血清IL-2水平在大鼠心脏移植术后早期急性排斥反应诊断中的意义
作者：赵军 沈振亚 徐五音 郑世营 马海涛 郭宏伟 杨吉成 盛伟华 李丽娥
单位：赵军 沈振亚 徐五音 郑世营 马海涛 郭宏伟 苏州医学院附属一院心胸外科，苏州，215006;杨吉成 盛伟华 李丽娥 苏州医学院基因研究室
关键词：心脏移植；大鼠，IL-2；排斥反应；免疫耐受
摘要 大鼠同种异体心脏异位移植模型实验动物分为 摘要 大鼠同种异体心脏异位移植模型实验动物分为：对照组、ALS组、CsA组及不用药组，分别于术后2、4、6天应用MTT法测定受体大鼠血清IL-2水平，并于处死后行病理组织学检查。其中ALS组为受体胸腺内注射供体脾细胞及腹腔注射ALS(抗淋巴细胞血清)移植组。实验结果：不用药组的IL-2水平较对照组、ALS组、CsA组明显增高。病理组织学检查不用药组的排斥反应明显高于其它3组。结论：受体胸腺内注射供体脾细胞同时腹腔内注射ALS可诱导产生同种异体心脏移植免疫耐受。在心脏同种异体移植排斥反应中，受体血清IL-2水平的增高可作为诊断心脏同种异体移植术后早期急性排斥反应的一个有效指标。
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中图法分类 R654.206；R617
A Preliminary Study on the Role of Serum Interleukin-2 Levels for Diagnosis of Early Acute Rejection after Rat Heart Transplantation
Zhao Jun,Shen Zhengya,Xu Wuyin，et al
(Department of Cardio-Thoracic Surgery,NO.1 Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou，215006)
Abstract This article investigated the significance of Interleukin-2 levels in serum for diagnosis of early acute rejection in rat models of heterotopic heart transplantation.Methods:The measurements of IL-2 in serum of rats by MTT method were taken on the 2rd,4th,6th days respectively after operation.Result:The result of this study with histological examination shows that IL-2 serum levels were increased during acute rejection episodes.Conclusion:IL-2 serum levels might be a useful indicator for diagnosis of allograft rejection.
, 百拇医药
Key Words Interleukin-2;rejection;heart;transplantation
近年研究发现[1]，IL-2在一定程度上可预示肾脏、肝脏、心脏等移植术后早期急性排斥反应的发生。本研究通过测定心脏移植术后大鼠血清IL-2水平，结合病理组织学改变，探讨IL-2水平在早期急性排斥反应中的变化和意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物：供体为Wistar雄性健康大鼠，体重150-250g;受体为健康雄性SD大鼠，体重200-250g。实验动物由苏州医学院实验动物中心提供。
1.2 异位心脏移植术：在胸腺注射供体脾细胞和腹腔注射ALS后21天行心脏异位移植。按陈忠华[2]术式作大鼠腹腔异位心脏移植。
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1.3 实验分组：分为4组：①对照组：(n=5),供受体均为SD大鼠，术前后不应用药物；②ALS组：(n=5),受体为移植前21天用ALS和供体脾细胞预处理的SD大鼠，供体为Wistar大鼠；③CsA组(n=5)，受体为SD大鼠，供体为Wistar大鼠，术后第2天起CsA4mg/kg*d灌胃至第6天；④S-W组：(n=5),受体为SD大鼠，供体为Wistar大鼠，术前后均不用药。
1.4 供体脾细胞悬液制备[3]：无菌条件下取脾，碾碎后通过200目筛网，用tirs-氯化胺去除红细胞，双倍RPIM1640液恢复等渗，制成脾细胞悬液，台盼蓝染色测定细胞活性。
1.5 胸腺内预注射供体脾细胞悬液：参照Goss等[4]方法加以改进。胸腺各叶共注射2.5×107脾细胞。术中发生大出血、气胸者弃之。胸腺注射脾细胞及腹腔注射ALS21天后进行移植。
, 百拇医药
1.6 实验试剂与标本采取：①ALS(抗淋巴细胞血清)：由苏州医学院沈振亚教授提供。②CsA(瑞士山德公司产品)。③检测仪为：酶标测定仪DJ3022型(南京华东电子管厂生产)。试剂为IL-2标准品(IL-2国家标准，由中国药品生物制品检定所提供。CTLL-2细胞(由上海华新公司刘新恒教授惠赠)。④各组动物分别于术后2、4、6天采取尾血0.8～1ml，分离血清，加蛋白酶PMSF，以防止降解，置-80℃冰箱保存待测。第6天采血后即处死动物，采取供心作病理检查，确定有无排斥反应。
1.7 指标监测：
1.7.1 血清IL-2水平及含量测定：MTT测效价[5]，96孔培养板每孔中加RPMI1640全培养液与递倍稀释的待检上清，再加入细胞浓度为5×105/ml CTL细胞5ml(CTL细胞经无钙镁PBS洗涤2次，RPMI1640洗涤1次，计数后制成浓度为5×105/ml的细胞)设置0孔、对照孔与标准孔。37℃5%CO2。培养24h,加入5mg/ml MTT液10μl，6h后加入SDS-HCL100μl/L/孔100μl/L/孔，37℃过夜，用酶标仪测OD值，波长570nm,参考波长630nm，按直线回归方法计算IL-2效价，并用标准品换算成国际单位(IU/ml)。
, 百拇医药
1.7.2 心脏排斥反应组织学分级标准：[6，7]：0极：无排斥反应表现。1级：心内膜及间质水肿，血管周围轻度单核细胞浸润，心内膜下有少量单个核细胞浸润。2级：间质水肿加重，血管周围，心内膜下及间质内单核细胞浸润，心肌细胞出现变性，有少量小灶坏死。3级：血管周围，心内膜下及间质中度单核细胞浸润，有明显的心肌灶状坏死。4级：间质及血管周围重度单核细胞浸润，混有部分中性粒细胞，间质内出血及大片心肌细胞坏死，冠状动脉中血栓形成，血管壁纤维素样坏死。
1.8 统计学处理：实验结果采用t检验及方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 病理组织学检查：心脏移植术后第6天，各组移植心排斥反应的组织学分级结果见表1。由组织学分级结果可见，对照组、ALS组及CsA组的排斥反应程度明显低于S-W组(P<0.05)。而ALS组，CSA组与对照组间差异无显著意义，说明ALS组与CsA组均产生免疫耐受。各组病理学检查未见感染迹象。
, 百拇医药
表1 移植心排斥反应组织学分级
组别
n
移植心脏排斥反应分级
P
对照组
5
0. 0. 0. 0. 1.
ALS组
5
0. 1. 1. 1. 2.
>0.05
, 百拇医药 CsA组
5
0. 1. 1. 2. 2.
>0.05
S-W组
5
4. 4. 4. 4. 3.
<0.05
ALS组、CSA组与S-W组比较P<0.05
2.2 血清IL-2检测结果：各组术后第2、4、6天血清IL-2水平见表2。
表2 术后第2、4、6天血清IL-2的浓度(IU/ml，
±s)
, 百拇医药
组别
n
术后天数
2
4
6
对照组
5
52.06±3.17
56.98±2.24
55.87±4.39
ALS组
5
, 百拇医药
58.43±5.46
67.32±7.29
71.84±8.72
CsA组
5
61.28±4.79
69.03±4.46
72.61±5.62
S-W组
5
107.17±3.02
109.22±5.43
, 百拇医药
117.34±4.76
3 讨论
自Morgan[8]等人发现IL-2以来，对IL-2的理化性质和生物学功能研究充分肯定了它在参与机体免疫的调节作用。IL-2是诱导Tc细胞发挥杀伤效应的必需因子，并对Tc细胞杀伤效应有增加作用，IL-4、IL-6等可协同IL-2诱导CTL形成并增强其杀伤效应；IL-2可增强单核巨噬细胞的分泌功能和促进NK细胞的增殖并增强此两种细胞的杀伤活性和杀伤功能。IL-2还可作用于T细胞本身，促进T细胞对其自身的增殖。IL-2尚可诱导T细胞分泌：IFN-r、TNF、CSF等各种细胞因子。根据被排斥组织局部有高浓度淋巴因子存在的事实，Rogers等[9]的研究表明，局部高浓度IL-2有利于前体Tc细胞的生长和Tc细胞的形成。而上述细胞及因子在机体免疫反应过程中均起重要作用。近年研究发现，IL-2在一定程度上可预示早期急性排斥反应的发生。
, 百拇医药
本实验研究在建立大鼠同种异体心脏异位移植模型的基础上，连续测定各实验组血清中IL-2的含量，并结合病理组织学检查，以探讨IL-2和急性排斥反应的关系，结果：对照组心脏移植术中，2、4、6天IL-2血清含量均呈较低水平表达，组织学检查仅见轻度单核细胞浸润，未见到明显的排斥反应征象。在CsA组中，由于应用免疫抑制剂CsA，心脏移植物产生了免疫耐受，该组织学检查仅呈早期轻度的排斥反应，而且IL-2亦呈低水平表达，与对照组相比无显著差异。ALS组中，应用移植前21天受体胸腺预注射供体脾细胞，并用ALS清除受体外周成熟淋巴细胞的方法，成功地诱导了免疫耐受，使得组织学检查仅呈现早期轻度的排斥反应，血清IL-2含量亦呈低水平表达，与对照组、CsA组无明显差别。S-W组：IL-2含量在术后2、4、6天均明显增高、术后第6天的组织学检查均呈现强烈的排斥反应。与对照组、ALS组、CSA组有显著性差异。本实验结果表明：受体胸腺内注射供体脾细胞同时腹腔内注射ALS，可诱导产生同种异体心脏移植免疫耐受。IL-2和急生排斥反应密切相关。我们认为，术后动态监测移植受体血清IL-2水平可作为诊断早期同种异体心脏移植物被排斥的有效指标之一。
, 百拇医药
苏州医学院科研资金资助项目
参考文献
1 罗开.细胞因子基因表达与移植排斥反应.中华器官移植杂志，1996，17∶2
2 陈忠华，等.改进大白鼠同种异位心脏移植术.中华器官移植杂志，1982，3∶38
3 Soji F luwole,et al.Induction of donorspecific unresponsiveness to rat cardiac Allografts by intrathymic injection of UV-B-Irradiated donor spleen cells.transplantation,1993,55∶1389
4 Goss JA,et al.Donor-specific cardiac allograft tolerance without immunosupression after intrathymic injection of donor alloantigens.Transp Proc,1992，24∶5879
, 百拇医药
5 周道洪，等.测定淋巴细胞转化和鼠IL-2活性的新方法-MTT比色法.中国免疫学杂志，1986，2(1)∶39
6 Billingham ME.Endomyocardial biopsy diagnosis of acute rejection in cardiac allogafts.Prog Cardiavas Dise,1990，33(1)∶11
7 Kemnitz J,et al A classification of cardiac allograft rejection-A modification of the classification by Billingham.Am J Surg pathol,1987，11∶503
8 Morgan A.Selective in vitro growth of T lymphocytes from Normal Human Bone Marrows Science,1976，193∶1008
9 Rogers EA,et al.Lympholcine requiremnts for the development of specific cytotoxic T cells from single precusor.Eur J immunal,1991,24∶1069
(1999年6月7日收稿), http://www.100md.com
单位：赵军 沈振亚 徐五音 郑世营 马海涛 郭宏伟 苏州医学院附属一院心胸外科，苏州，215006;杨吉成 盛伟华 李丽娥 苏州医学院基因研究室
关键词：心脏移植；大鼠，IL-2；排斥反应；免疫耐受
摘要 大鼠同种异体心脏异位移植模型实验动物分为 摘要 大鼠同种异体心脏异位移植模型实验动物分为：对照组、ALS组、CsA组及不用药组，分别于术后2、4、6天应用MTT法测定受体大鼠血清IL-2水平，并于处死后行病理组织学检查。其中ALS组为受体胸腺内注射供体脾细胞及腹腔注射ALS(抗淋巴细胞血清)移植组。实验结果：不用药组的IL-2水平较对照组、ALS组、CsA组明显增高。病理组织学检查不用药组的排斥反应明显高于其它3组。结论：受体胸腺内注射供体脾细胞同时腹腔内注射ALS可诱导产生同种异体心脏移植免疫耐受。在心脏同种异体移植排斥反应中，受体血清IL-2水平的增高可作为诊断心脏同种异体移植术后早期急性排斥反应的一个有效指标。
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中图法分类 R654.206；R617
A Preliminary Study on the Role of Serum Interleukin-2 Levels for Diagnosis of Early Acute Rejection after Rat Heart Transplantation
Zhao Jun,Shen Zhengya,Xu Wuyin，et al
(Department of Cardio-Thoracic Surgery,NO.1 Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou，215006)
Abstract This article investigated the significance of Interleukin-2 levels in serum for diagnosis of early acute rejection in rat models of heterotopic heart transplantation.Methods:The measurements of IL-2 in serum of rats by MTT method were taken on the 2rd,4th,6th days respectively after operation.Result:The result of this study with histological examination shows that IL-2 serum levels were increased during acute rejection episodes.Conclusion:IL-2 serum levels might be a useful indicator for diagnosis of allograft rejection.
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Key Words Interleukin-2;rejection;heart;transplantation
近年研究发现[1]，IL-2在一定程度上可预示肾脏、肝脏、心脏等移植术后早期急性排斥反应的发生。本研究通过测定心脏移植术后大鼠血清IL-2水平，结合病理组织学改变，探讨IL-2水平在早期急性排斥反应中的变化和意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物：供体为Wistar雄性健康大鼠，体重150-250g;受体为健康雄性SD大鼠，体重200-250g。实验动物由苏州医学院实验动物中心提供。
1.2 异位心脏移植术：在胸腺注射供体脾细胞和腹腔注射ALS后21天行心脏异位移植。按陈忠华[2]术式作大鼠腹腔异位心脏移植。
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1.3 实验分组：分为4组：①对照组：(n=5),供受体均为SD大鼠，术前后不应用药物；②ALS组：(n=5),受体为移植前21天用ALS和供体脾细胞预处理的SD大鼠，供体为Wistar大鼠；③CsA组(n=5)，受体为SD大鼠，供体为Wistar大鼠，术后第2天起CsA4mg/kg*d灌胃至第6天；④S-W组：(n=5),受体为SD大鼠，供体为Wistar大鼠，术前后均不用药。
1.4 供体脾细胞悬液制备[3]：无菌条件下取脾，碾碎后通过200目筛网，用tirs-氯化胺去除红细胞，双倍RPIM1640液恢复等渗，制成脾细胞悬液，台盼蓝染色测定细胞活性。
1.5 胸腺内预注射供体脾细胞悬液：参照Goss等[4]方法加以改进。胸腺各叶共注射2.5×107脾细胞。术中发生大出血、气胸者弃之。胸腺注射脾细胞及腹腔注射ALS21天后进行移植。
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1.6 实验试剂与标本采取：①ALS(抗淋巴细胞血清)：由苏州医学院沈振亚教授提供。②CsA(瑞士山德公司产品)。③检测仪为：酶标测定仪DJ3022型(南京华东电子管厂生产)。试剂为IL-2标准品(IL-2国家标准，由中国药品生物制品检定所提供。CTLL-2细胞(由上海华新公司刘新恒教授惠赠)。④各组动物分别于术后2、4、6天采取尾血0.8～1ml，分离血清，加蛋白酶PMSF，以防止降解，置-80℃冰箱保存待测。第6天采血后即处死动物，采取供心作病理检查，确定有无排斥反应。
1.7 指标监测：
1.7.1 血清IL-2水平及含量测定：MTT测效价[5]，96孔培养板每孔中加RPMI1640全培养液与递倍稀释的待检上清，再加入细胞浓度为5×105/ml CTL细胞5ml(CTL细胞经无钙镁PBS洗涤2次，RPMI1640洗涤1次，计数后制成浓度为5×105/ml的细胞)设置0孔、对照孔与标准孔。37℃5%CO2。培养24h,加入5mg/ml MTT液10μl，6h后加入SDS-HCL100μl/L/孔100μl/L/孔，37℃过夜，用酶标仪测OD值，波长570nm,参考波长630nm，按直线回归方法计算IL-2效价，并用标准品换算成国际单位(IU/ml)。
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1.7.2 心脏排斥反应组织学分级标准：[6，7]：0极：无排斥反应表现。1级：心内膜及间质水肿，血管周围轻度单核细胞浸润，心内膜下有少量单个核细胞浸润。2级：间质水肿加重，血管周围，心内膜下及间质内单核细胞浸润，心肌细胞出现变性，有少量小灶坏死。3级：血管周围，心内膜下及间质中度单核细胞浸润，有明显的心肌灶状坏死。4级：间质及血管周围重度单核细胞浸润，混有部分中性粒细胞，间质内出血及大片心肌细胞坏死，冠状动脉中血栓形成，血管壁纤维素样坏死。
1.8 统计学处理：实验结果采用t检验及方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 病理组织学检查：心脏移植术后第6天，各组移植心排斥反应的组织学分级结果见表1。由组织学分级结果可见，对照组、ALS组及CsA组的排斥反应程度明显低于S-W组(P<0.05)。而ALS组，CSA组与对照组间差异无显著意义，说明ALS组与CsA组均产生免疫耐受。各组病理学检查未见感染迹象。
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表1 移植心排斥反应组织学分级
组别
n
移植心脏排斥反应分级
P
对照组
5
0. 0. 0. 0. 1.
ALS组
5
0. 1. 1. 1. 2.
>0.05
, 百拇医药 CsA组
5
0. 1. 1. 2. 2.
>0.05
S-W组
5
4. 4. 4. 4. 3.
<0.05
ALS组、CSA组与S-W组比较P<0.05
2.2 血清IL-2检测结果：各组术后第2、4、6天血清IL-2水平见表2。
表2 术后第2、4、6天血清IL-2的浓度(IU/ml，
±s), 百拇医药
组别
n
术后天数
2
4
6
对照组
5
52.06±3.17
56.98±2.24
55.87±4.39
ALS组
5
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58.43±5.46
67.32±7.29
71.84±8.72
CsA组
5
61.28±4.79
69.03±4.46
72.61±5.62
S-W组
5
107.17±3.02
109.22±5.43
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117.34±4.76
3 讨论
自Morgan[8]等人发现IL-2以来，对IL-2的理化性质和生物学功能研究充分肯定了它在参与机体免疫的调节作用。IL-2是诱导Tc细胞发挥杀伤效应的必需因子，并对Tc细胞杀伤效应有增加作用，IL-4、IL-6等可协同IL-2诱导CTL形成并增强其杀伤效应；IL-2可增强单核巨噬细胞的分泌功能和促进NK细胞的增殖并增强此两种细胞的杀伤活性和杀伤功能。IL-2还可作用于T细胞本身，促进T细胞对其自身的增殖。IL-2尚可诱导T细胞分泌：IFN-r、TNF、CSF等各种细胞因子。根据被排斥组织局部有高浓度淋巴因子存在的事实，Rogers等[9]的研究表明，局部高浓度IL-2有利于前体Tc细胞的生长和Tc细胞的形成。而上述细胞及因子在机体免疫反应过程中均起重要作用。近年研究发现，IL-2在一定程度上可预示早期急性排斥反应的发生。
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本实验研究在建立大鼠同种异体心脏异位移植模型的基础上，连续测定各实验组血清中IL-2的含量，并结合病理组织学检查，以探讨IL-2和急性排斥反应的关系，结果：对照组心脏移植术中，2、4、6天IL-2血清含量均呈较低水平表达，组织学检查仅见轻度单核细胞浸润，未见到明显的排斥反应征象。在CsA组中，由于应用免疫抑制剂CsA，心脏移植物产生了免疫耐受，该组织学检查仅呈早期轻度的排斥反应，而且IL-2亦呈低水平表达，与对照组相比无显著差异。ALS组中，应用移植前21天受体胸腺预注射供体脾细胞，并用ALS清除受体外周成熟淋巴细胞的方法，成功地诱导了免疫耐受，使得组织学检查仅呈现早期轻度的排斥反应，血清IL-2含量亦呈低水平表达，与对照组、CsA组无明显差别。S-W组：IL-2含量在术后2、4、6天均明显增高、术后第6天的组织学检查均呈现强烈的排斥反应。与对照组、ALS组、CSA组有显著性差异。本实验结果表明：受体胸腺内注射供体脾细胞同时腹腔内注射ALS，可诱导产生同种异体心脏移植免疫耐受。IL-2和急生排斥反应密切相关。我们认为，术后动态监测移植受体血清IL-2水平可作为诊断早期同种异体心脏移植物被排斥的有效指标之一。
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苏州医学院科研资金资助项目
参考文献
1 罗开.细胞因子基因表达与移植排斥反应.中华器官移植杂志，1996，17∶2
2 陈忠华，等.改进大白鼠同种异位心脏移植术.中华器官移植杂志，1982，3∶38
3 Soji F luwole,et al.Induction of donorspecific unresponsiveness to rat cardiac Allografts by intrathymic injection of UV-B-Irradiated donor spleen cells.transplantation,1993,55∶1389
4 Goss JA,et al.Donor-specific cardiac allograft tolerance without immunosupression after intrathymic injection of donor alloantigens.Transp Proc,1992，24∶5879
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5 周道洪，等.测定淋巴细胞转化和鼠IL-2活性的新方法-MTT比色法.中国免疫学杂志，1986，2(1)∶39
6 Billingham ME.Endomyocardial biopsy diagnosis of acute rejection in cardiac allogafts.Prog Cardiavas Dise,1990，33(1)∶11
7 Kemnitz J,et al A classification of cardiac allograft rejection-A modification of the classification by Billingham.Am J Surg pathol,1987，11∶503
8 Morgan A.Selective in vitro growth of T lymphocytes from Normal Human Bone Marrows Science,1976，193∶1008
9 Rogers EA,et al.Lympholcine requiremnts for the development of specific cytotoxic T cells from single precusor.Eur J immunal,1991,24∶1069
(1999年6月7日收稿), http://www.100md.com