伤寒杆菌耐药质粒pRST98介导血清杀菌作用抗性的研究
作者：吴淑燕 黄瑞 林发榕
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：伤寒杆菌；耐药质粒pRST98；血清杀菌试验
苏州医学院学报990908 摘要 将pRST98导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌、伤寒杆菌，并用十二烷基硫酸钠(SDS)消除耐药菌株的pRST98，计算接合子及R质粒消除前后菌株在人、兔及豚鼠的不同浓度、不同成份血清中的存活率。pRST98介导其宿主菌对血清杀菌的抗性，但在不同宿主菌中抵抗力不同；补体经典途径及旁路途径均参与血清杀菌过程。pRST98具有多效性，其广泛的宿主性在介导细菌多重耐药的同时，还赋予细菌抵抗血清的杀菌作用，使病原菌致病性增强。
中图法分类 R378.2
, http://www.100md.com
Study on the Serum Resistance Mediated by An Antibiotic Resistance Plasmid from Salmonella Typhi
Wu Shuyan,Huang Rui,Lin Farong
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou，215007)
Abstract The purpose of this study was to examine the effect of a 98.6 Mdal antibiotic resistant plasmid from S.typhi(pRST98) on the serum killing of S.typhi and E.coli strains.pRST98,harbouring in S.typhi strain(ST1) was transferred to plasmid-free E.coliK12W1485 and S.typhi strain ST2.Whereas pRST98 carried by ST1 was cured by 10% SDS,the vibilities in dilute and nomal human,rabbit and guinea pig serum (NHS,NRS and GPS) were compared.Our result demonstrated that pRST98 rendered S.typhi and E.coli resistant to killing by NHS,NRS and GPS;the level of resistance was strain dependent and serum dependent;pRST98 inhibited killing by both the classical and alternative C pathway.Since pRST98 is a self-transmissible plasmid with a broad host range among the enteric bacilli,the possibility that pRST98 carries a serum resistance gene is potentially important in infectious disease processes.
, 百拇医药
Key Words S.typhi;pRST98;serum bactericidal activity
质粒是细菌染色体外能独立复制的具有遗传功能的闭环双链DNA，其编码产生某些特殊功能的蛋白质，赋予细菌新的特性(耐药性、致育性、产生毒素等)，提供宿主菌在特定环境下，如抗菌药物、人体特异及非特异免疫时生存或生长的能力。
八十年代末至九十年代初，我国由南向北在13省市先后发生多重耐药伤寒流行。我们对1987-92年苏州地区分离的591株伤寒杆菌(S.typhi)进行药敏试验、质粒电泳、接合转移、转化及消除试验，证实其多重耐药性由一条分子量为98.6×106道尔顿(98.6Md,159Kb)的大质粒所介导，我们称之为pRST98，而敏感株则无质粒检出。经质粒不相容性分群，首次证实我国流行的R质粒属不相容性C群(IncC)[1，2]。我国耐药伤寒暴发流行来势凶猛，患者病情重、并发症多、病死率高，分离的耐药菌均只携带一条质粒。这些现象促使我们思考：流行菌株的致病性是否有所改变?该耐药质粒除编码抗药性外是否还兼具其他特性?本研究以IncC pRST98为研究对象，通过接合转移试验将其导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌及伤寒杆菌，并用SDS消除伤寒杆菌携带的pRST98，比较接合子及pRST98消除前后菌株在人、兔、豚鼠不同浓度，不同成份血清中的抵抗力的变化。
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1 材料和方法
1.1 菌株：1株1988年分离的携带pRST98的多重耐药伤寒杆菌ST1及1株1997年分离的不含R质粒的敏感伤寒杆菌ST2(收集自苏医附一院检验科)，经常规生化及血清学重复鉴定后用于试验。ST1对氯霉素、复方新诺明、四环素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、氨苄西林、羧苄西林、头孢噻吩均耐药。接合转移受体菌及血清杀菌试验阳性对照菌E.coliK12W1485(F-)Rifr由中国预防医学科学院流研所惠赠；ST1(R-)系ST1用10% SDS 42℃培养24h后R质粒消除菌株；ST1/W1485、ST1/2系以ST1为供体，经接合转移试验[3，4]将pRST98传递给受体菌E.coliK12W1485和敏感伤寒杆菌ST2的接合子。
, 百拇医药
1.2 血清：健康人血清(NHS)采自20～40岁本院教工10人，4℃静置过夜，离心收集血清，混合过滤除菌后分装、备用。兔血清(NRS)和豚鼠血清(GPS)分别取自5只健康兔和豚鼠，处理方法同人血清。
1.3 血清杀菌试验：将待试菌接种于3mlLB肉汤，37℃12h至对数生长期，菌量用0.9%NaCl(NS)调整至OD600=0.1时(约为1.0×108个菌/ml)再用NS稀释至1.0×104个菌/ml。为区别血清杀菌过程中补体经典途径(Classical Complement Pathway,CCP)与旁路途径(Alternative Complement Pathway,ACP)的不同作用，将血清置于50℃水浴15min，以灭活绝大多数参与ACP的成份。吸取0.2ml菌液，分别加入含相应血清0.2ml的12支试管(见附表)及不含血清的0.2ml LB肉汤中。根据预试验结果选择37℃2h作为杀菌作用时间。加入已溶化并冷却至45℃左右的0.8%软琼脂培养基4.5ml，摇匀后加至已含10ml 1.6%LB琼脂的上层，待凝固后置37℃24h,计算各管存活菌落数。每份样品均一式3份，取其平均值。
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1.4 结果见附表。
附表 pRST98介导的细菌在不同血清中的存活率(%)* 血清
菌株
E.coliK12
W1485
ST1
ST2
ST1
(R-)
ST1/
W1485
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ST1/2
1 NHS
0
3.7
0
0.5
5.7
2.3
2 ACP灭活后
4.5
71.6
8.5
25.2
, 百拇医药
60.3
50.8
3 1：10NHS
0
10.9
0.5
4.0
9.8
12
4 1：10ACP灭活后
72
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5 NRS
0
8.0
2.8
2.5
7.8
10.9
6 ACP灭活后
2.3
25.7
, 百拇医药
6.9
5.6
29
31.2
7 1：10NRS
5.4
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92.2
81.4
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8 1：10ACP灭活后
64.4
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9 GPS
0.5
17.5
3.5
6.0
16.9
20.1
10 ACP灭活后
, 百拇医药
2.0
19.5
5.7
8.0
18.3
22.4
11 1：10GPS
5.0
55.8
27.5
22.0
38.9
56.2
, 百拇医药
12 1：10ACP灭活后
16
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*存活率>100%表明细菌在血清中可以增殖
2 讨论
pRST98可介导细菌的血清杀菌抗性，其活性与浓度呈正相关。在不同浓度、不同成份的血清中，几种细菌的存活率有一规律性的显示，即携带pRST98的细菌-ST1、ST1/W1485、ST1/2的明显高于不含pRST98的细菌-ST1(R-)、ST2(P<0.05)。ST1的pRST98消除后，其存活率降低3～5倍；而ST2在获得了pRST98后，接合子的存活率提高3～8倍。但除抗GPS的杀菌作用较强外，pRST98的宿主菌对血清杀菌抵抗力的绝对水平并不高，这主要是由NHS、NRS、GPS 3种血清的固有差异所致。已证实NHS的活性比NRS的活性高5倍多，比GPS高10倍多[5]，我们的实验结果示显示，当条件齐同时，pRST98的宿主菌对人血清的抵抗力最低。3种血清1：10稀释后杀菌率均明显下降(P<0.05)。将pRST98传递给受体菌E.coliK12W1485、ST2后，发现接合子ST1/W1485、ST1/2的抵抗力均明显增强，其存活率有的甚至超过供体菌ST1，说明在不同种属、甚至同种属的不同菌株中，pRST98介导的血清杀菌抗性的强弱因其宿主菌不同而有差异，这可能与宿主菌的本身特点及pRST98的特性相关。细菌对血清的敏感度还依赖于细菌的浓度，给定一个血清浓度，细菌在血清中的存活率随细菌浓度的下降而降低。质粒可介导细菌的血清杀菌抗性，但对其本质和生理学意义尚不完全清楚，可能是由于忽略了血清杀菌抗性的血清依赖性(指血清来源于不同种动物、或同种动物的新鲜或不新鲜血清和血清浓度)和菌株依赖性。
, 百拇医药
补体是血清杀菌的主要活性物质，pRST98可明显介导其宿主菌对CCP杀菌的抵抗力。在预试验中，我们将全血清56℃加热30min灭活补体成份后发现，无论是携带pRST98的细菌还是不含pRST98的细菌，在NHS、NRS、GPS中的存活率均>100%，证明血清杀菌的主要活性物质是补体。补体系统的活化有CCP和ACP两种途径，两条途径均可被细菌激活，其最后结局都是通过形成膜攻击复合物(MAC)而导致细菌裂解。将NHS、NRS、GPS的ACP灭活以后，携带pRST98的细菌存活率明显大于不含pRST98的细菌(P<0.05)，说明3种血清CCP的杀菌活性可被携带pRST98的宿主菌抵抗。而将3种血清1：10稀释后再灭活ACP，除E.coliK12W1485以外，所有细菌的存活率均>100%，说明CCP的杀菌活性几乎需要完整的全血清。pRST98能介导其宿主菌对NHS、NRS、GPS全血清杀菌的抵抗力，补体ACP及CCP的杀菌活性均可被pRST98的宿主菌抵抗。
, 百拇医药
pRST98介导血清杀菌作用抗性的可能机制。有学者认为，质粒可以改变光滑型宿主菌的血清应答能力，光滑型细菌具有完整的脂多糖(LPS)O侧链，与血清杀菌的延迟有关[6]。E.coliK12呈粗糙型，但在获得了pRST98后，接合子ST1/W1485对血清杀菌的抵抗力也大大增强，这可能是由于pRST98某些基因的编码产物能使其宿主菌从粗糙型变为光滑型；R质粒还可使其宿主菌表达新的抗原决定簇，直接改变菌细胞的表面结构[7]，pRST98介导的细菌血清杀菌抗性也可能是通过改变菌细胞的表面结构而改变或阻断了细菌对补体CCP和ACP的激活，或干扰了在宿主菌表面补体级联反应；或编码了某些能破坏补体有关成份的蛋白质，从而介导其宿主菌的血清杀菌抗性。pRST98可在肠道细菌中发生广泛的接合传递，在赋予其宿主菌多重耐药特性的同时，还能介导细菌对血清杀菌的抵抗力，这对病原菌的致病性有重要的意义。
, 百拇医药
参考文献
1 黄瑞，等.伤寒沙门氏菌及其耐药质粒的监测.中华传染病杂志，1994，12(4)∶204
2 顾国浩，等.伤寒杆菌R质粒不相容性分群.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(6)∶357
3 包幼迪.细菌的接合转移试验.福建医学院学报，1984增刊∶100
4 Roe DE,et al.Mobile rRNA methylase genes coding for erythromycin resistance in Actionbacillus actimycetemcomitans.J Antimicrobial Chemotherapy,1996，37∶457
5 Ogata RT,et al.Characterization of complement resistance in Escherichia coli conferred by the antibiotic resistance plasmid R100.J Immunology,1980，125(4)∶1494
, 百拇医药
6 Taylor PW.Plasmid carriage and the serum sensitivity of enterobacteria.Infection and Immunity,1978，22(1)∶10
7 Moll A,et al.Plasmid-determined resistance to serum bactericidal productive:a major membrane protein,the traT gene product,is responsible for plasmid-specified serum resistance in Escherichia coli.Infect Immun,1980，28(2)∶359
(1999年5月6日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院微生物学教研室，苏州，215007
关键词：伤寒杆菌；耐药质粒pRST98；血清杀菌试验
苏州医学院学报990908 摘要 将pRST98导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌、伤寒杆菌，并用十二烷基硫酸钠(SDS)消除耐药菌株的pRST98，计算接合子及R质粒消除前后菌株在人、兔及豚鼠的不同浓度、不同成份血清中的存活率。pRST98介导其宿主菌对血清杀菌的抗性，但在不同宿主菌中抵抗力不同；补体经典途径及旁路途径均参与血清杀菌过程。pRST98具有多效性，其广泛的宿主性在介导细菌多重耐药的同时，还赋予细菌抵抗血清的杀菌作用，使病原菌致病性增强。
中图法分类 R378.2
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Study on the Serum Resistance Mediated by An Antibiotic Resistance Plasmid from Salmonella Typhi
Wu Shuyan,Huang Rui,Lin Farong
(Department of Microbiology,Suzhou Medical College,Suzhou，215007)
Abstract The purpose of this study was to examine the effect of a 98.6 Mdal antibiotic resistant plasmid from S.typhi(pRST98) on the serum killing of S.typhi and E.coli strains.pRST98,harbouring in S.typhi strain(ST1) was transferred to plasmid-free E.coliK12W1485 and S.typhi strain ST2.Whereas pRST98 carried by ST1 was cured by 10% SDS,the vibilities in dilute and nomal human,rabbit and guinea pig serum (NHS,NRS and GPS) were compared.Our result demonstrated that pRST98 rendered S.typhi and E.coli resistant to killing by NHS,NRS and GPS;the level of resistance was strain dependent and serum dependent;pRST98 inhibited killing by both the classical and alternative C pathway.Since pRST98 is a self-transmissible plasmid with a broad host range among the enteric bacilli,the possibility that pRST98 carries a serum resistance gene is potentially important in infectious disease processes.
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Key Words S.typhi;pRST98;serum bactericidal activity
质粒是细菌染色体外能独立复制的具有遗传功能的闭环双链DNA，其编码产生某些特殊功能的蛋白质，赋予细菌新的特性(耐药性、致育性、产生毒素等)，提供宿主菌在特定环境下，如抗菌药物、人体特异及非特异免疫时生存或生长的能力。
八十年代末至九十年代初，我国由南向北在13省市先后发生多重耐药伤寒流行。我们对1987-92年苏州地区分离的591株伤寒杆菌(S.typhi)进行药敏试验、质粒电泳、接合转移、转化及消除试验，证实其多重耐药性由一条分子量为98.6×106道尔顿(98.6Md,159Kb)的大质粒所介导，我们称之为pRST98，而敏感株则无质粒检出。经质粒不相容性分群，首次证实我国流行的R质粒属不相容性C群(IncC)[1，2]。我国耐药伤寒暴发流行来势凶猛，患者病情重、并发症多、病死率高，分离的耐药菌均只携带一条质粒。这些现象促使我们思考：流行菌株的致病性是否有所改变?该耐药质粒除编码抗药性外是否还兼具其他特性?本研究以IncC pRST98为研究对象，通过接合转移试验将其导入不含质粒且对抗菌药物敏感的大肠杆菌及伤寒杆菌，并用SDS消除伤寒杆菌携带的pRST98，比较接合子及pRST98消除前后菌株在人、兔、豚鼠不同浓度，不同成份血清中的抵抗力的变化。
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1 材料和方法
1.1 菌株：1株1988年分离的携带pRST98的多重耐药伤寒杆菌ST1及1株1997年分离的不含R质粒的敏感伤寒杆菌ST2(收集自苏医附一院检验科)，经常规生化及血清学重复鉴定后用于试验。ST1对氯霉素、复方新诺明、四环素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、氨苄西林、羧苄西林、头孢噻吩均耐药。接合转移受体菌及血清杀菌试验阳性对照菌E.coliK12W1485(F-)Rifr由中国预防医学科学院流研所惠赠；ST1(R-)系ST1用10% SDS 42℃培养24h后R质粒消除菌株；ST1/W1485、ST1/2系以ST1为供体，经接合转移试验[3，4]将pRST98传递给受体菌E.coliK12W1485和敏感伤寒杆菌ST2的接合子。
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1.2 血清：健康人血清(NHS)采自20～40岁本院教工10人，4℃静置过夜，离心收集血清，混合过滤除菌后分装、备用。兔血清(NRS)和豚鼠血清(GPS)分别取自5只健康兔和豚鼠，处理方法同人血清。
1.3 血清杀菌试验：将待试菌接种于3mlLB肉汤，37℃12h至对数生长期，菌量用0.9%NaCl(NS)调整至OD600=0.1时(约为1.0×108个菌/ml)再用NS稀释至1.0×104个菌/ml。为区别血清杀菌过程中补体经典途径(Classical Complement Pathway,CCP)与旁路途径(Alternative Complement Pathway,ACP)的不同作用，将血清置于50℃水浴15min，以灭活绝大多数参与ACP的成份。吸取0.2ml菌液，分别加入含相应血清0.2ml的12支试管(见附表)及不含血清的0.2ml LB肉汤中。根据预试验结果选择37℃2h作为杀菌作用时间。加入已溶化并冷却至45℃左右的0.8%软琼脂培养基4.5ml，摇匀后加至已含10ml 1.6%LB琼脂的上层，待凝固后置37℃24h,计算各管存活菌落数。每份样品均一式3份，取其平均值。
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1.4 结果见附表。
附表 pRST98介导的细菌在不同血清中的存活率(%)* 血清
菌株
E.coliK12
W1485
ST1
ST2
ST1
(R-)
ST1/
W1485
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ST1/2
1 NHS
0
3.7
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0.5
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2.3
2 ACP灭活后
4.5
71.6
8.5
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60.3
50.8
3 1：10NHS
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4 1：10ACP灭活后
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5 NRS
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6 ACP灭活后
2.3
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7 1：10NRS
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8 1：10ACP灭活后
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9 GPS
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3.5
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20.1
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11 1：10GPS
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2 讨论
pRST98可介导细菌的血清杀菌抗性，其活性与浓度呈正相关。在不同浓度、不同成份的血清中，几种细菌的存活率有一规律性的显示，即携带pRST98的细菌-ST1、ST1/W1485、ST1/2的明显高于不含pRST98的细菌-ST1(R-)、ST2(P<0.05)。ST1的pRST98消除后，其存活率降低3～5倍；而ST2在获得了pRST98后，接合子的存活率提高3～8倍。但除抗GPS的杀菌作用较强外，pRST98的宿主菌对血清杀菌抵抗力的绝对水平并不高，这主要是由NHS、NRS、GPS 3种血清的固有差异所致。已证实NHS的活性比NRS的活性高5倍多，比GPS高10倍多[5]，我们的实验结果示显示，当条件齐同时，pRST98的宿主菌对人血清的抵抗力最低。3种血清1：10稀释后杀菌率均明显下降(P<0.05)。将pRST98传递给受体菌E.coliK12W1485、ST2后，发现接合子ST1/W1485、ST1/2的抵抗力均明显增强，其存活率有的甚至超过供体菌ST1，说明在不同种属、甚至同种属的不同菌株中，pRST98介导的血清杀菌抗性的强弱因其宿主菌不同而有差异，这可能与宿主菌的本身特点及pRST98的特性相关。细菌对血清的敏感度还依赖于细菌的浓度，给定一个血清浓度，细菌在血清中的存活率随细菌浓度的下降而降低。质粒可介导细菌的血清杀菌抗性，但对其本质和生理学意义尚不完全清楚，可能是由于忽略了血清杀菌抗性的血清依赖性(指血清来源于不同种动物、或同种动物的新鲜或不新鲜血清和血清浓度)和菌株依赖性。
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补体是血清杀菌的主要活性物质，pRST98可明显介导其宿主菌对CCP杀菌的抵抗力。在预试验中，我们将全血清56℃加热30min灭活补体成份后发现，无论是携带pRST98的细菌还是不含pRST98的细菌，在NHS、NRS、GPS中的存活率均>100%，证明血清杀菌的主要活性物质是补体。补体系统的活化有CCP和ACP两种途径，两条途径均可被细菌激活，其最后结局都是通过形成膜攻击复合物(MAC)而导致细菌裂解。将NHS、NRS、GPS的ACP灭活以后，携带pRST98的细菌存活率明显大于不含pRST98的细菌(P<0.05)，说明3种血清CCP的杀菌活性可被携带pRST98的宿主菌抵抗。而将3种血清1：10稀释后再灭活ACP，除E.coliK12W1485以外，所有细菌的存活率均>100%，说明CCP的杀菌活性几乎需要完整的全血清。pRST98能介导其宿主菌对NHS、NRS、GPS全血清杀菌的抵抗力，补体ACP及CCP的杀菌活性均可被pRST98的宿主菌抵抗。
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pRST98介导血清杀菌作用抗性的可能机制。有学者认为，质粒可以改变光滑型宿主菌的血清应答能力，光滑型细菌具有完整的脂多糖(LPS)O侧链，与血清杀菌的延迟有关[6]。E.coliK12呈粗糙型，但在获得了pRST98后，接合子ST1/W1485对血清杀菌的抵抗力也大大增强，这可能是由于pRST98某些基因的编码产物能使其宿主菌从粗糙型变为光滑型；R质粒还可使其宿主菌表达新的抗原决定簇，直接改变菌细胞的表面结构[7]，pRST98介导的细菌血清杀菌抗性也可能是通过改变菌细胞的表面结构而改变或阻断了细菌对补体CCP和ACP的激活，或干扰了在宿主菌表面补体级联反应；或编码了某些能破坏补体有关成份的蛋白质，从而介导其宿主菌的血清杀菌抗性。pRST98可在肠道细菌中发生广泛的接合传递，在赋予其宿主菌多重耐药特性的同时，还能介导细菌对血清杀菌的抵抗力，这对病原菌的致病性有重要的意义。
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参考文献
1 黄瑞，等.伤寒沙门氏菌及其耐药质粒的监测.中华传染病杂志，1994，12(4)∶204
2 顾国浩，等.伤寒杆菌R质粒不相容性分群.中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(6)∶357
3 包幼迪.细菌的接合转移试验.福建医学院学报，1984增刊∶100
4 Roe DE,et al.Mobile rRNA methylase genes coding for erythromycin resistance in Actionbacillus actimycetemcomitans.J Antimicrobial Chemotherapy,1996，37∶457
5 Ogata RT,et al.Characterization of complement resistance in Escherichia coli conferred by the antibiotic resistance plasmid R100.J Immunology,1980，125(4)∶1494
, 百拇医药
6 Taylor PW.Plasmid carriage and the serum sensitivity of enterobacteria.Infection and Immunity,1978，22(1)∶10
7 Moll A,et al.Plasmid-determined resistance to serum bactericidal productive:a major membrane protein,the traT gene product,is responsible for plasmid-specified serum resistance in Escherichia coli.Infect Immun,1980，28(2)∶359
(1999年5月6日收稿), http://www.100md.com