MTHFR基因缺陷孕妇应用叶酸预防NTD临床观察
作者：郑冬梅 孙延芝 杨雪松 关凯男 李克深
单位：解放军211医院 哈尔滨 150086
关键词：
MTHFR基因缺陷孕妇应用叶酸预防NTD临床观察1 材料与方法
1.1 观察对象
选择我院及哈尔滨市其他医院门诊曾生育过神经管畸形(NTD)患儿或有NTD家族史的早孕患者 114例，筛选出孕妇亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T突变者57例，其中纯和突变(V/ V)34例，杂和突变(A/V)23例。57例孕妇中曾生育过一次NTD患儿者22例，生育两次以上NTD 患儿者5例，有NTD家族史者30例。
1.2 观察方法
, 百拇医药
1.2.1 MTHFR检测：(1)DNA的提取：取静脉血3ml，ACD抗凝，利用常规酚/ 氯仿抽提法提取DNA，DNA浓度用紫外分光光度计测定。(2)PCE-RFLP分析：PCR扩增用DNA热 循 环仪(Perkin-Elmer480)，引物序列为：NCO-351∶5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′， NCO-352∶5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′。反应体系为30ul，包括10×Buffer3. 0u l，2.5mmol 4×dNTP1.5ul，NCO1 2ul，NCO2 2ul，TaqDNA聚合酶0.4ul(5U/ul)，H2O 19.1ul基因组DNA2ml。反应条件首先是94°C预变性5分钟，其后的30个循环为94°C 30sec ，60°C 20sec，72°C60sec，循环结束再72°C延伸5分。扩增后取10ulPCR扩增产物用0. 2u lTag I(10u/ul)消化过夜。(3)酶解产物的电泳分离及银染：制备12%(交联度29∶1)非变性 聚丙烯酰胺凝胶，100V预电泳30分钟，取5ul酶解产物与1ul6×上样缓冲液(0.25%溴酚兰， 40%蔗糖)混匀后上样，150V恒压电泳3～4小时后揭胶。凝胶经过固定(10%乙醇+0.5%乙酸， 12分钟)、染色(0.2%AgNO320分钟)、显色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步处理后即可 进行分析。
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1.2.2 叶酸应用：对所选的57例观察孕妇于停经7周之前开始 给予叶酸片剂口服，每日5mg服至妊娠12周结束。
1.2.3 NTD检查：对所选观察孕妇在妊娠16周后进行B型超声检 查，测量胎儿颅骨光环、脊柱连续性及侧脑室的比例三项指标。
2 结果
2.1 MTHFR C677T多态位点电泳图谱 由于MTHFR677位点C被T置换后 ，可产生一个TaqI限 制内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可产生一个TaqI限制 内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可分出三种基因型：纯合A677/A677由于序列中 无TaqI切点，所以电泳后只出现一条带为 134bp；存合V677/V677可见二条带75bp和59bp；杂 合子A677/V677可见三条带134bp，75bp和59bp。
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2.2 B型超声检测结果 对57例含有NTHFR基因突变的孕 妇，孕早期口服叶酸后，待妊娠16周以后进行B超检测，结果57例孕妇的胎儿58个(双胎一个 )三项检测指标均在正常范围。
3 讨论
脊柱裂、无脑儿及脑脊膜膨出是一系列由于神经管未闭合引起的新生儿出生缺陷(NTD)。有 关NTD的致病因素目前仍不清楚，国内外多数学者认为NTD是遗传因素和环境因素综合作用结 果。最近，国外的研究发现，在怀有NTD患儿的妇女血中轻度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的现 象，而怀孕期间母体Hcy浓度轻度升高或蛋氨酸浓度轻度降低将会干扰神经管闭合。N5，N10 -亚甲基四氢叶酸还原酶在半光叶酸的代谢中有非常重要的地位，它催化N5，N10-亚甲基四 氢叶酸还原成N5-甲基四氢叶酸，而后者将甲基转给Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷将导 致Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍。叶酸在蛋氨酸的代谢中必不可少，它以5-甲基四氢叶酸形 式起作用，叶酸水平不足，导致蛋氨酸合成障碍，血中Hcy堆积，在孕早期干扰神经管闭合 。 妇女妊娠期叶酸的需要量不断增加，以用来满足迅速生长的胎儿、胎盘、母体组织 DNA合成 以及红细胞增加的需要。成人维持正常DNA合成每日叶酸的最低需要量为50μg，并可维持正 常青年妇女的血清叶酸水平。但孕妇贫血或任何代谢障碍时，对叶酸的需要量增加达6～8倍 。 正常膳食的摄取不能满足孕妇的叶酸需要，必须进行补充或食物强化。近年有研究表明妊娠 前至妊娠12周内每日补充4mg叶酸对NTD的再发有较好的预防作用，预防效果为72%。
我们选择57例生过NTD患儿并含有MTHFRC677T突变的孕妇，在孕早期补充足量的叶酸以促进H cy的代谢，使这样一个NTD高发病的人群中无NTD患儿发生，有资料证明有NTD生育史孕妇再 生育NTD患儿的比率为2～10%。治疗结果显示叶酸在预防MTHFR基因突变孕妇的NTD发生过程 中起显著预防作用。
[收稿 1999—05—06], 百拇医药
单位：解放军211医院 哈尔滨 150086
关键词：
MTHFR基因缺陷孕妇应用叶酸预防NTD临床观察1 材料与方法
1.1 观察对象
选择我院及哈尔滨市其他医院门诊曾生育过神经管畸形(NTD)患儿或有NTD家族史的早孕患者 114例，筛选出孕妇亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T突变者57例，其中纯和突变(V/ V)34例，杂和突变(A/V)23例。57例孕妇中曾生育过一次NTD患儿者22例，生育两次以上NTD 患儿者5例，有NTD家族史者30例。
1.2 观察方法
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1.2.1 MTHFR检测：(1)DNA的提取：取静脉血3ml，ACD抗凝，利用常规酚/ 氯仿抽提法提取DNA，DNA浓度用紫外分光光度计测定。(2)PCE-RFLP分析：PCR扩增用DNA热 循 环仪(Perkin-Elmer480)，引物序列为：NCO-351∶5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′， NCO-352∶5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′。反应体系为30ul，包括10×Buffer3. 0u l，2.5mmol 4×dNTP1.5ul，NCO1 2ul，NCO2 2ul，TaqDNA聚合酶0.4ul(5U/ul)，H2O 19.1ul基因组DNA2ml。反应条件首先是94°C预变性5分钟，其后的30个循环为94°C 30sec ，60°C 20sec，72°C60sec，循环结束再72°C延伸5分。扩增后取10ulPCR扩增产物用0. 2u lTag I(10u/ul)消化过夜。(3)酶解产物的电泳分离及银染：制备12%(交联度29∶1)非变性 聚丙烯酰胺凝胶，100V预电泳30分钟，取5ul酶解产物与1ul6×上样缓冲液(0.25%溴酚兰， 40%蔗糖)混匀后上样，150V恒压电泳3～4小时后揭胶。凝胶经过固定(10%乙醇+0.5%乙酸， 12分钟)、染色(0.2%AgNO320分钟)、显色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步处理后即可 进行分析。
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1.2.2 叶酸应用：对所选的57例观察孕妇于停经7周之前开始 给予叶酸片剂口服，每日5mg服至妊娠12周结束。
1.2.3 NTD检查：对所选观察孕妇在妊娠16周后进行B型超声检 查，测量胎儿颅骨光环、脊柱连续性及侧脑室的比例三项指标。
2 结果
2.1 MTHFR C677T多态位点电泳图谱 由于MTHFR677位点C被T置换后 ，可产生一个TaqI限 制内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可产生一个TaqI限制 内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可分出三种基因型：纯合A677/A677由于序列中 无TaqI切点，所以电泳后只出现一条带为 134bp；存合V677/V677可见二条带75bp和59bp；杂 合子A677/V677可见三条带134bp，75bp和59bp。
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2.2 B型超声检测结果 对57例含有NTHFR基因突变的孕 妇，孕早期口服叶酸后，待妊娠16周以后进行B超检测，结果57例孕妇的胎儿58个(双胎一个 )三项检测指标均在正常范围。
3 讨论
脊柱裂、无脑儿及脑脊膜膨出是一系列由于神经管未闭合引起的新生儿出生缺陷(NTD)。有 关NTD的致病因素目前仍不清楚，国内外多数学者认为NTD是遗传因素和环境因素综合作用结 果。最近，国外的研究发现，在怀有NTD患儿的妇女血中轻度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的现 象，而怀孕期间母体Hcy浓度轻度升高或蛋氨酸浓度轻度降低将会干扰神经管闭合。N5，N10 -亚甲基四氢叶酸还原酶在半光叶酸的代谢中有非常重要的地位，它催化N5，N10-亚甲基四 氢叶酸还原成N5-甲基四氢叶酸，而后者将甲基转给Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷将导 致Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍。叶酸在蛋氨酸的代谢中必不可少，它以5-甲基四氢叶酸形 式起作用，叶酸水平不足，导致蛋氨酸合成障碍，血中Hcy堆积，在孕早期干扰神经管闭合 。 妇女妊娠期叶酸的需要量不断增加，以用来满足迅速生长的胎儿、胎盘、母体组织 DNA合成 以及红细胞增加的需要。成人维持正常DNA合成每日叶酸的最低需要量为50μg，并可维持正 常青年妇女的血清叶酸水平。但孕妇贫血或任何代谢障碍时，对叶酸的需要量增加达6～8倍 。 正常膳食的摄取不能满足孕妇的叶酸需要，必须进行补充或食物强化。近年有研究表明妊娠 前至妊娠12周内每日补充4mg叶酸对NTD的再发有较好的预防作用，预防效果为72%。
我们选择57例生过NTD患儿并含有MTHFRC677T突变的孕妇，在孕早期补充足量的叶酸以促进H cy的代谢，使这样一个NTD高发病的人群中无NTD患儿发生，有资料证明有NTD生育史孕妇再 生育NTD患儿的比率为2～10%。治疗结果显示叶酸在预防MTHFR基因突变孕妇的NTD发生过程 中起显著预防作用。
[收稿 1999—05—06], 百拇医药