解脲脲原体检测之培养法与PCR法对比研究
作者：王军 祁汝峰 徐兴娣
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：解脲脲原体；培养法；PCR
苏州医学院学报990925 摘要 应用PCR法和培养法对160例泌尿生殖道感染患者的标本进行了解脲脲原体(UU)检测。结果 两种方法的总符合率为91.2%，经卡方检验，两者的差异无统计学意义。若以培养法为标准，PCR法的敏感性和特异性分别为85.2%，95.0%，提示培养法仍应是临床首选诊断方法。
中图法分类 R711.304；R446.5
Comparison between Cultivation and PCR for Detection of Ureaplasma Urealyticum
, 百拇医药
Wang Jun,Qi Rufeng,Xu Xingdi,et al.
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract In this report we detected Ureaplasma Urealyticum(UU) in 160 specimens from patients with urogenital infection by using polymerase chain reaction and cultivation.The results showed that the coincidence rate between PCR and cultivation was 91.2% and the difference between these two methods was not statistival significant(P>0.05).Using cultivation as standard,the sensitivity and specificity of PCR were 85.2% and 95.0% respectively.It suggests that cultivation should be a method in priority in clinical diagnosis of UU at present.
, 百拇医药
Key words ureaplasma urealyticum；cultivation；PCR
近年来在性传播疾病(STD)中，非淋菌性泌尿生殖道炎症(NGU)的发病率有迅速上升趋势，而解脲脲原体(UU)是除沙眼衣原体(CT)外，引起NGU的最重要的一种病原体。UU临床症状不典型，诊断主要依据实验室检测。1998年10月～1999年5月，我室应用聚合酶链反应(PCR)法和培养法联合检测160例泌尿生殖道感染患者，并对两种方法进行了对比研究，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象：160例依其临床症状、分泌物直接涂片和淋球菌培养结果[1]，初步诊断为NGU114例，淋病46例，其中男131例，女29例。
1.2 实验方法：标本采集：按常规方法男性取尿道分泌物，女性取宫颈分泌物。每例取标本3份，进行下列检测：①淋球菌培养：将标本接种于GC血琼脂培养基，置烛缸内，37℃培养24～48h，然后挑取可疑菌落做革兰染色，油镜下见到G-双球菌后再进一步做生化鉴定。②UU检验：
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1.2.1 PCR法：试剂盒由上海华美生物工程公司提供。实验操作严格按照说明书，每次实验均设阳性和阴性对照。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃、55℃、72℃各30s，反复循环35次；末次循环后72℃延伸5min。预期扩增产物为400bp。
1.2.2 培养法：标本接种UU液体培养基，置烛缸内，37℃培养24～48h，每日观察培养管颜色，由原来黄色变为粉红色或桃红色，液体澄清者可能是UU生长。然后取培养基过滤除菌后转种固体培养基加以证实，37℃烛缸培养2～4天。低倍镜下观察菌落形态，大小10～40μm的荷包蛋样菌落即为UU阳性(见附图)[2]。
附图 解脲脲原体的荷包蛋样菌落(×100)
2 结果
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2.1 PCR法和培养法UU检测结果及显示阳性率比较，见表1。
表1 PCR法和培养法UU检测结果阳性率比较[n(%)]
n
PCR法
培养法
NGU组
114
34(29.8)*
37(32.5)*
淋病组
46
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23(50.0)
24(52.2)
合计
160
57(35.6)
61(38.1)
男
131
39(29.8)**
42(32.1)**
女
29
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18(62.1)
19(65.5)
与女性组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.2 PCR法与培养法检测结果比较，见表2。PCR法与培养法检测结果比较，x2=0.64,P>0.05，差别没有统计学意义。如以培养法为标准，PCR法的敏感性为85.2%，特异性为95.0%。
表2 PCR法与培养法检测结果比较 培养法
PCR法
+
-
+
52
, 百拇医药
9
-
5
94
总符合率(%)
91.2
3 讨论
UU是一种无细胞壁、无固定形态的原核细胞型微生物，它能引起人类泌尿生殖道感染，尤其是与NGU的发生有密切关系。此外，UU可通过胎盘感染胎儿，引起早产、死胎和新生儿呼吸道感染、不孕等[3]。
PCR是一种体外扩增特异DNA片断的新技术，它可在短时间内使极微量的核酸片断扩增至数百万个拷贝，具有特异性强，灵敏度高，简便快速的优点。但操作中如果控制不好，会出现假阳性和假阴性结果。本实验的结果有9例培养阳性而PCR阴性，占实验总例数的5.6%，提示可能存在假阴性。造成假阴性的原因[4]包括：①模板提取过程不当；②标本中含有Taq酶抑制剂等。
, 百拇医药
培养法是检测UU的经典方法，也是WHO推荐诊断NGU的首选方法，操作简便，费用低廉，对实验条件要求不高。UU含有脲酶，可利用尿素为能源。培养法就是利用这一特点，将标本接种于加有尿素和酚红指示剂的液体培养基中，24～48h后如有UU生长，其脲酶可分解尿素而产生氨，使培养基pH值上升，培养液由黄色变为粉红色或桃红色。如泌尿生殖道有其他微生物(如念珠菌、变形杆菌等)感染时，亦会出现假阳性结果。必要时需用固体培养，见到典型UU菌落方可确诊，但耗时较长，不能快速诊断。
本实验证实了在淋病患者中，UU的检出率明显高于NGU患者[3]。这可能是因为淋球菌损伤泌尿生殖道粘膜有利于UU的粘附，也可能是淋病治愈后有些人仍有遗留症状的原因。因此临床医生对淋病患者的混合感染务必引起重视。
本文结果提示，女性患者UU检出率显著高于男性患者，与文献[5]报道相符，可能是因为女性泌尿生殖道解剖、生理功能的特点，更容易被UU侵犯，女性感染后症状不易明显，未引起足够重视。
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本文用PCR法和培养法同时检测UU，结果两种方法的总符合率为91.2%。以培养法为标准。PCR法的敏感性和特性性分别为85.2%和95.0%，两种方法的差别没有统计学意义，说明两法都能有效地检测UU。但PCR法如质控不好，可不同程度地存在假阳性或假阴性结果，并且需要昂贵稳定的仪器设备，做为常规诊断方法受到一定限制。所以培养法仍应是临床上的首选诊断方法。
参考文献
1 叶干运，主编.性病防治手册.第二版.南京：江苏科学技术出版社，1994∶53
2 张艳萍，等.解脲支原体培养基改良的实验室研究.临床皮肤科杂志，1997，26(5)∶290
3 陆德源，主编.医学微生物学.第四版.北京∶人民卫生出版社，1998∶167～170
4 徐晨，等.培养及PCR法检测泌尿生殖道解脲支原体比较.中国皮肤性病学杂志，1998，12(5)∶270
5 杨文林，等.523例泌尿生殖道感染者支原体培养及药敏分析.中华皮肤性病学杂志，1998，12(2)∶93
(1999年6月2日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：解脲脲原体；培养法；PCR
苏州医学院学报990925 摘要 应用PCR法和培养法对160例泌尿生殖道感染患者的标本进行了解脲脲原体(UU)检测。结果 两种方法的总符合率为91.2%，经卡方检验，两者的差异无统计学意义。若以培养法为标准，PCR法的敏感性和特异性分别为85.2%，95.0%，提示培养法仍应是临床首选诊断方法。
中图法分类 R711.304；R446.5
Comparison between Cultivation and PCR for Detection of Ureaplasma Urealyticum
, 百拇医药
Wang Jun,Qi Rufeng,Xu Xingdi,et al.
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract In this report we detected Ureaplasma Urealyticum(UU) in 160 specimens from patients with urogenital infection by using polymerase chain reaction and cultivation.The results showed that the coincidence rate between PCR and cultivation was 91.2% and the difference between these two methods was not statistival significant(P>0.05).Using cultivation as standard,the sensitivity and specificity of PCR were 85.2% and 95.0% respectively.It suggests that cultivation should be a method in priority in clinical diagnosis of UU at present.
, 百拇医药
Key words ureaplasma urealyticum；cultivation；PCR
近年来在性传播疾病(STD)中，非淋菌性泌尿生殖道炎症(NGU)的发病率有迅速上升趋势，而解脲脲原体(UU)是除沙眼衣原体(CT)外，引起NGU的最重要的一种病原体。UU临床症状不典型，诊断主要依据实验室检测。1998年10月～1999年5月，我室应用聚合酶链反应(PCR)法和培养法联合检测160例泌尿生殖道感染患者，并对两种方法进行了对比研究，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象：160例依其临床症状、分泌物直接涂片和淋球菌培养结果[1]，初步诊断为NGU114例，淋病46例，其中男131例，女29例。
1.2 实验方法：标本采集：按常规方法男性取尿道分泌物，女性取宫颈分泌物。每例取标本3份，进行下列检测：①淋球菌培养：将标本接种于GC血琼脂培养基，置烛缸内，37℃培养24～48h，然后挑取可疑菌落做革兰染色，油镜下见到G-双球菌后再进一步做生化鉴定。②UU检验：
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1.2.1 PCR法：试剂盒由上海华美生物工程公司提供。实验操作严格按照说明书，每次实验均设阳性和阴性对照。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃、55℃、72℃各30s，反复循环35次；末次循环后72℃延伸5min。预期扩增产物为400bp。
1.2.2 培养法：标本接种UU液体培养基，置烛缸内，37℃培养24～48h，每日观察培养管颜色，由原来黄色变为粉红色或桃红色，液体澄清者可能是UU生长。然后取培养基过滤除菌后转种固体培养基加以证实，37℃烛缸培养2～4天。低倍镜下观察菌落形态，大小10～40μm的荷包蛋样菌落即为UU阳性(见附图)[2]。
附图 解脲脲原体的荷包蛋样菌落(×100)
2 结果
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2.1 PCR法和培养法UU检测结果及显示阳性率比较，见表1。
表1 PCR法和培养法UU检测结果阳性率比较[n(%)]
n
PCR法
培养法
NGU组
114
34(29.8)*
37(32.5)*
淋病组
46
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23(50.0)
24(52.2)
合计
160
57(35.6)
61(38.1)
男
131
39(29.8)**
42(32.1)**
女
29
, http://www.100md.com
18(62.1)
19(65.5)
与女性组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.2 PCR法与培养法检测结果比较，见表2。PCR法与培养法检测结果比较，x2=0.64,P>0.05，差别没有统计学意义。如以培养法为标准，PCR法的敏感性为85.2%，特异性为95.0%。
表2 PCR法与培养法检测结果比较 培养法
PCR法
+
-
+
52
, 百拇医药
9
-
5
94
总符合率(%)
91.2
3 讨论
UU是一种无细胞壁、无固定形态的原核细胞型微生物，它能引起人类泌尿生殖道感染，尤其是与NGU的发生有密切关系。此外，UU可通过胎盘感染胎儿，引起早产、死胎和新生儿呼吸道感染、不孕等[3]。
PCR是一种体外扩增特异DNA片断的新技术，它可在短时间内使极微量的核酸片断扩增至数百万个拷贝，具有特异性强，灵敏度高，简便快速的优点。但操作中如果控制不好，会出现假阳性和假阴性结果。本实验的结果有9例培养阳性而PCR阴性，占实验总例数的5.6%，提示可能存在假阴性。造成假阴性的原因[4]包括：①模板提取过程不当；②标本中含有Taq酶抑制剂等。
, 百拇医药
培养法是检测UU的经典方法，也是WHO推荐诊断NGU的首选方法，操作简便，费用低廉，对实验条件要求不高。UU含有脲酶，可利用尿素为能源。培养法就是利用这一特点，将标本接种于加有尿素和酚红指示剂的液体培养基中，24～48h后如有UU生长，其脲酶可分解尿素而产生氨，使培养基pH值上升，培养液由黄色变为粉红色或桃红色。如泌尿生殖道有其他微生物(如念珠菌、变形杆菌等)感染时，亦会出现假阳性结果。必要时需用固体培养，见到典型UU菌落方可确诊，但耗时较长，不能快速诊断。
本实验证实了在淋病患者中，UU的检出率明显高于NGU患者[3]。这可能是因为淋球菌损伤泌尿生殖道粘膜有利于UU的粘附，也可能是淋病治愈后有些人仍有遗留症状的原因。因此临床医生对淋病患者的混合感染务必引起重视。
本文结果提示，女性患者UU检出率显著高于男性患者，与文献[5]报道相符，可能是因为女性泌尿生殖道解剖、生理功能的特点，更容易被UU侵犯，女性感染后症状不易明显，未引起足够重视。
, http://www.100md.com
本文用PCR法和培养法同时检测UU，结果两种方法的总符合率为91.2%。以培养法为标准。PCR法的敏感性和特性性分别为85.2%和95.0%，两种方法的差别没有统计学意义，说明两法都能有效地检测UU。但PCR法如质控不好，可不同程度地存在假阳性或假阴性结果，并且需要昂贵稳定的仪器设备，做为常规诊断方法受到一定限制。所以培养法仍应是临床上的首选诊断方法。
参考文献
1 叶干运，主编.性病防治手册.第二版.南京：江苏科学技术出版社，1994∶53
2 张艳萍，等.解脲支原体培养基改良的实验室研究.临床皮肤科杂志，1997，26(5)∶290
3 陆德源，主编.医学微生物学.第四版.北京∶人民卫生出版社，1998∶167～170
4 徐晨，等.培养及PCR法检测泌尿生殖道解脲支原体比较.中国皮肤性病学杂志，1998，12(5)∶270
5 杨文林，等.523例泌尿生殖道感染者支原体培养及药敏分析.中华皮肤性病学杂志，1998，12(2)∶93
(1999年6月2日收稿), 百拇医药