照品，使配成(1.10，2.20，11，22，110，220，660，1 100，1 760)×10-7mol.L-19种浓度，照样品预处理操作。结果在1.10×10-7～2.20×10-6 mol.L-1和2.20×10-6～1.76×10-3 mol.L-1两范围内呈良好线性关系，r=0.999 9。
2.4.2 脑脊液样品 取空白脑脊液0.5 ml，精确加入一系列MTX对照样品，配成(1.10，2.20，11，22，110，220，660，1 100，1 760，3 301，11 002)×10-7 mol.L-111种浓度，照样品预处理操作。结果在1.10×10-7～2.20×10-7 mol.L-1和2.20×10-6～1.10×10-3 mol.L-1两范围内呈良好线性关系，r=0.999 1和0.999 7。
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2.5 计算 外标法，以峰高计算。
2.6 方法回收率 在标准曲线范围内，选择平均分布的6～7个浓度考查回收率。结果，血浆样品在(1.54，6.60，15.4，110，440，1 540)×10-7 mol.L-16个浓度的平均方法回收率为97.5%±4.1%(n=4)，脑脊液样品在(1.54，6.60，15.4，66.0，440，2 200，8 800)×10-7 mol.L-17个浓度的平均方法回收率为100.8%±1.5%(n=4)。
2.7 日内、日间误差试验 在标准曲线范围内，选择平均分布的6～7个浓度，每个浓度平行测量4次，结果见表1，2。
表1 血浆样品误差试验 加入量
, 百拇医药 日内误差(n=4)
日间误差(n=4)
×10-7 mol.L-1
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
%
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
, 百拇医药
%
1.54
1.52±0.02
1.3
1.59±0.09
5.7
6.60
6.89±0.22
3.2
6.54±0.33
5.0
15.4
14.1±0.04
, 百拇医药
2.8
14.9±0.6
3.9
110
111±2
2.3
107±6
5.4
440
425±10
2.3
398±26
6.6
, http://www.100md.com
1540
1546±43
3.0
1513±46
3.0
表1显示，血浆样品日内误差<3.2%，日间误差<6.7%。表2显示，脑脊液样品日内误差<7.0%，日间误差<6.5%。表2 脑脊液样品误差试验 加入量
日内误差(n=4)
日间误差(n=4)
×10-7 mol.L-1
测定值
, 百拇医药
×10-7 mol.L-1
RSD
%
测定值
×10-7 mol.L-1
RSD
%
1.54
1.56±0.06
3.8
1.53±0.03
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1.2
6.60
6.54±0.24
3.7
6.56±0.22
3.4
15.4
15.4±0.5
3.3
15.5±0.4
2.4
66.0
69.5±2.7
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3.8
67.0±3.9
5.8
440
450±31
6.9
452±28
6.3
2200
215±75
3.5
2260±146
6.5
, http://www.100md.com
8800
8754±225
2.6
8742±258
3.0
2.8 干扰实验 MTX大剂量冲击疗法中，常用的药有地塞米松和阿糖胞苷，前者出峰时间7 min，后者12 min，对测定无干扰。
2.9 灵敏度 当S/N=2，最低检测限为0.862 ng，最低检测浓度4.75×10-8 mol.L-1。3 临床应用
12例急性淋巴细胞白血病患者，给药方法为MTX 3 g.m-2，先给总量的1/5～1/3，静脉快速滴注30 min，剩余量持续静脉滴注12 h。滴毕后2 h，又于鞘内注入MTX 15 mg.m-2，地塞米松5 mg，阿糖胞苷50 mg。给MTX后28 h(即滴毕MTX15.5 h)，开始用CF解救，首剂30 mg.m-2肌内注射，以后每8 h一次，每次15 mg.m-2，共8～10次。12名患者血浆中的MTX浓度，静脉滴注MTX后0 h为8.9±4.2×10-8 mol.L-1，2 h为2.9±1.5×10-5 mol.L-1，5 h为1.0±0.7×10-5 mol.L-1，24 h(给MTX后36 h，即CF解救后8 h)为1.6±3.0×10-6 mol.L-1，48 h4.0±0.9×10-7 mol.L-1，72 h1.6±2.9×10-7 mol.L-1。脑脊液MTX浓度，鞘注后为6.2±3.0×10-4 mol.L-1。
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4 讨论
4.1 控制基线漂移 MTX不溶于甲醇和乙腈，故甲醇和乙腈不能做为蛋白质沉淀剂，用三氯醋酸则血浆杂峰较多。用高氯酸杂物峰少，但可引起基线漂移，经氢氧化钠调节pH值后，基线漂移可得到明显改善。
4.2 标准曲线处理 MTX大剂量的冲击疗法，样品高低浓度相差甚大，标准曲线范围要求太宽，只有将标准曲线分为两段处理后，才可减少测定误差。
4.3 代谢峰的出现 本实验条件下，病人血浆和脑脊液的MTX峰后，均有一代谢峰出现。据文献[5]报道，MTX代谢物主要为7-OH MTX，此峰是否就是7-OH MTX，有待进一步研究。
4.4 临床应用结果 MTX的有效浓度为10-5～10-4 mol.L-1[5]，本组病例在滴毕5 h内MTX血浆浓度仍在此范围，CF解救后立即降至安全范围，达到解救目的。
, 百拇医药
* 广西桂林医学院毕业实习生
参考文献
1 陈新谦，金有豫主编.新编药物学.第十三版.北京：人民卫生出版社，1992：437
2 刘桂兰，李红丽，殷惠君等.儿童髓外白血病中氨甲喋呤防治剂量的研究：附13例报告.临床儿科杂志，1993，11(3)：17
3 李照民，陆婉琴，孔令琪等.甲氨蝶呤的临床药理-血药浓度与毒性相关的初步观察.上海第一医学院学报，1980，7：406
4 张志义，孙燕主编.恶性肿瘤化学治疗等.第1版.上海：上海科学技术出版，1981：138
5 Erttmann R, Bielack S, Landbeck G.Determination of 7-Hydroxymethotrexate in Human plasma by reversed phase high-performance liquid chromatography.Omcology,1986,43:86
(1998年6月21日收稿), http://www.100md.com(作者：吴闯 杨正鸿 林贵业* 陆泰远*)