大鼠实验性门脉高压循环动力状态及一氧化氮的改变
作者：黄颖秋 萧树东 张德中 莫剑忠
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院，上海市消化疾病研究所；(黄颖秋，现在辽宁省本钢总医院消化科工作)
关键词：一氧化氮；肝硬化大鼠；门脉高压性胃病；血流动力学
大鼠实验性门脉高压循环动力状态及 一氧化氮的改变 【摘要】 目的 探讨一氧化氮(NO)在肝硬化血流动力学改变及门脉高压性胃病中的作用。方法 用60%四氯化碳皮下注射制造肝硬化门脉高压大鼠模型；应用57Co核素标记微球检测肝硬化大鼠血流动力学参数；应用还原型辅酶Ⅱ-黄递梅(NADPH-d)组化染色观察肝硬化大鼠胃壁一氧化氮合酶(NOS)分布；应用荧光法测定血清NO含量。结果 肝硬化大鼠均伴门脉高压，且全部出现高动力循环状态；肝硬化大鼠胃粘膜NOS呈阳性反应，血清NO含量显著高于对照组。结论 一氧化氮可能参与肝硬化血流动力学异常及门脉高压性胃病的致病机制。
, 百拇医药
Hyperdynamic circulatory status and nitricoxide
concentration changes in experi mental
cirrhotic rats with portal hypertension.
HUANG Yingqiu, XIAO Shudong, ZHANG Dezhong, et al.
Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital,Shanghai Second Medic al University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To investigate the effects of nitric oxide (NO) on the hemodynamic changes and p rotal hypertensive gastropathy in cirrhotic rats. Methods Cirrhotic rat models were made by injection of 60% oil y solution of CCl4 subcutaneously. Hemodynamics parameters were determined in c irrhotic rats and controls by using 57Co-lablled microsphere techniqu e. The distribution of nitric oxide synthase (NOS) in gastric wall of rats with c irrhosis were studied by using NADPH-diaphorase (NADPH-d) histochemical method ; In addition, serum NO concentration was measured with a fluorometric assay.Results Hyperdynamic circulatory status associated with protal hypertension was observed in all cirrhotic rats. There was also a NOS-positive statining area in gastric mucosa. Serum NO concentration in cirrhotic rats were significantly higher than that in normal control.Conclusion NO may play a pathophysiologic role in the developm ent of hemodynamic changes of cirrhosis and portal hypertensive gastropathy.(Shanghai Med J, 1999,22∶463-465)
, http://www.100md.com
【Key words】 Nitric oxide Cirrhotic rat Portal hy pertensive gastropathy Hemodynamics
肝硬化大鼠血流动力学参数，用NADPH-d组化染色观察大鼠胃壁中的NOS分布，旨在探讨NO在此病变中的致病机制。
材料和方法
一、肝硬化模型制备
雄性SD大鼠，皮下注射60%CCl4油性溶液，0.3ml/100g，每4天注射一次(首次倍量)，共计24次，同时以10%乙醇代替饮水。模型建立后，随机取8只作为肝硬化组。另取同批正常SD大鼠8只作为对照组。
二、血流动力学研究方法[1,2]
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盐酸氯氨酮肌肉麻醉，固定大鼠于恒温手术台上，从右股动脉插入一根PE50导管至腹主动脉，导管经换能器连于生理监护仪(Lifescope6)；从右股静脉插入一根PE50导管至下腔静脉；从右颈总动脉插入一根PE50导管至左心室；左上腹部纵行切口1.5～2.0cm，轻拉脾脏至切口外。稳定10分钟后，记录平均动脉压(MAP)；用4号头皮针(经换能器连于监护仪)刺入脾实质内记录平均脾髓压，以此代表门静脉压力(PP)[3](脾髓压约等于门脉压)；从右颈总动脉导管注入大约5万个57Co标记微球(直径15±0.6μm)，注入前10秒钟开始从右股动脉导管抽取参考血样，以1ml/min的速度恒速抽血70秒钟；从右股静脉导管采血2ml，低温分离血清，置-70°C贮存备检；上述操作结束后15分钟，处死动物，迅速取全层胃底组织少许置入液氮速冻，再取中叶小块肝组织置10%甲醛液中固定，备作形态学检查，然后取出胃、脾、胰、肾、肠和肠系膜分别称重，切成小块分置于γ-计数管内，用γ计数仪测定放射活性(每分钟脉冲数)。
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三、血流动力学指标计算方法
门静脉血流量(PVI)=胃+脾+肠+肠系膜+胰腺血流量
内脏血管阻力(SVR)和门静脉阻力(PVR)计算公式为：
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四、NADPH-d组化染色[4]
自液氮中取出胃底组织标本，立即置入内含4%多聚甲醛、0.4%苦味酸的0.16mol/LPBS(pH6.9)中固定4小时。然后移入内含10%蔗糖的0.1mol/LPBS(pH7.2)中，4°C过夜。-20°C恒冷切片机连续切片6～8张，厚度10μm。以0.01mol/LPBS漂洗切片，然后置于含下列试剂的PBS(pH8.0,37°C)中孵育40分钟：0.3%TritonX-100,0.5mmol/LNBT,1.0mmol/Lβ-NADPH。然后将切片置于0.01mol/LPBS(pH7.4)中终止反应。乙醇梯度脱水、透明及封片。
五、血清NO测定[5]
取血清0.5ml加20%磺基水杨酸钠溶液100μl，混匀，静止10分钟，5000转/分离心5分钟，取上清0.25ml加入蒸馏水至1ml，加入2.3-二氨基萘盐酸溶液0.5ml混匀，20°C反应10分钟，加入2.8mol/LNaOH溶液0.1ml终止反应，在F-4000荧光分光光度计上以激发波长365nm，发射波长420nm,狭缝3nm测相对荧光强度(F值)，以亚硝酸钠(NaNO2)溶液作标准曲线，计算血清中的NO-2/NO-3浓度，以此代表NO含量。
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六、肝脏组织学检查
常规10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏形态学改变。
七、统计学处理
结果以x±s表示，行配对t检验。P<0.05有统计学意义。
结果
一、大鼠肝硬化造模成功，光镜示肝细胞再生、纤维组织增生及假小叶形成。
二、血流动力学检测发现，与对照组比较，肝硬化组MAP和SVR显著降低，CO、CI及PP显著升高(表1)。
表1 血流动力学指标
项目
, 百拇医药
正常对照组
肝硬化组
MAP(kPa)
17.05±0.34
14.42±0.47*
PP(kPa)
1.123±0.096
1.665±0.067*
CO(ml/min)
135.5±3.55
189.99±9.26*
, 百拇医药
CI(ml.min-1.100gBW-1)
39.68±1.64
55.89±1.82*
PVI(ml.min-1.100gBW-1)
3.762±0.094
4.295±0.155*
SVR(kPa.ml-1.min-1.
100gBW-1)
, 百拇医药
4.234±0.118
2.974±0.186*
PVR(kPa.ml-1.min-1.
100gBW-1)
0.299±0.026
0.388±0.011*
与对照组比较：*P<0.01
三、肝硬化组除脾脏血流量降低外，其余内脏器官血流量均高于对照组(P<0.01)(表2)。
表2 内脏器官血流量(ml.min-1.g-1)
, 百拇医药
器官
正常对照组
肝硬化组
胃
0.544±0.045
0.881±0.065*
脾
0.946±0.060
0.725±0.057*
胰
0.819±0.031
0.998±0.055*
, 百拇医药
肠和肠系膜
1.451±0.037
1.686±0.057*
肾
0.465±0.038
0.686±0.046*
与对照组比较：*P<0.01 四、肝硬化组血清NO含量显著高于对照组
正常对照组NO-2/NO-3含量为(0.532±0.257)μmol/L,肝硬化组为(4.204±1.253)μmol/L，两组比较P<0.01。
, 百拇医药
讨论
门脉高压性胃病为门脉高压状态下的一种胃粘膜病变，主要表现为粘膜和粘膜下的血管扩张，而组织学上无明显炎症。其特异性改变为胃粘膜的樱桃红样斑点。有研究发现，此病变局限于胃底者占65%而累及全胃者仅占29%，这可能是肝硬化失代偿期上消化道出血的又一因素。NO作为强烈的内皮源性舒张因子，在肝硬化的血流动力学改变中发挥作用，但其与门脉高压性胃病的关系却知之甚少。NO由其唯一限速酶NOS介导产生，因此NOS已成为研究NO的一种手段。NADPH-d染色是通过确定NOS相关酶，间接反应NOS活性的一种组织化学方法[6]。Dawson等[7]等采用免疫组化和NADPH-d组化方法证实无论在神经系统还是非神经系统中NOS与NADPH-d的分布和活性均是一致的，因此NADPH-d组化染色可作为研究组织中NOS分布和活性的一种手段。其原理在于，NOS的C端可将NADPH的电子传递至硝基四唑氮蓝(NBT)，并将底物NBT还原成不溶性紫蓝色沉淀，此结果即称NOS阳性反应[8]。
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本研究发现，肝硬化大鼠胃底上皮细胞、小动脉、小静脉NOS呈阳性反应，而正常SD大鼠则呈阴性反应，说明肝硬化时胃粘膜及动、静脉血管合成NO增加，而NO作为强烈的血管内皮舒张因子无疑在胃粘膜血管扩张、血流量增加乃至充血反应中发挥病理生理学作用。我们应用57Co核素标记微球技术对其血流动力学检测发现，肝硬化大鼠胃粘膜血流量明显高于对照组[分别为(0.881±0.065)和(0.544±0.045)ml.min-1.g-1；P<0.01)]，这似乎可以解释门脉高压性胃病，即“充血性胃病”的发病与之有关。NO除直接舒张血管平滑肌外，尚具细胞毒性，NOS的过度表达在某种程度上可能也参与胃粘膜的损伤。
总之，内源性NO在肝硬化大鼠血流动力学改变及门脉高压性胃病的形成中具有致病作用。
参考文献
1 Nagasawa M, Kawasaki T, Yoshimi T. Effects of calcium antagonists on h apatic and systemic hemodynamics in awaken portal hypertensive rats. J Gastroent erol, 1996;31:366-372.
, http://www.100md.com
2 Groszmann RJ, Vorobioff J, Riley E, et al. Splanchnic hemodynamics in p ortal-hypertensive rats:measurement with γ-labeled microspheres. Am J Physiol , 1982;242:G156-G160.
3 Benoit JN, Womack WA, Hernandez L, et al. “Forward” and “Backward” flow mechanisms of portal hypertension relative contributions in the rat model of portal vein stenosis. Gastroenterology, 1985,89:1092-1096.
4 Tanoue K, Ohta M, Tarnawski AS, et al. Portal hypertension activates t he nitric oxide synthase gene in the esophageal mucosa of rats. Gastroenterolog y, 1996, 110:549-557.
, http://www.100md.com
5 Damiani P, Burini G. Fluorometric determination of nitrite. Talanta, 1 986,33:649-652.
6 Beasley JE. Histochemical methods for detecting nitric oxide synthase. Histochem J, 1995,27:757-769.
7 Dawson TM, Bredt DS, Fotubi M, et al. Nitric oxide synthase and neuron al NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Aca d Sci USA, 1991,88:7707-7801.
8 Norris PJ, Charles IG, Scorer CA, et al. Studies on the localization a nd expression of nitric oxide synthase using histochemical techniques. Histochem J, 1995;27:745-756.
(收稿：1997-11-25 修回：1998-12-03), 百拇医药
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院，上海市消化疾病研究所；(黄颖秋，现在辽宁省本钢总医院消化科工作)
关键词：一氧化氮；肝硬化大鼠；门脉高压性胃病；血流动力学
大鼠实验性门脉高压循环动力状态及 一氧化氮的改变 【摘要】 目的 探讨一氧化氮(NO)在肝硬化血流动力学改变及门脉高压性胃病中的作用。方法 用60%四氯化碳皮下注射制造肝硬化门脉高压大鼠模型；应用57Co核素标记微球检测肝硬化大鼠血流动力学参数；应用还原型辅酶Ⅱ-黄递梅(NADPH-d)组化染色观察肝硬化大鼠胃壁一氧化氮合酶(NOS)分布；应用荧光法测定血清NO含量。结果 肝硬化大鼠均伴门脉高压，且全部出现高动力循环状态；肝硬化大鼠胃粘膜NOS呈阳性反应，血清NO含量显著高于对照组。结论 一氧化氮可能参与肝硬化血流动力学异常及门脉高压性胃病的致病机制。
, 百拇医药
Hyperdynamic circulatory status and nitricoxide
concentration changes in experi mental
cirrhotic rats with portal hypertension.
HUANG Yingqiu, XIAO Shudong, ZHANG Dezhong, et al.
Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital,Shanghai Second Medic al University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To investigate the effects of nitric oxide (NO) on the hemodynamic changes and p rotal hypertensive gastropathy in cirrhotic rats. Methods Cirrhotic rat models were made by injection of 60% oil y solution of CCl4 subcutaneously. Hemodynamics parameters were determined in c irrhotic rats and controls by using 57Co-lablled microsphere techniqu e. The distribution of nitric oxide synthase (NOS) in gastric wall of rats with c irrhosis were studied by using NADPH-diaphorase (NADPH-d) histochemical method ; In addition, serum NO concentration was measured with a fluorometric assay.Results Hyperdynamic circulatory status associated with protal hypertension was observed in all cirrhotic rats. There was also a NOS-positive statining area in gastric mucosa. Serum NO concentration in cirrhotic rats were significantly higher than that in normal control.Conclusion NO may play a pathophysiologic role in the developm ent of hemodynamic changes of cirrhosis and portal hypertensive gastropathy.(Shanghai Med J, 1999,22∶463-465)
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【Key words】 Nitric oxide Cirrhotic rat Portal hy pertensive gastropathy Hemodynamics
肝硬化大鼠血流动力学参数，用NADPH-d组化染色观察大鼠胃壁中的NOS分布，旨在探讨NO在此病变中的致病机制。
材料和方法
一、肝硬化模型制备
雄性SD大鼠，皮下注射60%CCl4油性溶液，0.3ml/100g，每4天注射一次(首次倍量)，共计24次，同时以10%乙醇代替饮水。模型建立后，随机取8只作为肝硬化组。另取同批正常SD大鼠8只作为对照组。
二、血流动力学研究方法[1,2]
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盐酸氯氨酮肌肉麻醉，固定大鼠于恒温手术台上，从右股动脉插入一根PE50导管至腹主动脉，导管经换能器连于生理监护仪(Lifescope6)；从右股静脉插入一根PE50导管至下腔静脉；从右颈总动脉插入一根PE50导管至左心室；左上腹部纵行切口1.5～2.0cm，轻拉脾脏至切口外。稳定10分钟后，记录平均动脉压(MAP)；用4号头皮针(经换能器连于监护仪)刺入脾实质内记录平均脾髓压，以此代表门静脉压力(PP)[3](脾髓压约等于门脉压)；从右颈总动脉导管注入大约5万个57Co标记微球(直径15±0.6μm)，注入前10秒钟开始从右股动脉导管抽取参考血样，以1ml/min的速度恒速抽血70秒钟；从右股静脉导管采血2ml，低温分离血清，置-70°C贮存备检；上述操作结束后15分钟，处死动物，迅速取全层胃底组织少许置入液氮速冻，再取中叶小块肝组织置10%甲醛液中固定，备作形态学检查，然后取出胃、脾、胰、肾、肠和肠系膜分别称重，切成小块分置于γ-计数管内，用γ计数仪测定放射活性(每分钟脉冲数)。
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三、血流动力学指标计算方法
门静脉血流量(PVI)=胃+脾+肠+肠系膜+胰腺血流量
内脏血管阻力(SVR)和门静脉阻力(PVR)计算公式为：
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四、NADPH-d组化染色[4]
自液氮中取出胃底组织标本，立即置入内含4%多聚甲醛、0.4%苦味酸的0.16mol/LPBS(pH6.9)中固定4小时。然后移入内含10%蔗糖的0.1mol/LPBS(pH7.2)中，4°C过夜。-20°C恒冷切片机连续切片6～8张，厚度10μm。以0.01mol/LPBS漂洗切片，然后置于含下列试剂的PBS(pH8.0,37°C)中孵育40分钟：0.3%TritonX-100,0.5mmol/LNBT,1.0mmol/Lβ-NADPH。然后将切片置于0.01mol/LPBS(pH7.4)中终止反应。乙醇梯度脱水、透明及封片。
五、血清NO测定[5]
取血清0.5ml加20%磺基水杨酸钠溶液100μl，混匀，静止10分钟，5000转/分离心5分钟，取上清0.25ml加入蒸馏水至1ml，加入2.3-二氨基萘盐酸溶液0.5ml混匀，20°C反应10分钟，加入2.8mol/LNaOH溶液0.1ml终止反应，在F-4000荧光分光光度计上以激发波长365nm，发射波长420nm,狭缝3nm测相对荧光强度(F值)，以亚硝酸钠(NaNO2)溶液作标准曲线，计算血清中的NO-2/NO-3浓度，以此代表NO含量。
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六、肝脏组织学检查
常规10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏形态学改变。
七、统计学处理
结果以x±s表示，行配对t检验。P<0.05有统计学意义。
结果
一、大鼠肝硬化造模成功，光镜示肝细胞再生、纤维组织增生及假小叶形成。
二、血流动力学检测发现，与对照组比较，肝硬化组MAP和SVR显著降低，CO、CI及PP显著升高(表1)。
表1 血流动力学指标
项目
, 百拇医药
正常对照组
肝硬化组
MAP(kPa)
17.05±0.34
14.42±0.47*
PP(kPa)
1.123±0.096
1.665±0.067*
CO(ml/min)
135.5±3.55
189.99±9.26*
, 百拇医药
CI(ml.min-1.100gBW-1)
39.68±1.64
55.89±1.82*
PVI(ml.min-1.100gBW-1)
3.762±0.094
4.295±0.155*
SVR(kPa.ml-1.min-1.
100gBW-1)
, 百拇医药
4.234±0.118
2.974±0.186*
PVR(kPa.ml-1.min-1.
100gBW-1)
0.299±0.026
0.388±0.011*
与对照组比较：*P<0.01
三、肝硬化组除脾脏血流量降低外，其余内脏器官血流量均高于对照组(P<0.01)(表2)。
表2 内脏器官血流量(ml.min-1.g-1)
, 百拇医药
器官
正常对照组
肝硬化组
胃
0.544±0.045
0.881±0.065*
脾
0.946±0.060
0.725±0.057*
胰
0.819±0.031
0.998±0.055*
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肠和肠系膜
1.451±0.037
1.686±0.057*
肾
0.465±0.038
0.686±0.046*
与对照组比较：*P<0.01 四、肝硬化组血清NO含量显著高于对照组
正常对照组NO-2/NO-3含量为(0.532±0.257)μmol/L,肝硬化组为(4.204±1.253)μmol/L，两组比较P<0.01。
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讨论
门脉高压性胃病为门脉高压状态下的一种胃粘膜病变，主要表现为粘膜和粘膜下的血管扩张，而组织学上无明显炎症。其特异性改变为胃粘膜的樱桃红样斑点。有研究发现，此病变局限于胃底者占65%而累及全胃者仅占29%，这可能是肝硬化失代偿期上消化道出血的又一因素。NO作为强烈的内皮源性舒张因子，在肝硬化的血流动力学改变中发挥作用，但其与门脉高压性胃病的关系却知之甚少。NO由其唯一限速酶NOS介导产生，因此NOS已成为研究NO的一种手段。NADPH-d染色是通过确定NOS相关酶，间接反应NOS活性的一种组织化学方法[6]。Dawson等[7]等采用免疫组化和NADPH-d组化方法证实无论在神经系统还是非神经系统中NOS与NADPH-d的分布和活性均是一致的，因此NADPH-d组化染色可作为研究组织中NOS分布和活性的一种手段。其原理在于，NOS的C端可将NADPH的电子传递至硝基四唑氮蓝(NBT)，并将底物NBT还原成不溶性紫蓝色沉淀，此结果即称NOS阳性反应[8]。
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本研究发现，肝硬化大鼠胃底上皮细胞、小动脉、小静脉NOS呈阳性反应，而正常SD大鼠则呈阴性反应，说明肝硬化时胃粘膜及动、静脉血管合成NO增加，而NO作为强烈的血管内皮舒张因子无疑在胃粘膜血管扩张、血流量增加乃至充血反应中发挥病理生理学作用。我们应用57Co核素标记微球技术对其血流动力学检测发现，肝硬化大鼠胃粘膜血流量明显高于对照组[分别为(0.881±0.065)和(0.544±0.045)ml.min-1.g-1；P<0.01)]，这似乎可以解释门脉高压性胃病，即“充血性胃病”的发病与之有关。NO除直接舒张血管平滑肌外，尚具细胞毒性，NOS的过度表达在某种程度上可能也参与胃粘膜的损伤。
总之，内源性NO在肝硬化大鼠血流动力学改变及门脉高压性胃病的形成中具有致病作用。
参考文献
1 Nagasawa M, Kawasaki T, Yoshimi T. Effects of calcium antagonists on h apatic and systemic hemodynamics in awaken portal hypertensive rats. J Gastroent erol, 1996;31:366-372.
, http://www.100md.com
2 Groszmann RJ, Vorobioff J, Riley E, et al. Splanchnic hemodynamics in p ortal-hypertensive rats:measurement with γ-labeled microspheres. Am J Physiol , 1982;242:G156-G160.
3 Benoit JN, Womack WA, Hernandez L, et al. “Forward” and “Backward” flow mechanisms of portal hypertension relative contributions in the rat model of portal vein stenosis. Gastroenterology, 1985,89:1092-1096.
4 Tanoue K, Ohta M, Tarnawski AS, et al. Portal hypertension activates t he nitric oxide synthase gene in the esophageal mucosa of rats. Gastroenterolog y, 1996, 110:549-557.
, http://www.100md.com
5 Damiani P, Burini G. Fluorometric determination of nitrite. Talanta, 1 986,33:649-652.
6 Beasley JE. Histochemical methods for detecting nitric oxide synthase. Histochem J, 1995,27:757-769.
7 Dawson TM, Bredt DS, Fotubi M, et al. Nitric oxide synthase and neuron al NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Aca d Sci USA, 1991,88:7707-7801.
8 Norris PJ, Charles IG, Scorer CA, et al. Studies on the localization a nd expression of nitric oxide synthase using histochemical techniques. Histochem J, 1995;27:745-756.
(收稿：1997-11-25 修回：1998-12-03), 百拇医药