定点突变小鼠凝血因子Ⅸ胚胎干细胞基因打靶载体的构建
作者：李坚 戴旭明 杨桦 傅继梁
单位：200433 上海，第二军医大学医学遗传教研室
关键词：定点突变；凝血因子Ⅸ；基因打靶
定点突变小鼠凝血因子 【摘要】 目的 构建定点突变的小鼠凝血因子Ⅸ胚胎干(ES)细胞基因打靶载体。方法 在小鼠Ⅸ因子基因第8外显子中分别引入三个定点突变，构建置换型打靶载体转染胚胎干细胞，经药物筛选后挑取抗性细胞。结果 成功引入点突变并构建置换型打靶载体，转染ES细胞后经药物筛选得到抗性细胞克隆。结论 体外定点突变系统可以对基因进行精细的修饰，为建立更精确地模拟人类疾病的动物模型打下基础。
Vector construction for embryonic stem cell gene targeting of site specific point mutation mouse coagulation factor Ⅸ gene
, 百拇医药
LI Jian, DAI Xuming, YANG Hua, FU Jiliang*.*Department of Medical Genetics, The Second Military Medical University, Shanghai 200433 P.R.China. E-mail:LiJian-1966@Yahoo.com
【Abstract】 Objective To construct the recombinant vectors for embryonic stem (ES) cell gene targeting which contain the mouse coagulation factor Ⅸ(FⅨ) gene modified by PCR site-directed mutagenesis.Methods Three site specific point mutations were introduced into exon 8 of mouse FⅨ gene respectively.The replacement trageting vectors were constructed and transfected into ES cells. The drug-resistant cell clones were picked after drug selection.Results The construction of targeting vectors was successful and several drug-resistant ES cell clones were gained.Conclusion The site specific point mutation system can modify human gene in vitro more accurately.It is useful in the setting up of animal models.
, 百拇医药
【Key words】 Site specific point mutation Coagulation factor Ⅸ Gene targeting
凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ,FⅨ)基因突变造成的血友病B是目前基因治疗研究得比较深入的疾病之一。1982年，人FⅨ基因的cDNA被分离克隆后，小鼠、狗、羊等动物的FⅨ cDNA也相继得到克隆。详细比较这些动物FⅨ基因所编码的氨基酸序列可以发现它们之间有很高的同源性[1-4]。自基因打靶技术成熟以来，人们开始利用这一技术制备血友病B小鼠模型。我们单位和美国的两家实验室分别于去年报道了各自的实验结果，他们的打靶策略都是利用基因大片段的缺失来造成FⅨ基因的遗传缺陷[5-7]。而从大量血友病临床患者的研究资料的分析来看，血友病B大多是由于基因的点突变和短片段缺失造成的[8]。为了更好地模拟FⅨ突变所造成的血友病B表型和为下一步进行胚胎移植，育种并最终获得血友病B小鼠模型打下了基础，我们对小鼠FⅨ基因的第8外显子分别引入3个点突变，用此突变基因片段构建置换型重组打靶载体。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 质粒p0Sdupde1由香港科技大学生物化学系薛红博士馈赠。
1.1.2 ES细胞株 R1(来自129/Sv x 129/Sv-CP杂交F1代胚胎，核型XY，体外培养第7代，由薛红博士提供)。
1.2 分子生物学试剂
1.2.1 分子生物学成套试剂Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems购自Promega公司。
1.2.2 PCR引物 引物均用PCGENE软件包根据小鼠FⅨcDNA序列资料自行设计，分别由Gibco，上海生工生物工程公司，中国科学院上海细胞生物学研究所癌基因研究室等单位协助合成，引物序列见表1，结合位点和相对位置关系见图1，2。
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表1 实验中所用的PCR引物
Tab 1 PCR primers used in the experiment
Primer
(引物)
Sequence
(序列)
Binding site
(结合部位)
P1(reverse)
5′-GATGAGGGATAGTTCAAATCAC-3′
902～923(exon 8 mutation 1)
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P2(reverse)
5′-CCCACTATCTCTTTCACACGAATCTTTGCC-3′
1222～1252(exon 8 mutation 2)
P3(reverse)
5′-ACTTCAGTAACACGGGGTCC-3′
1253～1272(exon 8 mutation 3)
P4(forward)
5′-ATTGAGGCATTCTGTGGGAGG-3′
757～776(exon 7-3′ end)
, 百拇医药
P5(reverse)
5′-TGGTGATGAGGGATAGTTCG-3′
907～926(exon 8-5′ end)
P6(forward)
5′-CTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′
3′ end of neo gene
P7(reverse)
5′-ATGAATTGCTGCCAAGGAGG-3′
FⅨ exon 8-3′ lateral genome region
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注：reverse(反向)，forward(正向),3′ end of neo gene (neo基因3′端)，exon8-3′ lateral genome region (外显子8-3′外侧基因组Ⅸ)，exon 8 mutation (外显子8突变)，exon 7-3′ and (外显子7-3′端)，exon 8-5′ end (外显子8-5′端)
图1 突变模板质粒结构
Fig 1 Structure of template plasmid for mutatgenesis
, 百拇医药
图2 打靶载体的构建过程及其结构
Fig 2 Construction and structure of the targeting vector
1.2.3 细胞培养试剂 DMEM(high glucose,L-glutamine, no sodium pyravate, ES-cell-qualified),LIF(ESGROTM)，非必需氨基酸(NEAA)，2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，青霉素/链霉素混合液，D-PBS，0.5%胰酶(trypsin/EDTA)，胎牛血清(ES-cell-qualified)等ES细胞培养用试剂均购自美国Gibco-BRL公司，胶原(Gelatin)为Sigma公司产品，G4 18为Calbiochem公司产品。
1.3 点突变的引入 按Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems试剂盒的要求制备突变模板，设计突变引物。引入的突变用酶切图谱和测序验证。
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1.4 载体构造 构建含新霉素抗性基因的置换型载体，并经PCR和测序鉴定。
1.5 ES细胞培养和药物抗性克隆的筛选 体外培养ES细胞，用电穿孔法将线性化的基因打靶载体转入细胞，经G418药物筛选后获得药物抗性细胞克隆。
2 结果
2.1 定点突变的引入
2.1.1 突变系统模板质粒的构建 根据文献[5]报道的结果，噬菌体克隆C16包含了小鼠FⅨ基因。回收纯化C16DNA经EcoR Ⅰ酶切的5.5kb片段(其中含有FⅨ基因的第7和第8外显子)，将其克隆于Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems中的pAlter载体中，以酶切图谱和PCR鉴定并确定克隆片段的方向，图1显示用作突变模板的质粒pD7-1-4的结构。
, 百拇医药
2.1.2 点突变的引入和鉴定 按Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems的操作步骤，以质粒D7-1-4为突变模板，以P1，P2和P3为突变引物，在小鼠FⅨ基因第8外显子上每次分别引入一个点突变，其中M1突变消除了第8外显子上的Taq Ⅰ切点，同时引入终止密码。利用限制性内切酶酶切图谱分析(图3)和测序鉴定(图4)，3个点突变被成功引入，得到了3个分别含有一个点突变的质粒(pM1、pM2、pM3)。
图3 Taq Ⅰ酶切鉴定突变Ⅰ M：λ EcoRⅠ+Hind Ⅲ标准;1:pM1;2:pD7-1-4;3:pAlter(pD7-1-4中片段a,b因突变造成TaqⅠ位点的消失而融合为pM1中的片段c)
Fig 3 Identification of mutation Ⅰ digested by Taq Ⅰ M:λ EcoRⅠ+Hind Ⅲ marker;lane 1:pM1;lane 2:pD7-1-4;lane 3:pAlter(fragments a,b in pD7-1-4 become c in pM1 caused by Taq Ⅰ site mutation)
, 百拇医药
图4 突变的测序鉴定 箭头为突变点：a：突变1；b：突变2；c：突变3
Fig 4 Sequencing identification of mutations The mutated sites were marked: a:mutation 1; b:mutation 2; c:mutation 3
2.2 基因打靶载体的构建
2.2.1 构建方法 为了在突变的质粒中引入药物选择性基因，我们对第7内含子进行测序，得到第7内含子全长344bp的序列(测序结果未显示)。分析整个质粒的限制性内切酶酶切位点并经酶切验证，证明第7内含子上含有一个Nco Ⅰ位点，这也是质粒pD7-1-1中唯一的NcoⅠ切点(图5)。用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切分离p0Sdupde1上两端带有1oxP位点的Neo基因片段，插入Nco Ⅰ位点后得到3个分别含有一个点突变的重组打靶载体(pV-M1、pV-M2、pV-M3)。图2显示载体构建的过程。
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图5 pM1和p0Sdupde1的酶切分析 M：λ EcoRI+Hind Ⅲ 标准;1:p0Sdupdel BamHI/Xho Ⅰ双酶切； pM1 NcoⅠ单酶切
Fig 5 Mapping of pM and p0Sdupdel M:λ EcoRI+Hind Ⅲ marker;lane 1:p0Sdupdel digested by BamHI/XhoⅠ; lane 2:pM1 digested by NcoⅠ
2.2.2 基因打靶载体的鉴定 PCR(以V-M1为例，见图6)和测序鉴定结果表明，打靶载体结构符合设计要求。
图6 打靶载体的PCR鉴定(以pV-M1为例) M:λ EcoRI+Hind Ⅲ 标准;1:模板pV-M1,引物P6，P7；2：模板pV-M1,引物P4，P6；3：模板pV-M1，引物P4,P5；4：模板pM1，引物P4，P5
, 百拇医药
Fig 6 PCR identification of targeting vector (pV-M1 as sample) M:λ EcoRI+Hind Ⅲ marker; lane 1:template pV-M1, primers P6,P7;lane 2:template pV-M1, primers P4,P6; lane 3:template pV-M1, primers P4,P5; lane 4:template pM1, primers P4,P5
2.3 小鼠胚胎干细胞体外培养、基因转染和药物筛选
2.3.1 小鼠胚胎干细胞体外培养和观察 为了尽量减少传代次数，缩短体外培养时间，我们直接在胶原化的塑料培养皿(Cornine公司产品)和含1000U/ml的重组LIF(ESGROTM)(Gibco)的培养基中培养R1细胞，在最短的时间内扩大细胞数量，并用液氮冻存数管，以供后用。大多数的ES细胞体外贴壁培养条件下表现为克隆样成团生长，而且生长速度快，细胞呈均匀的圆球形，无突起。
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2.3.2 胚胎干细胞基因转移和药物筛选 大量制备基因打靶载体质粒DNA，经Sma Ⅰ酶切线性化后，酚/氯仿抽提纯化，用无菌PBS溶解DNA(1μg/μl)。选择细胞生长良好、分化细胞少的ES细胞培养物进行电穿孔。DNA用量为40μg，细胞数为1×107，用G418(200U/ml)进行筛选。经过10天的药物筛选，药物抗性ES细胞存活，并长成细胞集落，在显微境下用自制的显微操作针挑取存活的细胞克隆，分别扩大培养后可用于进一步的分子鉴定。
3 讨论
血友病B大多是由FⅨ基因突变造成的，这已被大量的基础和临床研究资料所证实[8]。造成血友病B的FⅨ基因突变分布在各个外显子上，突变类型包括点突变、缺失突变、插入突变等类型，这方面的资料已建立了数据库并逐年修订，今年已是第8版[9]。这提示我们要使FⅨ基因失活，可以有多种突变方式。已经报道的几个血友病B小鼠模型大多是利用基因较大片段的缺失造成的，而较大范围的DNA缺失可能会造成对邻近基因功能的影响，同时也不能真实地反映出自然病变。为此我们参照人FⅨ基因突变的资料设计三个点突变引入小鼠FⅨ第8外显子，在第7内含子插入带loxP的Neo基因作为药物筛选基因。利用这样的打靶载体制备血友病B小鼠模型只会对野生型基因进行精细的修饰，真实地模拟血友病B的表型。
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目前，对血友病B的临床治疗主要是替代疗法，即输血、补充凝血酶原复合物或补充FⅨ浓缩制剂。80年代后期开始，人们试图直接通过基因操作，使血友病B患者自身重新表达出正常的FⅨ，来纠正因FⅨ基因突变所造成的FⅨ蛋白功能缺如，以达到治疗的目的。这种基因治疗方法，开辟了治疗血友病B等遗传病的新途径。我国在FⅨ高效表达载体的构建、基因转移途径的建立以及基因转移靶细胞的选择等方面已取得了重大进展，并进行了临床试验[10]。但从替代疗法和基因治疗研究中发现对有些患者的疗效并不理想。根据已有的资料分析，我们认为是有些患者的FⅨ基因突变造成FⅨ功能和抗原性都大大下降，对外源输入的FⅨ蛋白产生免疫反应，降低了疗效。我们在设计突变位点时特别考虑了这一点(表2)。其中M1、M3造成FⅨ功能和抗原都缺如，而M2则在FⅨ功能丧失的基础上保留其抗原性。日后获得的这三种小鼠模型无疑将可以进行比较分析，为研究FⅨ基因结构与功能的关系积累资料，同时也可为血友病B基因治疗的基础研究提供实验材料。
表2 突变点的选择
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Tab 2 Selection of the mutation sites
Clotting
(normal=100%)
(凝血活性
正常=100%)
Antigen
(normal=100%)
(抗原性
正常=100%)
Nucleotiede
mutation
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(碱基突变)
Amino acid
change
(氨基酸变化)
M1
<1
<1
C→T
263 Arg→stop
M2
<1
110
G→A
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374 Gly→Arg
M3
<1
<1
A→G
380 His→Arg
stop(终止)
本课题受国家自然科学基金(39830360，39680021)、军队九五重点攻关课题(96Z033)、上海市生命科学研究中心课题(95JC14009)资助
参考文献
1 Mann KG, Nesheim ME, Church WR, et al.Surface-dependent reactions of the vitamin K-enzyme complex. Blood, 1990, 76(1)∶1-16.
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2 Furie B, Furie BC. The molecular basis of blood coagulation. Cell, 1988, 53(4)∶505-518.
3 Luchtman-Jones L, Broze GL Jr. The current status of coagulation. Am Med, 1995, 27(1)∶47-52.
4 Bottema CDK, Ketterling RP, Iis, et al. Missense mutation and evolutionary conservation of amino acids:evidence that many of the aminoacids in factor Ⅸ function as “spacer elements”. Am J Hum Genet, 1991, 49(4)∶820-838.
, 百拇医药
5 戴旭明，薛红，杨桦 ，等.基因打靶置换载体的构建和应用研究.第二军医大学学报，1998，19(1)∶5-8.
6 Lin HF, Maeda N, Smithies O, et al. A coagulation factor Ⅸ-dificient mouse model for human hemophilia B. Blood, 1997, 90(1)∶3962-3966.
7 Wang L, Zoppe M, Hackeng TM, et al. A factor Ⅸ-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy. Proc Natl Aced Sci USA,1997,94(21)∶11563-11566.
8 Giannelli F, Green PM, Sommer SS, et al. Haemophilia B(six edition):a database of point mutations and short additions and deletions. Nucleic Acids Res, 1996, 24(1)∶103-118.
, 百拇医药
9 Giannelli F, Green PM, Sommer SS, et al. Haemophilia B:database of point mutations and short additions and deletions-eight edition.Nucleic Acids Res, 1998, 26(1)∶265-268.
10 Hsueh JL.Clinical protocol of human gene transfer for haemophilia B. Hum Gene Ther, 1992, 3∶543-552.
(收稿：1999-02-17 修回：1999-06-05), 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学医学遗传教研室
关键词：定点突变；凝血因子Ⅸ；基因打靶
定点突变小鼠凝血因子 【摘要】 目的 构建定点突变的小鼠凝血因子Ⅸ胚胎干(ES)细胞基因打靶载体。方法 在小鼠Ⅸ因子基因第8外显子中分别引入三个定点突变，构建置换型打靶载体转染胚胎干细胞，经药物筛选后挑取抗性细胞。结果 成功引入点突变并构建置换型打靶载体，转染ES细胞后经药物筛选得到抗性细胞克隆。结论 体外定点突变系统可以对基因进行精细的修饰，为建立更精确地模拟人类疾病的动物模型打下基础。
Vector construction for embryonic stem cell gene targeting of site specific point mutation mouse coagulation factor Ⅸ gene
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LI Jian, DAI Xuming, YANG Hua, FU Jiliang*.*Department of Medical Genetics, The Second Military Medical University, Shanghai 200433 P.R.China. E-mail:LiJian-1966@Yahoo.com
【Abstract】 Objective To construct the recombinant vectors for embryonic stem (ES) cell gene targeting which contain the mouse coagulation factor Ⅸ(FⅨ) gene modified by PCR site-directed mutagenesis.Methods Three site specific point mutations were introduced into exon 8 of mouse FⅨ gene respectively.The replacement trageting vectors were constructed and transfected into ES cells. The drug-resistant cell clones were picked after drug selection.Results The construction of targeting vectors was successful and several drug-resistant ES cell clones were gained.Conclusion The site specific point mutation system can modify human gene in vitro more accurately.It is useful in the setting up of animal models.
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【Key words】 Site specific point mutation Coagulation factor Ⅸ Gene targeting
凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ,FⅨ)基因突变造成的血友病B是目前基因治疗研究得比较深入的疾病之一。1982年，人FⅨ基因的cDNA被分离克隆后，小鼠、狗、羊等动物的FⅨ cDNA也相继得到克隆。详细比较这些动物FⅨ基因所编码的氨基酸序列可以发现它们之间有很高的同源性[1-4]。自基因打靶技术成熟以来，人们开始利用这一技术制备血友病B小鼠模型。我们单位和美国的两家实验室分别于去年报道了各自的实验结果，他们的打靶策略都是利用基因大片段的缺失来造成FⅨ基因的遗传缺陷[5-7]。而从大量血友病临床患者的研究资料的分析来看，血友病B大多是由于基因的点突变和短片段缺失造成的[8]。为了更好地模拟FⅨ突变所造成的血友病B表型和为下一步进行胚胎移植，育种并最终获得血友病B小鼠模型打下了基础，我们对小鼠FⅨ基因的第8外显子分别引入3个点突变，用此突变基因片段构建置换型重组打靶载体。
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1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 质粒p0Sdupde1由香港科技大学生物化学系薛红博士馈赠。
1.1.2 ES细胞株 R1(来自129/Sv x 129/Sv-CP杂交F1代胚胎，核型XY，体外培养第7代，由薛红博士提供)。
1.2 分子生物学试剂
1.2.1 分子生物学成套试剂Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems购自Promega公司。
1.2.2 PCR引物 引物均用PCGENE软件包根据小鼠FⅨcDNA序列资料自行设计，分别由Gibco，上海生工生物工程公司，中国科学院上海细胞生物学研究所癌基因研究室等单位协助合成，引物序列见表1，结合位点和相对位置关系见图1，2。
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表1 实验中所用的PCR引物
Tab 1 PCR primers used in the experiment
Primer
(引物)
Sequence
(序列)
Binding site
(结合部位)
P1(reverse)
5′-GATGAGGGATAGTTCAAATCAC-3′
902～923(exon 8 mutation 1)
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P2(reverse)
5′-CCCACTATCTCTTTCACACGAATCTTTGCC-3′
1222～1252(exon 8 mutation 2)
P3(reverse)
5′-ACTTCAGTAACACGGGGTCC-3′
1253～1272(exon 8 mutation 3)
P4(forward)
5′-ATTGAGGCATTCTGTGGGAGG-3′
757～776(exon 7-3′ end)
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P5(reverse)
5′-TGGTGATGAGGGATAGTTCG-3′
907～926(exon 8-5′ end)
P6(forward)
5′-CTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′
3′ end of neo gene
P7(reverse)
5′-ATGAATTGCTGCCAAGGAGG-3′
FⅨ exon 8-3′ lateral genome region
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注：reverse(反向)，forward(正向),3′ end of neo gene (neo基因3′端)，exon8-3′ lateral genome region (外显子8-3′外侧基因组Ⅸ)，exon 8 mutation (外显子8突变)，exon 7-3′ and (外显子7-3′端)，exon 8-5′ end (外显子8-5′端)
图1 突变模板质粒结构
Fig 1 Structure of template plasmid for mutatgenesis
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图2 打靶载体的构建过程及其结构
Fig 2 Construction and structure of the targeting vector
1.2.3 细胞培养试剂 DMEM(high glucose,L-glutamine, no sodium pyravate, ES-cell-qualified),LIF(ESGROTM)，非必需氨基酸(NEAA)，2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，青霉素/链霉素混合液，D-PBS，0.5%胰酶(trypsin/EDTA)，胎牛血清(ES-cell-qualified)等ES细胞培养用试剂均购自美国Gibco-BRL公司，胶原(Gelatin)为Sigma公司产品，G4 18为Calbiochem公司产品。
1.3 点突变的引入 按Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems试剂盒的要求制备突变模板，设计突变引物。引入的突变用酶切图谱和测序验证。
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1.4 载体构造 构建含新霉素抗性基因的置换型载体，并经PCR和测序鉴定。
1.5 ES细胞培养和药物抗性克隆的筛选 体外培养ES细胞，用电穿孔法将线性化的基因打靶载体转入细胞，经G418药物筛选后获得药物抗性细胞克隆。
2 结果
2.1 定点突变的引入
2.1.1 突变系统模板质粒的构建 根据文献[5]报道的结果，噬菌体克隆C16包含了小鼠FⅨ基因。回收纯化C16DNA经EcoR Ⅰ酶切的5.5kb片段(其中含有FⅨ基因的第7和第8外显子)，将其克隆于Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems中的pAlter载体中，以酶切图谱和PCR鉴定并确定克隆片段的方向，图1显示用作突变模板的质粒pD7-1-4的结构。
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2.1.2 点突变的引入和鉴定 按Altered Sites Ⅱ in vitro Mutagenesis Systems的操作步骤，以质粒D7-1-4为突变模板，以P1，P2和P3为突变引物，在小鼠FⅨ基因第8外显子上每次分别引入一个点突变，其中M1突变消除了第8外显子上的Taq Ⅰ切点，同时引入终止密码。利用限制性内切酶酶切图谱分析(图3)和测序鉴定(图4)，3个点突变被成功引入，得到了3个分别含有一个点突变的质粒(pM1、pM2、pM3)。
图3 Taq Ⅰ酶切鉴定突变Ⅰ M：λ EcoRⅠ+Hind Ⅲ标准;1:pM1;2:pD7-1-4;3:pAlter(pD7-1-4中片段a,b因突变造成TaqⅠ位点的消失而融合为pM1中的片段c)
Fig 3 Identification of mutation Ⅰ digested by Taq Ⅰ M:λ EcoRⅠ+Hind Ⅲ marker;lane 1:pM1;lane 2:pD7-1-4;lane 3:pAlter(fragments a,b in pD7-1-4 become c in pM1 caused by Taq Ⅰ site mutation)
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图4 突变的测序鉴定 箭头为突变点：a：突变1；b：突变2；c：突变3
Fig 4 Sequencing identification of mutations The mutated sites were marked: a:mutation 1; b:mutation 2; c:mutation 3
2.2 基因打靶载体的构建
2.2.1 构建方法 为了在突变的质粒中引入药物选择性基因，我们对第7内含子进行测序，得到第7内含子全长344bp的序列(测序结果未显示)。分析整个质粒的限制性内切酶酶切位点并经酶切验证，证明第7内含子上含有一个Nco Ⅰ位点，这也是质粒pD7-1-1中唯一的NcoⅠ切点(图5)。用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切分离p0Sdupde1上两端带有1oxP位点的Neo基因片段，插入Nco Ⅰ位点后得到3个分别含有一个点突变的重组打靶载体(pV-M1、pV-M2、pV-M3)。图2显示载体构建的过程。
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图5 pM1和p0Sdupde1的酶切分析 M：λ EcoRI+Hind Ⅲ 标准;1:p0Sdupdel BamHI/Xho Ⅰ双酶切； pM1 NcoⅠ单酶切
Fig 5 Mapping of pM and p0Sdupdel M:λ EcoRI+Hind Ⅲ marker;lane 1:p0Sdupdel digested by BamHI/XhoⅠ; lane 2:pM1 digested by NcoⅠ
2.2.2 基因打靶载体的鉴定 PCR(以V-M1为例，见图6)和测序鉴定结果表明，打靶载体结构符合设计要求。
图6 打靶载体的PCR鉴定(以pV-M1为例) M:λ EcoRI+Hind Ⅲ 标准;1:模板pV-M1,引物P6，P7；2：模板pV-M1,引物P4，P6；3：模板pV-M1，引物P4,P5；4：模板pM1，引物P4，P5
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Fig 6 PCR identification of targeting vector (pV-M1 as sample) M:λ EcoRI+Hind Ⅲ marker; lane 1:template pV-M1, primers P6,P7;lane 2:template pV-M1, primers P4,P6; lane 3:template pV-M1, primers P4,P5; lane 4:template pM1, primers P4,P5
2.3 小鼠胚胎干细胞体外培养、基因转染和药物筛选
2.3.1 小鼠胚胎干细胞体外培养和观察 为了尽量减少传代次数，缩短体外培养时间，我们直接在胶原化的塑料培养皿(Cornine公司产品)和含1000U/ml的重组LIF(ESGROTM)(Gibco)的培养基中培养R1细胞，在最短的时间内扩大细胞数量，并用液氮冻存数管，以供后用。大多数的ES细胞体外贴壁培养条件下表现为克隆样成团生长，而且生长速度快，细胞呈均匀的圆球形，无突起。
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2.3.2 胚胎干细胞基因转移和药物筛选 大量制备基因打靶载体质粒DNA，经Sma Ⅰ酶切线性化后，酚/氯仿抽提纯化，用无菌PBS溶解DNA(1μg/μl)。选择细胞生长良好、分化细胞少的ES细胞培养物进行电穿孔。DNA用量为40μg，细胞数为1×107，用G418(200U/ml)进行筛选。经过10天的药物筛选，药物抗性ES细胞存活，并长成细胞集落，在显微境下用自制的显微操作针挑取存活的细胞克隆，分别扩大培养后可用于进一步的分子鉴定。
3 讨论
血友病B大多是由FⅨ基因突变造成的，这已被大量的基础和临床研究资料所证实[8]。造成血友病B的FⅨ基因突变分布在各个外显子上，突变类型包括点突变、缺失突变、插入突变等类型，这方面的资料已建立了数据库并逐年修订，今年已是第8版[9]。这提示我们要使FⅨ基因失活，可以有多种突变方式。已经报道的几个血友病B小鼠模型大多是利用基因较大片段的缺失造成的，而较大范围的DNA缺失可能会造成对邻近基因功能的影响，同时也不能真实地反映出自然病变。为此我们参照人FⅨ基因突变的资料设计三个点突变引入小鼠FⅨ第8外显子，在第7内含子插入带loxP的Neo基因作为药物筛选基因。利用这样的打靶载体制备血友病B小鼠模型只会对野生型基因进行精细的修饰，真实地模拟血友病B的表型。
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目前，对血友病B的临床治疗主要是替代疗法，即输血、补充凝血酶原复合物或补充FⅨ浓缩制剂。80年代后期开始，人们试图直接通过基因操作，使血友病B患者自身重新表达出正常的FⅨ，来纠正因FⅨ基因突变所造成的FⅨ蛋白功能缺如，以达到治疗的目的。这种基因治疗方法，开辟了治疗血友病B等遗传病的新途径。我国在FⅨ高效表达载体的构建、基因转移途径的建立以及基因转移靶细胞的选择等方面已取得了重大进展，并进行了临床试验[10]。但从替代疗法和基因治疗研究中发现对有些患者的疗效并不理想。根据已有的资料分析，我们认为是有些患者的FⅨ基因突变造成FⅨ功能和抗原性都大大下降，对外源输入的FⅨ蛋白产生免疫反应，降低了疗效。我们在设计突变位点时特别考虑了这一点(表2)。其中M1、M3造成FⅨ功能和抗原都缺如，而M2则在FⅨ功能丧失的基础上保留其抗原性。日后获得的这三种小鼠模型无疑将可以进行比较分析，为研究FⅨ基因结构与功能的关系积累资料，同时也可为血友病B基因治疗的基础研究提供实验材料。
表2 突变点的选择
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Tab 2 Selection of the mutation sites
Clotting
(normal=100%)
(凝血活性
正常=100%)
Antigen
(normal=100%)
(抗原性
正常=100%)
Nucleotiede
mutation
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(碱基突变)
Amino acid
change
(氨基酸变化)
M1
<1
<1
C→T
263 Arg→stop
M2
<1
110
G→A
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374 Gly→Arg
M3
<1
<1
A→G
380 His→Arg
stop(终止)
本课题受国家自然科学基金(39830360，39680021)、军队九五重点攻关课题(96Z033)、上海市生命科学研究中心课题(95JC14009)资助
参考文献
1 Mann KG, Nesheim ME, Church WR, et al.Surface-dependent reactions of the vitamin K-enzyme complex. Blood, 1990, 76(1)∶1-16.
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2 Furie B, Furie BC. The molecular basis of blood coagulation. Cell, 1988, 53(4)∶505-518.
3 Luchtman-Jones L, Broze GL Jr. The current status of coagulation. Am Med, 1995, 27(1)∶47-52.
4 Bottema CDK, Ketterling RP, Iis, et al. Missense mutation and evolutionary conservation of amino acids:evidence that many of the aminoacids in factor Ⅸ function as “spacer elements”. Am J Hum Genet, 1991, 49(4)∶820-838.
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5 戴旭明，薛红，杨桦 ，等.基因打靶置换载体的构建和应用研究.第二军医大学学报，1998，19(1)∶5-8.
6 Lin HF, Maeda N, Smithies O, et al. A coagulation factor Ⅸ-dificient mouse model for human hemophilia B. Blood, 1997, 90(1)∶3962-3966.
7 Wang L, Zoppe M, Hackeng TM, et al. A factor Ⅸ-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy. Proc Natl Aced Sci USA,1997,94(21)∶11563-11566.
8 Giannelli F, Green PM, Sommer SS, et al. Haemophilia B(six edition):a database of point mutations and short additions and deletions. Nucleic Acids Res, 1996, 24(1)∶103-118.
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9 Giannelli F, Green PM, Sommer SS, et al. Haemophilia B:database of point mutations and short additions and deletions-eight edition.Nucleic Acids Res, 1998, 26(1)∶265-268.
10 Hsueh JL.Clinical protocol of human gene transfer for haemophilia B. Hum Gene Ther, 1992, 3∶543-552.
(收稿：1999-02-17 修回：1999-06-05), 百拇医药