RP-HPLC法测定丹参培养物中两种水溶性酚酸类化合物的含量△
作者：黄炼栋* 徐寅泽** 胡之璧
单位：上海中医药大学生物工程研究室 200032
关键词：HPLC；丹参培养物；迷迭香酸；紫草酸B
中草药990907 摘 要 用RP-HPLC法对丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B进行了定量分析。在Nova pak C18色谱柱上，以MeOH-MeCN-H2O (37∶1∶62)，甲酸调节pH至2.67为流动相，2组分分离完全，工作曲线线性良好。迷迭香酸在0.661～5.510μg、紫草酸B在0.601～5.010μg范围内均呈线性关系，回收率分别为100.5%(RSD2.82%)和100.2%(RSD 2.53%)。
Determination of the Contents of Two Water Soluble Phenolic Acids
, http://www.100md.com
in Den-shen (Salvia miltiorrhiza) Cultures by RP-HPLC
Huang Liandong, Xu Yanze and Hu Zhibi
(Laboratory of Chinese Materia Medica & Bioengineering, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Shanghai 200032)
Abstract A RP-HPLC method was established for the simultaneous separation and determination of rosmarinic acid and lithospermic acid B in Salvia miltiorrhiza Bunge cultures on a Novapak C18 column, employing MeOH-MeCN-H2O (37∶1∶62) adjusted to pH 2.67 with formic acid as the mobile phase. The recoveries were 100.5%, RSD 2.82% for rosmarinic acid and 100.2%, RSD 2.53% for lithospermic acid B.
, 百拇医药
Key words Salvia miltiorrhiza culture rosmarinic acid lithospermic acid B
丹参Salvia miltiorrhiza Bunge 是我国重要的常用中药，其水溶性成分，如迷迭香酸、紫草酸B具有清热、解毒、消炎、抗脂质过氧化、抗胃溃疡、抗肝纤维化等作用[1，2]。由于丹参野生资源日益减少，栽培品种退化严重，因此探讨丹参新资源已成为中药材生物技术的重要研究内容[3]。作者用HPLC法对丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B进行定量分析，此法分离完全、测定快速、灵敏度高。
1 仪器与试剂
HPLC仪：Waters 510型泵，991二极管矩阵检测器。Nova pak C18(150 mm×4 mm, 4 μm)色谱柱(大连依利特科学仪器有限公司)。
, 百拇医药
甲醇为重蒸，乙腈为HPLC级，水为无离子水，其余试剂均为分析纯。
对照品迷迭香酸购于美国ICN Pharmaceuticals 公司，紫草酸B由我校肝病研究所刘平教授赠送。
2 方法
2.1 液相色谱条件：流动相：甲醇-乙腈-水(37∶1∶62)，甲酸调节pH值至2.67。检测波长280 nm，纸速2.5 mm/min。在本条件下，迷迭香酸和紫草酸B获得较好的分离效果(图1)。
1-迷迭香酸 2-紫草酸B
图1 高效液相色谱图
2.2 精密度试验：①取同一丹参细胞培养物(50 mg)提取液样品进行6次进样，每次20 μL，求得迷迭香酸的变异系数RSD为2.42%，紫草酸B为2.53%。②取同一丹参细胞培养物(50 mg)，按样品测定方法8次进样测定。求得迷迭香酸的RSD为2.44%，紫草酸B为3.34%。
, 百拇医药
2.3 标准曲线：在高精密度(0.001 mg)天平上，分别精密称取2种对照品各一定量，置于5 mL容量瓶中，60%丙酮溶解至刻度，摇匀，即得对照品液。
用微量进样器分别吸取不同体积的对照品溶液进样。微机给出校正曲线。各标准曲线及相关系数为迷迭香酸：Y=0.0230X+2.3102×10-4,r=0.9996,线性范围0.6612～5.5100 μg；紫草酸B为Y=0.0146X-3.7526×10-4，r=0.9995，线性范围0.6010～5.0100 μg。
2.4 提取方法：精密称取约50 mg冻干丹参培养物于20 mL磨口具塞试管中，加入60%丙酮10 mL，超声提取30 min。先用定量滤纸过滤(杭州富阳特种纸厂)，再用样品过滤器(孔径0.45 μm，天津开发富集色谱技术发展公司)过滤，滤液作HPLC测定。
2.5 加样回收率试验：精密称取一定量冻干培养物，精密加入一定量标准品，按以上方法进行定量分析，将测定结果扣除各组分的平均含量，回收率为迷迭香酸100.5%，RSD 2.82%；紫草酸B为100.2%，RSD 2.53%。
, 百拇医药
2.6 样品测定：按上述提取方法和色谱方法进行测定。用所得标准曲线进行定量分析。微机给出样品浓度M(mg/mL)，按下式求得2种水溶性酚酸类化合物的含量(C%)。
M-微机给出的样品浓度(mg/mL)，W-培养物的准确称样量(mg)。
3 结果和讨论
3.1 各种培养物中水溶性酚酸类化合物含量测定结果：见表1。
表1 丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B含量(n=3) 培养物
迷迭香酸(%干重)
紫草酸B(%繲重)
激素自养型细胞
2.8144±0.3859
, 百拇医药
0
培养细胞①
5.8536±0.7216
6.5449±0.1412
培养细胞②
1.5190±0.0934
0.2400±0.0184
培养芽
1.7145±0.0429
0
毛状根15834*
1.1228±0.0786
, 百拇医药
0.9777±0.0782
毛状根9402*
0
0
*毛状根15834和毛状根9402分别由菌种Agrobacterium rhizogenes LBA 9402和ATCC 15834感染而来。
结果表明，不同丹参培养物中水溶性酚酸类化合物的含量各不相同。在毛状根9402中2种酚酸类化合物均未检测到，但在丹参细胞培养物①中，迷迭香酸和紫草酸B都存在，而且含量较高，均超出了李静等[4]报道的丹参生药中的含量[迷迭香酸1.94%，紫草酸B(丹酚酸B)3.17%]。
3.2 长期放置对丹参细胞培养物中水溶性酚酸类化合物含量的影响：把冻干丹参细胞培养物分别进行立即测定和在干燥器中放置5个月后再次测定2种酚酸类化合物的含量，结果表明丹参细胞培养物中迷迭香酸和紫草酸B含量下降，见表2。
, 百拇医药
表2 长期放置对丹参细胞物中迷迭香
酸和紫草酸B含量的影响(n=3) 放置时间
迷迭香酸
紫草酸B
迷迭香酸
紫草酸B
(月)
(%干重)
(%干重)
损失率(%)
损失率(%)
0
, http://www.100md.com
5.8536±0.7216
6.5449±0.1412
5
3.1474±0.4530
5.2153±0.7460
46.23
20.31
由于长期放置会影响酚酸类化合物的含量，所以对丹参培养物应及时测定。
参考文献
1 张白嘉，等.中草药，1996，27(10)：634
2 刘 平，等.中国医药学报，1993，8(增)：55
3 胡之璧，等.上海中医药大学上海中医药研究院学报，1997，10(2)～11(1)：94
4 李 静，等.药学学报，1993，28(7)：543
收稿日期：1999-04-06, 百拇医药(作者：黄炼栋* 徐寅泽** 胡之璧)
单位：上海中医药大学生物工程研究室 200032
关键词：HPLC；丹参培养物；迷迭香酸；紫草酸B
中草药990907 摘 要 用RP-HPLC法对丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B进行了定量分析。在Nova pak C18色谱柱上，以MeOH-MeCN-H2O (37∶1∶62)，甲酸调节pH至2.67为流动相，2组分分离完全，工作曲线线性良好。迷迭香酸在0.661～5.510μg、紫草酸B在0.601～5.010μg范围内均呈线性关系，回收率分别为100.5%(RSD2.82%)和100.2%(RSD 2.53%)。
Determination of the Contents of Two Water Soluble Phenolic Acids
, http://www.100md.com
in Den-shen (Salvia miltiorrhiza) Cultures by RP-HPLC
Huang Liandong, Xu Yanze and Hu Zhibi
(Laboratory of Chinese Materia Medica & Bioengineering, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Shanghai 200032)
Abstract A RP-HPLC method was established for the simultaneous separation and determination of rosmarinic acid and lithospermic acid B in Salvia miltiorrhiza Bunge cultures on a Novapak C18 column, employing MeOH-MeCN-H2O (37∶1∶62) adjusted to pH 2.67 with formic acid as the mobile phase. The recoveries were 100.5%, RSD 2.82% for rosmarinic acid and 100.2%, RSD 2.53% for lithospermic acid B.
, 百拇医药
Key words Salvia miltiorrhiza culture rosmarinic acid lithospermic acid B
丹参Salvia miltiorrhiza Bunge 是我国重要的常用中药，其水溶性成分，如迷迭香酸、紫草酸B具有清热、解毒、消炎、抗脂质过氧化、抗胃溃疡、抗肝纤维化等作用[1，2]。由于丹参野生资源日益减少，栽培品种退化严重，因此探讨丹参新资源已成为中药材生物技术的重要研究内容[3]。作者用HPLC法对丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B进行定量分析，此法分离完全、测定快速、灵敏度高。
1 仪器与试剂
HPLC仪：Waters 510型泵，991二极管矩阵检测器。Nova pak C18(150 mm×4 mm, 4 μm)色谱柱(大连依利特科学仪器有限公司)。
, 百拇医药
甲醇为重蒸，乙腈为HPLC级，水为无离子水，其余试剂均为分析纯。
对照品迷迭香酸购于美国ICN Pharmaceuticals 公司，紫草酸B由我校肝病研究所刘平教授赠送。
2 方法
2.1 液相色谱条件：流动相：甲醇-乙腈-水(37∶1∶62)，甲酸调节pH值至2.67。检测波长280 nm，纸速2.5 mm/min。在本条件下，迷迭香酸和紫草酸B获得较好的分离效果(图1)。
1-迷迭香酸 2-紫草酸B
图1 高效液相色谱图
2.2 精密度试验：①取同一丹参细胞培养物(50 mg)提取液样品进行6次进样，每次20 μL，求得迷迭香酸的变异系数RSD为2.42%，紫草酸B为2.53%。②取同一丹参细胞培养物(50 mg)，按样品测定方法8次进样测定。求得迷迭香酸的RSD为2.44%，紫草酸B为3.34%。
, 百拇医药
2.3 标准曲线：在高精密度(0.001 mg)天平上，分别精密称取2种对照品各一定量，置于5 mL容量瓶中，60%丙酮溶解至刻度，摇匀，即得对照品液。
用微量进样器分别吸取不同体积的对照品溶液进样。微机给出校正曲线。各标准曲线及相关系数为迷迭香酸：Y=0.0230X+2.3102×10-4,r=0.9996,线性范围0.6612～5.5100 μg；紫草酸B为Y=0.0146X-3.7526×10-4，r=0.9995，线性范围0.6010～5.0100 μg。
2.4 提取方法：精密称取约50 mg冻干丹参培养物于20 mL磨口具塞试管中，加入60%丙酮10 mL，超声提取30 min。先用定量滤纸过滤(杭州富阳特种纸厂)，再用样品过滤器(孔径0.45 μm，天津开发富集色谱技术发展公司)过滤，滤液作HPLC测定。
2.5 加样回收率试验：精密称取一定量冻干培养物，精密加入一定量标准品，按以上方法进行定量分析，将测定结果扣除各组分的平均含量，回收率为迷迭香酸100.5%，RSD 2.82%；紫草酸B为100.2%，RSD 2.53%。
, 百拇医药
2.6 样品测定：按上述提取方法和色谱方法进行测定。用所得标准曲线进行定量分析。微机给出样品浓度M(mg/mL)，按下式求得2种水溶性酚酸类化合物的含量(C%)。
M-微机给出的样品浓度(mg/mL)，W-培养物的准确称样量(mg)。
3 结果和讨论
3.1 各种培养物中水溶性酚酸类化合物含量测定结果：见表1。
表1 丹参培养物中迷迭香酸和紫草酸B含量(n=3) 培养物
迷迭香酸(%干重)
紫草酸B(%繲重)
激素自养型细胞
2.8144±0.3859
, 百拇医药
0
培养细胞①
5.8536±0.7216
6.5449±0.1412
培养细胞②
1.5190±0.0934
0.2400±0.0184
培养芽
1.7145±0.0429
0
毛状根15834*
1.1228±0.0786
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0.9777±0.0782
毛状根9402*
0
0
*毛状根15834和毛状根9402分别由菌种Agrobacterium rhizogenes LBA 9402和ATCC 15834感染而来。
结果表明，不同丹参培养物中水溶性酚酸类化合物的含量各不相同。在毛状根9402中2种酚酸类化合物均未检测到，但在丹参细胞培养物①中，迷迭香酸和紫草酸B都存在，而且含量较高，均超出了李静等[4]报道的丹参生药中的含量[迷迭香酸1.94%，紫草酸B(丹酚酸B)3.17%]。
3.2 长期放置对丹参细胞培养物中水溶性酚酸类化合物含量的影响：把冻干丹参细胞培养物分别进行立即测定和在干燥器中放置5个月后再次测定2种酚酸类化合物的含量，结果表明丹参细胞培养物中迷迭香酸和紫草酸B含量下降，见表2。
, 百拇医药
表2 长期放置对丹参细胞物中迷迭香
酸和紫草酸B含量的影响(n=3) 放置时间
迷迭香酸
紫草酸B
迷迭香酸
紫草酸B
(月)
(%干重)
(%干重)
损失率(%)
损失率(%)
0
, http://www.100md.com
5.8536±0.7216
6.5449±0.1412
5
3.1474±0.4530
5.2153±0.7460
46.23
20.31
由于长期放置会影响酚酸类化合物的含量，所以对丹参培养物应及时测定。
参考文献
1 张白嘉，等.中草药，1996，27(10)：634
2 刘 平，等.中国医药学报，1993，8(增)：55
3 胡之璧，等.上海中医药大学上海中医药研究院学报，1997，10(2)～11(1)：94
4 李 静，等.药学学报，1993，28(7)：543
收稿日期：1999-04-06, 百拇医药(作者：黄炼栋* 徐寅泽** 胡之璧)