大鼠占位模型与脊髓神经细胞死亡方式研究
作者：徐又佳 郑祖根 董启榕 刘 强 李 峰 姚 敏
单位：
关键词：脊髓占位；损伤；细胞凋亡
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 该研究在脊髓损伤神经细胞凋亡领域首次探讨脊髓占位模型中神经细胞死亡方式，为其他研究提供实验依据。大鼠胸10椎管后方放置0.8mm、长3mm的硬质塑料管，术后第3d运用荧光原位末端标记法(TUNEL标记)发现在损伤中心灰质、白质均存在细胞凋亡，其中白质传导束凋亡细胞明显。研究认为脊髓在持续性机械占位损伤中，神经细胞继发性改变存在主动死亡方式。
中图法分类 R651.2
Research on Occupying Model of Rat Spinal Cord and Death Style of Neurocyte
, 百拇医药
Xu Youjia,Zheng Zugen, Dong Qirong, et al
Department of Orthopaedics, The Second Hospital Affiliated to Suzhou Medical College, Suzhou, 215004
Abstract Reportedly, it is the first time of our research on nerve cell death style with a spinal cord occupying model in the field of spinal cord injury. Method A hard plastic tube (with a diameter of 0.8mm and a length of 3mm) was put into a rat vertebral canal (T10). Three days later the TUNEL mark was employed to detect the death style. Result apoptotic cells were found both in the spinal white and gray matter after SCI in rat. Conclusion There is an active death phenomena (apoptosis) in secondary changes of neurocytes with continuously occupying lesion of spinal cord.
, 百拇医药
Key words spinal cord occupying; apoptosis
目前关于脊髓损伤后神经细胞死亡的机制以及防范、治疗方法仍然是一个研究热点。众多研究的脊髓损伤模型多是Allen氏挫伤模型(Contusion)。而在临床实践中不少脊髓损伤是椎管占位(Occupation)所致。本研究重点建立一个脊髓占位损伤模型，同时进行细胞凋亡的表达研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠，体重250～275克(中科院上海动物所提供)，共16只。实验室适应性饲养1周。随机分4组：占位模型组4只；假手术组2只；正常对照组2只；模型对照组(Allen氏方法)2只。占位模型预实验共6只。
1.2 损伤模型：动物用4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后俯卧位固定，按改良Nystrm[1]方法进行无菌手术。仔细咬除T11椎板，显露T11节段脊髓。将预实验选定的占位物体(直径0.8mm、长3mm无菌硬质塑料管)沿硬膜外间隙纵向推入T10椎管后方，大鼠尾部常可见应激反应。预实验用3种直径为1.1mm、0.8mm、0.5mm,长度为3mm的硬质塑料管分别放入不同模型椎管内，术后用Tarlove评分和Rivlin[2]斜板试验评价，在重量相同大鼠中，1.1mm×3mm占位发生双下肢完全瘫痪，斜板维持时间<5s；而0.5mm×3mm占位术后48h双下肢肌力评分达4～5级；0.8mm×4mm占位术后下肢行为与本组Allen氏不全瘫模型对照组相当，属不完全瘫痪模型。解剖证实椎管内物体无纵向、左右移位，受压硬膜72h仍存在充血反应，肉眼观白质充血集中在背侧柱区域。
, http://www.100md.com
假手术模型：按上述暴露方式，仅咬除T11椎板，暴露脊髓为止。术后处理：术后肌注洁霉素0.3g一次，分笼饲养。取材时间：损伤后72h。
1.3 取材方法：将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开胸腔，将灌流套管金属钝性头部由左心室插入主动脉并固定，灌注同时剪开右心耳放血。先用0.01 mol/L PBS快速灌注3 min(约200 ml)；立刻换4%多聚甲醛前固定液灌注5 min(约200 ml)。灌注后即解剖取出完整脊髓组织，放入4%多聚甲醛内后固定(>24h)。择日将脊髓损伤中心段组织(约2mm)取出进行常规石腊包埋并切片(1张凋亡，1张HE)。
1.4 凋亡显示：采用荧光原位末端标记法(TUNEL标记)，方法及剂试盒由Boehringer Mannhein公司提供。切片经脱腊、水化后，用Protenase K(Qiagen公司)20mg/L消化封闭蛋白，缓冲液冲洗后加入TUNEL反应液，37℃孵浴60min；反应液含有TdT 5×Buffer、DigdUTP、TdT。孵浴结束即用萤光显微镜观察，阳性结果为萤光亮点。记录相关资料，选择摄像。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HE染色：在光镜下可见脊髓损伤平面灰质中有小的出血坏死灶，后角Ⅰ～Ⅲ区比较集中；白质背侧柱结构损伤，有明显出血、坏死灶，特别在白质腹侧束也可见有空泡形成(见图1，2)。
图1 脊髓占位损伤3d,脊髓横断面HE染色表现，×4
(“→”表示出血灶)
2.2 TUNEL 标记：细胞凋亡阳性表现在荧光镜下呈“夜空星星点”状。椎管占位与模型对照组均可见典型阳性结果。低倍镜下可见灰质部位后角均存在凋亡细胞；白质传导束有较多凋亡细胞(见图3，图4，图5)。假手术组和正常对照组切片未见上述表现。
, 百拇医药
图2 在图1表现中可见白质腹侧束空泡形成，×10
图3 脊髓占位损伤3天，脊髓损伤断面细胞凋亡荧光显示，×10。(TUNEL法)
图4 脊髓灰质后角区细胞凋亡荧光表现，×10
图5 纵切面中白质传导束细胞凋亡荧光表现，荧光点小，属胶质细胞凋亡，×10
3 讨论
3.1 损伤模型
研究脊髓机械性损伤后继发性改变的损伤模型对研究结果及临床意义有着纽带、桥梁作用。目前该领域已有重物坠落法、重物压迫法、气囊压迫法、液压震荡法、纵向牵拉法、切割损伤法等[3，4]，但在脊髓神经细胞凋亡研究范畴主要有2种实验性机械
, http://www.100md.com
致伤模型：①Allen氏重物打击法，主要是对脊髓组织进行坠落瞬间打击或时间衡定压迫，导致脊髓损伤效果。Liu[5]曾用这一方法制造分级损伤模型：10 g重物6.25 mm坠落和10 g重物12.5 mm坠落；Katoh[6]则用60 g重物压迫脊髓15 min。②脊髓横断法，主要是对脊髓组织上下通路进行一侧或全部切割离断，使头侧和尾侧失去解剖连续性及生理联系性。Crowe[7]对猴的脊髓(T10)进行半切损伤，也证实神经细胞凋亡存在。上述两种方法均模拟了临床脊髓重要的损伤方式。本研究首次提出另一种机械损伤方式，用无菌塑料棒放置椎管内，术后行为评价与对照组相同，符合不全瘫指标；同时实验结果可见阳性反应，从而表示模型成功并产生实验价值。由于Allen挫伤模型主要是形成脊髓组织一过性挫伤后出血，再形成广泛缺血，4～6h后出现髓鞘及轴突变性、缺血性内皮损伤，这一方式很难符合临床中椎管持续占位而产生慢性损伤刺激，因此新的占位损伤模型丰富了脊髓神经细胞凋亡的研究方法。
, http://www.100md.com
3.2 凋亡显示方法
神经细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞程序性死亡过程，不同于传统的坏死概念，是一种主动性死亡方式。自1996年Katoh[6]首次在大鼠脊髓挫伤模型中发现后引起了广泛关注，被誉为脊髓损伤继发性改变机制的突破性标志[8]。近年来研究凋亡的手段，主要有DNA电泳法、电镜法、流式细胞仪法，但这些方法或不能定位，或观察范围太小，难与病理形态学密切结合；而单纯HE光镜观察则凋亡特异性太小，难以发现早期凋亡细胞。1992年Gavrieli[9]首次报道原位末端标记法。由于凋亡形态学特点是细胞膜皱缩，核固缩，染色质边集、破裂，凋亡小体形成，而这些变化的核心是核酸内切酶被不同因素诱导活化，将DNA链切断，形成180～200个碱基为倍数的多个DNA片段，同时暴露大量3′-OH断端；原位末端标记法(TUNEL)正是用TdT酶中介通过标记3′-OH断端在细胞水平检测凋亡存在的方法。此法已广泛应用于大脑缺血损伤和大脑机械损伤模型的神经细胞凋亡研究中。Katoh[6]和Crowe[7]报道了用TUNEL法发现脊髓挫伤模型和半切伤模型中存在神经细胞凋亡。本研究首次在脊髓占位模型中运用TUNEL法，并发现神经细胞凋亡改变，丰富了脊髓继发性改变的实验理论，对临床工作有良好的指导作用。
, http://www.100md.com
3.3 神经细胞凋亡的研究价值
细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，与传统的细胞坏死完全不同，而且诱发因素也不同。确切地了解脊髓机械性损伤后神经细胞死亡方式，目的是对继发改变机制有新的理解，为治疗提出新的启示和途径。以往许多研究认为脊髓机械性损伤主要是神经细胞继发性坏死。本研究结果提示，脊髓损伤继发性改变细胞凋亡在慢性损伤中也存在；另外，该占位模型中灰质、白质均可见细胞凋亡，进一步说明慢性机械性损伤可能是细胞凋亡的诱因之一，从而为进一步研究抑制凋亡提供了新的研究方法。
参考文献
1 Nystrn B, et al. Methodological analysis of an experimental spinal cord compression model in the rat. Acta Newol Scand, 1988,78∶460～465
, http://www.100md.com
2 Rivlin AS, Tator CH. Objective clinical assessment of motor function after experiment spinal cord injury in the rat. J Neurosurg. 1977，47∶577～580
3 Khan M, Griebel R. Acute spinal cord injury in the rat:comparision of three experimental techniques. Can J Neurol Sci. 1983，10∶161～168
4 Dolan BJ. The effect of spinal distracion on regional spinal cord blood flow in cat. J Neurosurg. 1980，53∶756～761
, 百拇医药
5 Liu XZ, et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci, 1997，17∶5394～5406
6 Kotoh K, et al. Induction and its spread of apoptosis in rat spinal cord after mechanical trauma. Neuroscience letters, 1996，216∶9～12
7 Crowe MJ, et al. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nature Medicine. 1997，3∶73～76
8 Marcia B. New view of spinal cord injury. Science, 1996，274∶1466
9 Majno G, Joris J. Apoptosis, oncosis and necrosis: An overview of cell death. Am J Pathol.1995，146∶3～15
1999年4月19日收稿, http://www.100md.com
单位：
关键词：脊髓占位；损伤；细胞凋亡
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 该研究在脊髓损伤神经细胞凋亡领域首次探讨脊髓占位模型中神经细胞死亡方式，为其他研究提供实验依据。大鼠胸10椎管后方放置0.8mm、长3mm的硬质塑料管，术后第3d运用荧光原位末端标记法(TUNEL标记)发现在损伤中心灰质、白质均存在细胞凋亡，其中白质传导束凋亡细胞明显。研究认为脊髓在持续性机械占位损伤中，神经细胞继发性改变存在主动死亡方式。
中图法分类 R651.2
Research on Occupying Model of Rat Spinal Cord and Death Style of Neurocyte
, 百拇医药
Xu Youjia,Zheng Zugen, Dong Qirong, et al
Department of Orthopaedics, The Second Hospital Affiliated to Suzhou Medical College, Suzhou, 215004
Abstract Reportedly, it is the first time of our research on nerve cell death style with a spinal cord occupying model in the field of spinal cord injury. Method A hard plastic tube (with a diameter of 0.8mm and a length of 3mm) was put into a rat vertebral canal (T10). Three days later the TUNEL mark was employed to detect the death style. Result apoptotic cells were found both in the spinal white and gray matter after SCI in rat. Conclusion There is an active death phenomena (apoptosis) in secondary changes of neurocytes with continuously occupying lesion of spinal cord.
, 百拇医药
Key words spinal cord occupying; apoptosis
目前关于脊髓损伤后神经细胞死亡的机制以及防范、治疗方法仍然是一个研究热点。众多研究的脊髓损伤模型多是Allen氏挫伤模型(Contusion)。而在临床实践中不少脊髓损伤是椎管占位(Occupation)所致。本研究重点建立一个脊髓占位损伤模型，同时进行细胞凋亡的表达研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠，体重250～275克(中科院上海动物所提供)，共16只。实验室适应性饲养1周。随机分4组：占位模型组4只；假手术组2只；正常对照组2只；模型对照组(Allen氏方法)2只。占位模型预实验共6只。
1.2 损伤模型：动物用4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后俯卧位固定，按改良Nystrm[1]方法进行无菌手术。仔细咬除T11椎板，显露T11节段脊髓。将预实验选定的占位物体(直径0.8mm、长3mm无菌硬质塑料管)沿硬膜外间隙纵向推入T10椎管后方，大鼠尾部常可见应激反应。预实验用3种直径为1.1mm、0.8mm、0.5mm,长度为3mm的硬质塑料管分别放入不同模型椎管内，术后用Tarlove评分和Rivlin[2]斜板试验评价，在重量相同大鼠中，1.1mm×3mm占位发生双下肢完全瘫痪，斜板维持时间<5s；而0.5mm×3mm占位术后48h双下肢肌力评分达4～5级；0.8mm×4mm占位术后下肢行为与本组Allen氏不全瘫模型对照组相当，属不完全瘫痪模型。解剖证实椎管内物体无纵向、左右移位，受压硬膜72h仍存在充血反应，肉眼观白质充血集中在背侧柱区域。
, http://www.100md.com
假手术模型：按上述暴露方式，仅咬除T11椎板，暴露脊髓为止。术后处理：术后肌注洁霉素0.3g一次，分笼饲养。取材时间：损伤后72h。
1.3 取材方法：将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开胸腔，将灌流套管金属钝性头部由左心室插入主动脉并固定，灌注同时剪开右心耳放血。先用0.01 mol/L PBS快速灌注3 min(约200 ml)；立刻换4%多聚甲醛前固定液灌注5 min(约200 ml)。灌注后即解剖取出完整脊髓组织，放入4%多聚甲醛内后固定(>24h)。择日将脊髓损伤中心段组织(约2mm)取出进行常规石腊包埋并切片(1张凋亡，1张HE)。
1.4 凋亡显示：采用荧光原位末端标记法(TUNEL标记)，方法及剂试盒由Boehringer Mannhein公司提供。切片经脱腊、水化后，用Protenase K(Qiagen公司)20mg/L消化封闭蛋白，缓冲液冲洗后加入TUNEL反应液，37℃孵浴60min；反应液含有TdT 5×Buffer、DigdUTP、TdT。孵浴结束即用萤光显微镜观察，阳性结果为萤光亮点。记录相关资料，选择摄像。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HE染色：在光镜下可见脊髓损伤平面灰质中有小的出血坏死灶，后角Ⅰ～Ⅲ区比较集中；白质背侧柱结构损伤，有明显出血、坏死灶，特别在白质腹侧束也可见有空泡形成(见图1，2)。
图1 脊髓占位损伤3d,脊髓横断面HE染色表现，×4
(“→”表示出血灶)
2.2 TUNEL 标记：细胞凋亡阳性表现在荧光镜下呈“夜空星星点”状。椎管占位与模型对照组均可见典型阳性结果。低倍镜下可见灰质部位后角均存在凋亡细胞；白质传导束有较多凋亡细胞(见图3，图4，图5)。假手术组和正常对照组切片未见上述表现。
, 百拇医药
图2 在图1表现中可见白质腹侧束空泡形成，×10
图3 脊髓占位损伤3天，脊髓损伤断面细胞凋亡荧光显示，×10。(TUNEL法)
图4 脊髓灰质后角区细胞凋亡荧光表现，×10
图5 纵切面中白质传导束细胞凋亡荧光表现，荧光点小，属胶质细胞凋亡，×10
3 讨论
3.1 损伤模型
研究脊髓机械性损伤后继发性改变的损伤模型对研究结果及临床意义有着纽带、桥梁作用。目前该领域已有重物坠落法、重物压迫法、气囊压迫法、液压震荡法、纵向牵拉法、切割损伤法等[3，4]，但在脊髓神经细胞凋亡研究范畴主要有2种实验性机械
, http://www.100md.com
致伤模型：①Allen氏重物打击法，主要是对脊髓组织进行坠落瞬间打击或时间衡定压迫，导致脊髓损伤效果。Liu[5]曾用这一方法制造分级损伤模型：10 g重物6.25 mm坠落和10 g重物12.5 mm坠落；Katoh[6]则用60 g重物压迫脊髓15 min。②脊髓横断法，主要是对脊髓组织上下通路进行一侧或全部切割离断，使头侧和尾侧失去解剖连续性及生理联系性。Crowe[7]对猴的脊髓(T10)进行半切损伤，也证实神经细胞凋亡存在。上述两种方法均模拟了临床脊髓重要的损伤方式。本研究首次提出另一种机械损伤方式，用无菌塑料棒放置椎管内，术后行为评价与对照组相同，符合不全瘫指标；同时实验结果可见阳性反应，从而表示模型成功并产生实验价值。由于Allen挫伤模型主要是形成脊髓组织一过性挫伤后出血，再形成广泛缺血，4～6h后出现髓鞘及轴突变性、缺血性内皮损伤，这一方式很难符合临床中椎管持续占位而产生慢性损伤刺激，因此新的占位损伤模型丰富了脊髓神经细胞凋亡的研究方法。
, http://www.100md.com
3.2 凋亡显示方法
神经细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞程序性死亡过程，不同于传统的坏死概念，是一种主动性死亡方式。自1996年Katoh[6]首次在大鼠脊髓挫伤模型中发现后引起了广泛关注，被誉为脊髓损伤继发性改变机制的突破性标志[8]。近年来研究凋亡的手段，主要有DNA电泳法、电镜法、流式细胞仪法，但这些方法或不能定位，或观察范围太小，难与病理形态学密切结合；而单纯HE光镜观察则凋亡特异性太小，难以发现早期凋亡细胞。1992年Gavrieli[9]首次报道原位末端标记法。由于凋亡形态学特点是细胞膜皱缩，核固缩，染色质边集、破裂，凋亡小体形成，而这些变化的核心是核酸内切酶被不同因素诱导活化，将DNA链切断，形成180～200个碱基为倍数的多个DNA片段，同时暴露大量3′-OH断端；原位末端标记法(TUNEL)正是用TdT酶中介通过标记3′-OH断端在细胞水平检测凋亡存在的方法。此法已广泛应用于大脑缺血损伤和大脑机械损伤模型的神经细胞凋亡研究中。Katoh[6]和Crowe[7]报道了用TUNEL法发现脊髓挫伤模型和半切伤模型中存在神经细胞凋亡。本研究首次在脊髓占位模型中运用TUNEL法，并发现神经细胞凋亡改变，丰富了脊髓继发性改变的实验理论，对临床工作有良好的指导作用。
, http://www.100md.com
3.3 神经细胞凋亡的研究价值
细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，与传统的细胞坏死完全不同，而且诱发因素也不同。确切地了解脊髓机械性损伤后神经细胞死亡方式，目的是对继发改变机制有新的理解，为治疗提出新的启示和途径。以往许多研究认为脊髓机械性损伤主要是神经细胞继发性坏死。本研究结果提示，脊髓损伤继发性改变细胞凋亡在慢性损伤中也存在；另外，该占位模型中灰质、白质均可见细胞凋亡，进一步说明慢性机械性损伤可能是细胞凋亡的诱因之一，从而为进一步研究抑制凋亡提供了新的研究方法。
参考文献
1 Nystrn B, et al. Methodological analysis of an experimental spinal cord compression model in the rat. Acta Newol Scand, 1988,78∶460～465
, http://www.100md.com
2 Rivlin AS, Tator CH. Objective clinical assessment of motor function after experiment spinal cord injury in the rat. J Neurosurg. 1977，47∶577～580
3 Khan M, Griebel R. Acute spinal cord injury in the rat:comparision of three experimental techniques. Can J Neurol Sci. 1983，10∶161～168
4 Dolan BJ. The effect of spinal distracion on regional spinal cord blood flow in cat. J Neurosurg. 1980，53∶756～761
, 百拇医药
5 Liu XZ, et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci, 1997，17∶5394～5406
6 Kotoh K, et al. Induction and its spread of apoptosis in rat spinal cord after mechanical trauma. Neuroscience letters, 1996，216∶9～12
7 Crowe MJ, et al. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nature Medicine. 1997，3∶73～76
8 Marcia B. New view of spinal cord injury. Science, 1996，274∶1466
9 Majno G, Joris J. Apoptosis, oncosis and necrosis: An overview of cell death. Am J Pathol.1995，146∶3～15
1999年4月19日收稿, http://www.100md.com