体外细胞毒性试验评价齿科材料的现状及展望
刘晓亮 综述 张彩霞 审校
齿科材料体外细胞毒性测试的重要性在于：1、细胞毒性试验早已被公认为是鉴别筛选具有良好生物相容性材料的一种方法[1]。而改进试验方法的最终目的在于使之更为准确有效。以相对减少动物和人体实验；2、材料及其组成成份与细胞之间在分子水平的相互作用可能表现为组织学上的病理改变，如炎症、组织坏死及免疫反应等，甚至致癌、致畸、致突变[2，3]。因此，了解材料与细胞之间的相互作用有助于我们进一步探讨材料的应用过程中可能导致机体发生上述病变的机理。
尽管目前体外细胞毒性试验的方法较多，各有不同，但万变不离其宗即(1)体外培养用细胞分成两类，其一为已建株的细胞系，其二为原代培养细胞。(2)细胞与材料的接触方式可以是直接接触、间接接触或通过材料浸提液方式接触。(3)最终的检测指标较为多样除观察细胞的形态学变化外，不同的生物学终点(biological endpionts)都可以用作细胞损伤的指症，如细胞膜损伤、细胞生物合成的活性的改变等。本文将就此三方面的对现有的用以评价齿科材料的体外细胞毒性试验的方法作一总结和评价。
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一、体外培养细胞的类别
齿科材料在临床应用时接触到不同种类的细胞，有来源于牙髓组织、口腔膜及骨组织等的细胞，它们在功能上都各不同，而在体外细胞毒性试验中采用的培养细胞多为建株的细胞系，如L929、3T3及癌细胞[4-7]；也有一部分采用原代培养细胞，如牙龈组织纤维细胞和牙髓组织纤维细胞[8-10]。
已被命名的细胞系或细胞株，都是些形态比较均一，生长状态比较稳定和生物性状清楚的细胞群[11]。相对于体内多种细胞而言，它们作为材料毒性测验的靶细胞，具有简单易得、重复性好等优点。Schmalz[12]曾研究用体外细胞培养琼脂覆盖法评价材料毒性。若采用原始数据，则结果有很好的可重复性，不仅是在同现实验室如此，而且在不同的实验室里、凡是用原始数据来表示毒性程度的，亦有很好的相关性。
而原代培养的细胞因其取自于体内，必然较为接近实际状况，用作材料毒性的靶细胞似乎更能说明问题。不过进行细胞原代培养，使其传代生存并符合实验条件并非易事，仅少数实验室可以办到。而且目前多数研究室仅仅采用单一种类的机体细胞，并不能准确反映体内多种细胞情况。
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虽然所采用的细胞种类不同的确会对实验结果有影响[13，14]。但其差异并无妨碍，对材料的毒性定级仍是比较一致的。Schmalz和Wataha分别采用琼脂覆盖法和MTT法观察体内外不同类型的细胞对材料毒性试验的影响，均发现建株细胞较原代培养细胞稍敏感，但对最终材料的毒性分级无影响。
因此应用原代培养细胞进行体外细胞毒性试验尚无显著优势。根据国际标准化组织的要求，已建株细胞更适用于齿科材料的细胞毒性试验。不过以了解材料与细胞相互作用机理为目的的试验，显然应用取自于机体的原代培养细胞更为有价值。
二、被测材料与培养细胞的接触方式
齿科材料在应用时可直接接触牙龈粘膜组织、牙髓组织，或经牙本质及污染层的屏障作用间接接触牙髓组织。体外细胞毒性试验所采用的材料与细胞直接接触或间接接触的方式，均是仿效材料与应用于体内时的各种情况。
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采用材料与细胞直接接触的方式虽说较为简便，但材料对培养细胞的微生物污染(因为多数材料经严格灭菌后会发生理化性质的改变)和机械损伤却是难以避免的，而采用琼脂或醋酸纤维素滤过膜，则可以保护细胞层免受细菌污染和机械损伤。
为模似体内齿科材料对未暴露的牙髓组织的毒性作用，较早采用的有分子滤过法[36-37]。此法以一定孔径的滤膜分隔材料与细胞，来模似材料毒性成份通过牙本质小管影响牙髓组织的情况。但细胞在滤膜上的分布不均会影响实验结果。从七十年代开始有人不断尝试将材料与细胞在有牙质间隔的条件下进行细胞毒性试验[5，19，20]其中大多数取人的第三磨牙牙本质，切成薄或磨压成薄片，作为牙本质屏障，使材料与培养细胞得以间接接触。然而采用此类间接接触的方法会使试验的装置及操作复杂化，就其可行性而言亦有一定难度。因为合适的人牙本质取材有限，且每一片牙本质结构已与正常者相差甚远。Schmalz改用较容易得到的狗牙本质作为材料与细胞间接接触的屏障，发现细胞可以在狗牙本质表面生长，且狗牙本质的流体传导性几乎与人牙本质是一样的[23，24]。
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近年来，已认识到齿科材料在体内应用时可能由于a、有害成份被稀释扩散，b、机体原有的生理屏障作用，c、有害成份与组织接触时间过短，而并不表现出材料在一般体外毒性试验中其所有的毒性级别[35]。因此在体外试验中充分考虑模似体内实际情况就显得尤为重要。虽然以牙本质为间隔进行的间接接触式试验方式尚有较多不足，但这是一个应该努力的方向。
另一种材料与细胞接触的方式是采用浸提液，既先制备材料的浸提液，然后用此浸提液与细胞接触培养，观察材料对细胞的毒性作用。此法简单易行，目前被广泛采用。材料浸提液进行试验有诸多优点：(1)材料浸提液容易获取。(2)材料浸提液可以经离心或过滤法去除杂质颗粒，且可采用简单的高温高压法进行消毒灭菌。(3)材料浸提液能与细胞有广泛且均匀的接触。(4)材料浸提液可用于分析材料中各组成成份及其浓度对细胞毒性的影响。
三、细胞毒性评定的生物学终点
在体外试验中，材料导致细胞损伤首先可用形态学上的改变来描述。由于细胞死亡之后形态会发生皱缩、崩解等改变，因此这是一种定性的检测的方法。细胞死亡之后的形态改变可以在相差显微镜下直接观察，进行活细胞计数。也可以在光镜或电镜下观察细胞受损后尚未死亡前形态学方面的细胞改变。以初步了解材料与细胞间相互作用的机理。但某一些齿科材料含有或在试验过程中会产生一定量的甲醛，而甲醛是细胞的固定剂，培养细胞会被固定而显示正常形态、从而无法识别细胞是否因材料的毒性作用而死亡或损伤。这点应引起注意。
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而另一观察细胞反应的指标是以膜效应为生物学终点的。如中性红染色法，台盼兰染色法，荧光素染色法均以是否被染色以示存活细胞和死亡细胞的区别。活细胞可被中性红染成红色，当细胞临近死亡时颜色就丧失、而只盼兰只能将死亡细胞染成蓝色，乙酰乙酸盐荧光素可标记活细胞。通过染色以鉴别细胞活性显然要比观察细胞形态以确认其是否死亡较为方便、客观、但在结果的计数上难免带有主观性。51Cr释放试验也是以膜通透性为生学物终点的。先将培养细胞进行51Cr标记，细胞经材料毒性作用后，由于细胞膜通透性改变而释放51Cr，经测定51Cr释放量评价细胞增殖率和死亡率。此方法虽可得到较客观的定量结果，但培养细胞需先行51Cr标记，且51Cr有放射性危害。
国内张彩霞在1982年率先采用体外细胞培养法检测了齿科材料的毒性。在90年代提出紫外分光光度仪检测材料细胞毒性的新方法。它采用结晶紫罗兰进行贴壁细胞的染色，再抽提染色液，根据紫外分光光度仪所测定的吸光度计算其对增殖率，以评定材料的毒性级。1992年又引入细胞回复度的方法的测定材料的细胞毒性。此法将细胞与材料浸提液作用后，重新换成培养液继续培养，通过吸光度的测定，计算细胞回复度，以评价材料对细胞的毒性。这两种方法对实验设备要求不高，快速、简便且较为客观，已在国内推广。
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近年来MTT法受到广泛青睐[29-31]MTT法的生物学终点为重要细胞器--线粒体。MTT是一种可溶性四唑盐，在活细胞线粒体内可被脱氢酶还极为有色沉淀物，该沉淀物可被有机溶剂洗脱，通过分光光度仪定量，从而评价细胞活力的情况。Craing和Hanks曾用较相似的NBT法来测定线粒体上脱氢酶的活性[32]，但因其操作步骤及对结果的定量不如MTT法简便客观而未得以推广。MTT法的优越性在于：其生物学终点为重要的细胞器--线粒体，线粒体病变被认为是表示细胞受损最敏感的指征，因此结果无疑可以十分灵敏地反映细胞受损程度。而且MTT法试验过程简便快速，自动化程度高，从而使试验结果精确、客观。其主要不足在于有色沉淀物会在较短的时间内褪色。
此外，还有用分光光度仪等方法测定培养细胞的总蛋白量，以此评价细胞的增殖度和死亡率。用放射性核苷酸前体物掺入法，如3H-TdR、14C-TdR，它们可以被培养细胞摄取进行DNA合成，通过液相闪烁仪可定量DNA合成率。用3H-leucine掺入法，定量培养细胞蛋白质的合成率，用高压液相色谱法测定培养细胞的ATP 、ADP、AMP浓度，以定量其能量的改变。后三种方法虽可较深入细致地了解细胞受材料毒性影响面产生的分子水平上的变化，但由于其方法复杂、结果分析受较多因素的影响，且与其它体外法无明显的相关性，因此，作为评价材料毒性的方法显得尚不成熟。
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综上所述，评价齿科材料的体外是否具有良好的生物相容性的初筛手段，细胞毒性试验的方法正不断得到改进和拓展。其结果试验的生物学终点趋向客观灵敏，反映细胞受损的细微变化；其材料与培养细胞的接触方式要求尽量效仿体内的实际情况，其所选用的培养细胞，除了适应标准化需要的细胞株外，还包括各类原代细胞培养，以通过体外试验的方法了解材料与机体细胞作用的机理。作者认为细胞毒性试验的根本目的是为了预知和避免材料应用于人体后可能是导致不良反应。因此，试验条件尽可能地模仿体内状况将是最终的努力方向。而在此之前，全面和细致地了解材料对细胞产生的效应，包括细胞本身结构的超微改变和功能的失调，都将有助于我们更为准确地评价材料的毒性程度，虽然目前体外细胞毒性试验尚不能替代动物实验，但可以相信随着研究的深入和技术的完善，必将使动物实验缩减至最少的程度。
参考文献
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校对时间 99-12-08 轩趁喜, 百拇医药
齿科材料体外细胞毒性测试的重要性在于：1、细胞毒性试验早已被公认为是鉴别筛选具有良好生物相容性材料的一种方法[1]。而改进试验方法的最终目的在于使之更为准确有效。以相对减少动物和人体实验；2、材料及其组成成份与细胞之间在分子水平的相互作用可能表现为组织学上的病理改变，如炎症、组织坏死及免疫反应等，甚至致癌、致畸、致突变[2，3]。因此，了解材料与细胞之间的相互作用有助于我们进一步探讨材料的应用过程中可能导致机体发生上述病变的机理。
尽管目前体外细胞毒性试验的方法较多，各有不同，但万变不离其宗即(1)体外培养用细胞分成两类，其一为已建株的细胞系，其二为原代培养细胞。(2)细胞与材料的接触方式可以是直接接触、间接接触或通过材料浸提液方式接触。(3)最终的检测指标较为多样除观察细胞的形态学变化外，不同的生物学终点(biological endpionts)都可以用作细胞损伤的指症，如细胞膜损伤、细胞生物合成的活性的改变等。本文将就此三方面的对现有的用以评价齿科材料的体外细胞毒性试验的方法作一总结和评价。
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一、体外培养细胞的类别
齿科材料在临床应用时接触到不同种类的细胞，有来源于牙髓组织、口腔膜及骨组织等的细胞，它们在功能上都各不同，而在体外细胞毒性试验中采用的培养细胞多为建株的细胞系，如L929、3T3及癌细胞[4-7]；也有一部分采用原代培养细胞，如牙龈组织纤维细胞和牙髓组织纤维细胞[8-10]。
已被命名的细胞系或细胞株，都是些形态比较均一，生长状态比较稳定和生物性状清楚的细胞群[11]。相对于体内多种细胞而言，它们作为材料毒性测验的靶细胞，具有简单易得、重复性好等优点。Schmalz[12]曾研究用体外细胞培养琼脂覆盖法评价材料毒性。若采用原始数据，则结果有很好的可重复性，不仅是在同现实验室如此，而且在不同的实验室里、凡是用原始数据来表示毒性程度的，亦有很好的相关性。
而原代培养的细胞因其取自于体内，必然较为接近实际状况，用作材料毒性的靶细胞似乎更能说明问题。不过进行细胞原代培养，使其传代生存并符合实验条件并非易事，仅少数实验室可以办到。而且目前多数研究室仅仅采用单一种类的机体细胞，并不能准确反映体内多种细胞情况。
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虽然所采用的细胞种类不同的确会对实验结果有影响[13，14]。但其差异并无妨碍，对材料的毒性定级仍是比较一致的。Schmalz和Wataha分别采用琼脂覆盖法和MTT法观察体内外不同类型的细胞对材料毒性试验的影响，均发现建株细胞较原代培养细胞稍敏感，但对最终材料的毒性分级无影响。
因此应用原代培养细胞进行体外细胞毒性试验尚无显著优势。根据国际标准化组织的要求，已建株细胞更适用于齿科材料的细胞毒性试验。不过以了解材料与细胞相互作用机理为目的的试验，显然应用取自于机体的原代培养细胞更为有价值。
二、被测材料与培养细胞的接触方式
齿科材料在应用时可直接接触牙龈粘膜组织、牙髓组织，或经牙本质及污染层的屏障作用间接接触牙髓组织。体外细胞毒性试验所采用的材料与细胞直接接触或间接接触的方式，均是仿效材料与应用于体内时的各种情况。
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采用材料与细胞直接接触的方式虽说较为简便，但材料对培养细胞的微生物污染(因为多数材料经严格灭菌后会发生理化性质的改变)和机械损伤却是难以避免的，而采用琼脂或醋酸纤维素滤过膜，则可以保护细胞层免受细菌污染和机械损伤。
为模似体内齿科材料对未暴露的牙髓组织的毒性作用，较早采用的有分子滤过法[36-37]。此法以一定孔径的滤膜分隔材料与细胞，来模似材料毒性成份通过牙本质小管影响牙髓组织的情况。但细胞在滤膜上的分布不均会影响实验结果。从七十年代开始有人不断尝试将材料与细胞在有牙质间隔的条件下进行细胞毒性试验[5，19，20]其中大多数取人的第三磨牙牙本质，切成薄或磨压成薄片，作为牙本质屏障，使材料与培养细胞得以间接接触。然而采用此类间接接触的方法会使试验的装置及操作复杂化，就其可行性而言亦有一定难度。因为合适的人牙本质取材有限，且每一片牙本质结构已与正常者相差甚远。Schmalz改用较容易得到的狗牙本质作为材料与细胞间接接触的屏障，发现细胞可以在狗牙本质表面生长，且狗牙本质的流体传导性几乎与人牙本质是一样的[23，24]。
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近年来，已认识到齿科材料在体内应用时可能由于a、有害成份被稀释扩散，b、机体原有的生理屏障作用，c、有害成份与组织接触时间过短，而并不表现出材料在一般体外毒性试验中其所有的毒性级别[35]。因此在体外试验中充分考虑模似体内实际情况就显得尤为重要。虽然以牙本质为间隔进行的间接接触式试验方式尚有较多不足，但这是一个应该努力的方向。
另一种材料与细胞接触的方式是采用浸提液，既先制备材料的浸提液，然后用此浸提液与细胞接触培养，观察材料对细胞的毒性作用。此法简单易行，目前被广泛采用。材料浸提液进行试验有诸多优点：(1)材料浸提液容易获取。(2)材料浸提液可以经离心或过滤法去除杂质颗粒，且可采用简单的高温高压法进行消毒灭菌。(3)材料浸提液能与细胞有广泛且均匀的接触。(4)材料浸提液可用于分析材料中各组成成份及其浓度对细胞毒性的影响。
三、细胞毒性评定的生物学终点
在体外试验中，材料导致细胞损伤首先可用形态学上的改变来描述。由于细胞死亡之后形态会发生皱缩、崩解等改变，因此这是一种定性的检测的方法。细胞死亡之后的形态改变可以在相差显微镜下直接观察，进行活细胞计数。也可以在光镜或电镜下观察细胞受损后尚未死亡前形态学方面的细胞改变。以初步了解材料与细胞间相互作用的机理。但某一些齿科材料含有或在试验过程中会产生一定量的甲醛，而甲醛是细胞的固定剂，培养细胞会被固定而显示正常形态、从而无法识别细胞是否因材料的毒性作用而死亡或损伤。这点应引起注意。
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而另一观察细胞反应的指标是以膜效应为生物学终点的。如中性红染色法，台盼兰染色法，荧光素染色法均以是否被染色以示存活细胞和死亡细胞的区别。活细胞可被中性红染成红色，当细胞临近死亡时颜色就丧失、而只盼兰只能将死亡细胞染成蓝色，乙酰乙酸盐荧光素可标记活细胞。通过染色以鉴别细胞活性显然要比观察细胞形态以确认其是否死亡较为方便、客观、但在结果的计数上难免带有主观性。51Cr释放试验也是以膜通透性为生学物终点的。先将培养细胞进行51Cr标记，细胞经材料毒性作用后，由于细胞膜通透性改变而释放51Cr，经测定51Cr释放量评价细胞增殖率和死亡率。此方法虽可得到较客观的定量结果，但培养细胞需先行51Cr标记，且51Cr有放射性危害。
国内张彩霞在1982年率先采用体外细胞培养法检测了齿科材料的毒性。在90年代提出紫外分光光度仪检测材料细胞毒性的新方法。它采用结晶紫罗兰进行贴壁细胞的染色，再抽提染色液，根据紫外分光光度仪所测定的吸光度计算其对增殖率，以评定材料的毒性级。1992年又引入细胞回复度的方法的测定材料的细胞毒性。此法将细胞与材料浸提液作用后，重新换成培养液继续培养，通过吸光度的测定，计算细胞回复度，以评价材料对细胞的毒性。这两种方法对实验设备要求不高，快速、简便且较为客观，已在国内推广。
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近年来MTT法受到广泛青睐[29-31]MTT法的生物学终点为重要细胞器--线粒体。MTT是一种可溶性四唑盐，在活细胞线粒体内可被脱氢酶还极为有色沉淀物，该沉淀物可被有机溶剂洗脱，通过分光光度仪定量，从而评价细胞活力的情况。Craing和Hanks曾用较相似的NBT法来测定线粒体上脱氢酶的活性[32]，但因其操作步骤及对结果的定量不如MTT法简便客观而未得以推广。MTT法的优越性在于：其生物学终点为重要的细胞器--线粒体，线粒体病变被认为是表示细胞受损最敏感的指征，因此结果无疑可以十分灵敏地反映细胞受损程度。而且MTT法试验过程简便快速，自动化程度高，从而使试验结果精确、客观。其主要不足在于有色沉淀物会在较短的时间内褪色。
此外，还有用分光光度仪等方法测定培养细胞的总蛋白量，以此评价细胞的增殖度和死亡率。用放射性核苷酸前体物掺入法，如3H-TdR、14C-TdR，它们可以被培养细胞摄取进行DNA合成，通过液相闪烁仪可定量DNA合成率。用3H-leucine掺入法，定量培养细胞蛋白质的合成率，用高压液相色谱法测定培养细胞的ATP 、ADP、AMP浓度，以定量其能量的改变。后三种方法虽可较深入细致地了解细胞受材料毒性影响面产生的分子水平上的变化，但由于其方法复杂、结果分析受较多因素的影响，且与其它体外法无明显的相关性，因此，作为评价材料毒性的方法显得尚不成熟。
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综上所述，评价齿科材料的体外是否具有良好的生物相容性的初筛手段，细胞毒性试验的方法正不断得到改进和拓展。其结果试验的生物学终点趋向客观灵敏，反映细胞受损的细微变化；其材料与培养细胞的接触方式要求尽量效仿体内的实际情况，其所选用的培养细胞，除了适应标准化需要的细胞株外，还包括各类原代细胞培养，以通过体外试验的方法了解材料与机体细胞作用的机理。作者认为细胞毒性试验的根本目的是为了预知和避免材料应用于人体后可能是导致不良反应。因此，试验条件尽可能地模仿体内状况将是最终的努力方向。而在此之前，全面和细致地了解材料对细胞产生的效应，包括细胞本身结构的超微改变和功能的失调，都将有助于我们更为准确地评价材料的毒性程度，虽然目前体外细胞毒性试验尚不能替代动物实验，但可以相信随着研究的深入和技术的完善，必将使动物实验缩减至最少的程度。
参考文献
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校对时间 99-12-08 轩趁喜, 百拇医药