大鼠Alzheimer病模型制备
作者：戴永萍 刘春风 包仕尧 张志琳 温仲明
单位：苏州医学院附属二院神经内科，苏州，215004
关键词：Alzheimer病；大鼠；β-淀粉样蛋白；记忆
摘要 建立Alzheimer病 摘要 建立Alzheimer病(AD)大鼠模型并观察其学习、记忆能力的改变。立体定位下将β-淀粉样蛋白(β-AP)注入大鼠迈内特基底核(NBM)建立大鼠AD模型，三等分Y迷宫测定大鼠学习记忆能力。结果：模型组大鼠学习记忆能力下降；治疗组学习记忆虽有所改善，但与对照组比较仍有差异。提示β-AP注入NBM能引起大鼠学习记忆损害，其行为学改变与AD早期症状相似。
中图法分类 R742.3
A Model of Alzheimer Disease in Rats
, 百拇医药
Dai Yongpin,Liu Chunfeng,Bao Shiyao,et al
(The Second Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215004)
Abstract In order to establish Alzheimer's disease(AD) model in rats and observe the changes of learning and memory abilities.In stereotaxis beta-amyloid protein(β-AP) was injected into nucleus basalis of Meynert(NBM) to establish the AD model.AD rats' learning and memory obility was observed by Y-maze.The model group's learning and memory ability was decreased.Ability of learning and memory in treatment group was improved,but worse than that in the control group.The results suggest that the administration of β-AP into rat's NBM could lead to the loss of learning and memory ability.The change of behavior was similar to the early symptoms of AD.
, 百拇医药
Key words alzheimer's disease;rat;beta-amyloid protein;memory
Alzheimer病(AD)是一种以记忆衰退、认知障碍等异常表现为主的渐进性与退行性大脑变性性疾病，随着我国社会的老龄化，AD的发病有增加趋势。AD的发病机理尚不清楚，也无有效治疗。为研究AD的发病机理，筛选有效治疗药物，我们以β-淀粉样蛋白(β-AP)注入大鼠迈内特基底核(NBM)建立大鼠AD模型，观察AD大鼠的学习记忆的改变及中药参麦对其的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠3～4月龄，体重180～250g,由苏州医学院动物实验中心提供。随机分3组：模型组，治疗组和对照组，每组8只。
1.2 药物：βAP1-40(RBI公司产品，美国)以10g/L浓度溶解于双蒸水中，-70℃保存，使用前在37℃中放置24h。参麦由杭州正大青春宝药厂提供，人参总皂甙含量为1.8g/L。
, http://www.100md.com
1.3 模型制备：3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(1ml/100g体重)，将其固定在立体定位仪上，头顶部正中切口，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱[1]，于坐标前囟后1.4mm,旁2.5mm，深7.2mm处，用外径为0.6mm微量注射器插入NBM，用微量推进器在5min内将10μg(1μl)注入NBM内，留针5min后慢慢退出。对照组相同部位注入等容积生理盐水。所有操作均在无菌下进行，皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。将大鼠放回笼中自由活动进食。治疗组于注入βAP1-40后即刻给予腹腔注射参麦1ml/100g体重，以后每天注射至实验结束，共2周。
1.4 行为学观察：大鼠学习记忆能力用三等分Y迷宫进行测试。大鼠学习记忆成绩分别以其测试达到连续10次中有9次(9/10)正确反应时所需的电击次数表示。达到9/10正确反应时所需电击次数多少表示大鼠认知行为能力。Y迷宫电压50V，电流0.5-0.7mA。学习测验：注射后第1周将大鼠放入Y迷宫箱内，适应环境3min，然后根据大鼠位置随机改变电击区和安全区，凡大鼠受电击后能从起步区逃至安全区为正确反应，否则为错误反应，测试至达连续9/10正确标准。记忆测试：注射后第2周时以同样方法测试10次，以正确反应次数表示记忆成绩。每次测试均在上午进行。实验组大鼠全部测试结束后断头取鼠脑，HE染色后用显微镜进行组织学观察，以验证注射部位是否准确。
, http://www.100md.com
1.5 统计学处理：数据以
±s表示。各组学习记忆能力的比较用t检验。
2 结果
大鼠学习、记忆能力测试结果见附表。模型组大鼠学习记忆能力均较对照组下降，治疗组与模型组比学习记忆能力均有所改善(P<0.05)但与对照组比较仍有差异(P<0.01，P<0.05)。模型组在NBM处注射部位有细胞破坏改变，而海马则见神经细胞变性和胶质增生(附图)。
附表 各组大鼠学习记忆能力比较(±s)
, 百拇医药
组别
学习成绩(第1周)
记忆能力(第2周)
模型组
71.3±12.5**##
4.9±0.7**#
治疗组
52.5±8.8*
6.9±1.6*
对照组
42.5±7.1
, http://www.100md.com
8.1±0.7
与对照组比*P<0.05，**P<0.01；与治疗组比，##P<0.01，#P<0.05
附图 海马(HE)
3 讨论
在AD的研究中，所面临的困难是缺乏相应的动物模型，理想的模型应使人们对AD的神经化学、神经病理和行为各方面进行详尽的评价。AD的主要病理特征为脑内淀粉样斑块，神经纤维缠结及颗粒空泡样变。研究发现AD患者的神经元缺失主要位于胆碱能神经元分布区。神经化学研究证实AD动物不仅隔核、NBM胆碱能神经元减少，而且海马及新皮质内突触胆碱脂酶、胆碱乙酰化酶和乙酰胆碱合成减少，这些变化程度与痴呆评分相关[2]。由此可见胆碱能系统在学习记忆中起重要作用。目前建立大鼠AD痴呆模型常用的方法是破坏脑内胆碱能系统。方法有脑内注入兴奋毒性氨基酸如海人藻酸、喹啉酸、谷氨酸或电解毁损有关核团，注射或毁损的部位有海马、隔核和NBM，以破坏不同部位的胆碱能投射等，但都没能显现出完整的AD特征，特别是淀粉样物质沉积。尽管最近转基因动物表现出更多的类似人类AD的症状，但和人类AD仍有很大差距，而且技术要求较高。RBI公司的βAP1-40是从AD病人脑内淀粉样斑块中提取，注入NBM后，βAP的神经毒性及NBM毁损造成基底-前脑胆碱能神经投射通路损害，引起大鼠学习记忆损害而建立的AD痴呆模型。NBM是重要的胆碱能神经核团，在AD病人脑内人们发现βAP纤维沉积主要分布于皮层和某些边缘结构以及投射到这些部位的基底前脑[3]。我们的实验结果表明，βAP操作NBM后，大鼠的学习、记忆能力均下降，实验操作简便，HE染色后也证实在NBM处注射部位有细胞破坏，在胆碱能投射通路海马、额叶的神经细胞也看到细胞变性和胶质细胞增生。
, http://www.100md.com
βAP损害NBM及胆碱能神经投射通路的机制尚不清楚。Suo等[4]发现，在大鼠βAP增加脑血管的阻力，脑血流量下降，βAP增加脑血管的阻力，脑血流量下降，βAP能直接并特异性地收缩血管，与AD患者早期rCBF下降有关。Arispe等[5]的体外试验发现合成的βAP可形成一种跨越脂双层的离子通道，这些通道可有效地转运钙离子，而且这种改变早于淀粉样斑块的形成，推测与βAP的细胞毒性有关。Ueda等[6]的通过膜片钳技术发现，尼莫的平和Vit E都能抑制βAP所导致的钙离子内流。Weiss等[7]在培养的神经细胞中也发现尼莫的平能减少βAP所引起的损害。因此神经元钙离子失衡在βAP引起神经细胞损害中起重要作用。我们的参麦治疗实验结果也支持这一观点。有研究表明，参麦的主要成分之一人参皂甙能降低神经细胞内钙浓度[8]。通过参麦治疗2周后，大鼠学习记忆能力有所改善，但治疗组大鼠与对照组比较仍有差异。这说明钙拮抗剂治疗后不能完全抑制βAP所导致的行为学损害，可认为在βAP所致的大鼠痴呆过程中，除神经元钙离子失衡外，可能还存在其它机制，有必要进一步研究。
, http://www.100md.com
核工业基金资助题(Y800060-1)
参考文献
1 Paxinos G,Waston C.The rat brain in stereotaxic coordinates.2nd ed.Orlando;Academic 1986∶17
2 李琳.非遗传性老年性痴呆的运物模型及行为学、病理学改变.生理科学进展，1997，28(4)∶325
3 Wisniewski T,et al.Alzheimer's disease and soluble AB.Neurobiology of Aging,1994,15(2)∶143
4 Suo Z,et al.Soluble Alzheimer's beta-amyloid constricts the cerebral vasculature in vivo.Neurosci Lett,1998,257(2)∶77
, 百拇医药
5 Arispe N,et al.Alzheimer's disease amloid beta protein forms calcium channeles in bilayer membranes∶blockade by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90∶567
6 Ueda K,et al.Amyloid beta protein potentiates Ca2+influx through L-type voltage-sensitive Ca2+channels∶a possible involvement of free radicals.J Neurochem,1997,68(1)∶265
7 Weiss JH,et al.Ca2+channel blockers attenuate beta-amyloid peptide toxicity to cortical neurons in culture.J Neurochem,1994,62(1)∶372
8 杨迎，等.人参皂甙Rb1和Rg1促智作用抑制探讨.药学学报，1994，29∶241
(1999年2月12日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院附属二院神经内科，苏州，215004
关键词：Alzheimer病；大鼠；β-淀粉样蛋白；记忆
摘要 建立Alzheimer病 摘要 建立Alzheimer病(AD)大鼠模型并观察其学习、记忆能力的改变。立体定位下将β-淀粉样蛋白(β-AP)注入大鼠迈内特基底核(NBM)建立大鼠AD模型，三等分Y迷宫测定大鼠学习记忆能力。结果：模型组大鼠学习记忆能力下降；治疗组学习记忆虽有所改善，但与对照组比较仍有差异。提示β-AP注入NBM能引起大鼠学习记忆损害，其行为学改变与AD早期症状相似。
中图法分类 R742.3
A Model of Alzheimer Disease in Rats
, 百拇医药
Dai Yongpin,Liu Chunfeng,Bao Shiyao,et al
(The Second Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215004)
Abstract In order to establish Alzheimer's disease(AD) model in rats and observe the changes of learning and memory abilities.In stereotaxis beta-amyloid protein(β-AP) was injected into nucleus basalis of Meynert(NBM) to establish the AD model.AD rats' learning and memory obility was observed by Y-maze.The model group's learning and memory ability was decreased.Ability of learning and memory in treatment group was improved,but worse than that in the control group.The results suggest that the administration of β-AP into rat's NBM could lead to the loss of learning and memory ability.The change of behavior was similar to the early symptoms of AD.
, 百拇医药
Key words alzheimer's disease;rat;beta-amyloid protein;memory
Alzheimer病(AD)是一种以记忆衰退、认知障碍等异常表现为主的渐进性与退行性大脑变性性疾病，随着我国社会的老龄化，AD的发病有增加趋势。AD的发病机理尚不清楚，也无有效治疗。为研究AD的发病机理，筛选有效治疗药物，我们以β-淀粉样蛋白(β-AP)注入大鼠迈内特基底核(NBM)建立大鼠AD模型，观察AD大鼠的学习记忆的改变及中药参麦对其的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠3～4月龄，体重180～250g,由苏州医学院动物实验中心提供。随机分3组：模型组，治疗组和对照组，每组8只。
1.2 药物：βAP1-40(RBI公司产品，美国)以10g/L浓度溶解于双蒸水中，-70℃保存，使用前在37℃中放置24h。参麦由杭州正大青春宝药厂提供，人参总皂甙含量为1.8g/L。
, http://www.100md.com
1.3 模型制备：3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(1ml/100g体重)，将其固定在立体定位仪上，头顶部正中切口，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱[1]，于坐标前囟后1.4mm,旁2.5mm，深7.2mm处，用外径为0.6mm微量注射器插入NBM，用微量推进器在5min内将10μg(1μl)注入NBM内，留针5min后慢慢退出。对照组相同部位注入等容积生理盐水。所有操作均在无菌下进行，皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。将大鼠放回笼中自由活动进食。治疗组于注入βAP1-40后即刻给予腹腔注射参麦1ml/100g体重，以后每天注射至实验结束，共2周。
1.4 行为学观察：大鼠学习记忆能力用三等分Y迷宫进行测试。大鼠学习记忆成绩分别以其测试达到连续10次中有9次(9/10)正确反应时所需的电击次数表示。达到9/10正确反应时所需电击次数多少表示大鼠认知行为能力。Y迷宫电压50V，电流0.5-0.7mA。学习测验：注射后第1周将大鼠放入Y迷宫箱内，适应环境3min，然后根据大鼠位置随机改变电击区和安全区，凡大鼠受电击后能从起步区逃至安全区为正确反应，否则为错误反应，测试至达连续9/10正确标准。记忆测试：注射后第2周时以同样方法测试10次，以正确反应次数表示记忆成绩。每次测试均在上午进行。实验组大鼠全部测试结束后断头取鼠脑，HE染色后用显微镜进行组织学观察，以验证注射部位是否准确。
, http://www.100md.com
1.5 统计学处理：数据以
±s表示。各组学习记忆能力的比较用t检验。2 结果
大鼠学习、记忆能力测试结果见附表。模型组大鼠学习记忆能力均较对照组下降，治疗组与模型组比学习记忆能力均有所改善(P<0.05)但与对照组比较仍有差异(P<0.01，P<0.05)。模型组在NBM处注射部位有细胞破坏改变，而海马则见神经细胞变性和胶质增生(附图)。
附表 各组大鼠学习记忆能力比较(
±s), 百拇医药
组别
学习成绩(第1周)
记忆能力(第2周)
模型组
71.3±12.5**##
4.9±0.7**#
治疗组
52.5±8.8*
6.9±1.6*
对照组
42.5±7.1
, http://www.100md.com
8.1±0.7
与对照组比*P<0.05，**P<0.01；与治疗组比，##P<0.01，#P<0.05
附图 海马(HE)
3 讨论
在AD的研究中，所面临的困难是缺乏相应的动物模型，理想的模型应使人们对AD的神经化学、神经病理和行为各方面进行详尽的评价。AD的主要病理特征为脑内淀粉样斑块，神经纤维缠结及颗粒空泡样变。研究发现AD患者的神经元缺失主要位于胆碱能神经元分布区。神经化学研究证实AD动物不仅隔核、NBM胆碱能神经元减少，而且海马及新皮质内突触胆碱脂酶、胆碱乙酰化酶和乙酰胆碱合成减少，这些变化程度与痴呆评分相关[2]。由此可见胆碱能系统在学习记忆中起重要作用。目前建立大鼠AD痴呆模型常用的方法是破坏脑内胆碱能系统。方法有脑内注入兴奋毒性氨基酸如海人藻酸、喹啉酸、谷氨酸或电解毁损有关核团，注射或毁损的部位有海马、隔核和NBM，以破坏不同部位的胆碱能投射等，但都没能显现出完整的AD特征，特别是淀粉样物质沉积。尽管最近转基因动物表现出更多的类似人类AD的症状，但和人类AD仍有很大差距，而且技术要求较高。RBI公司的βAP1-40是从AD病人脑内淀粉样斑块中提取，注入NBM后，βAP的神经毒性及NBM毁损造成基底-前脑胆碱能神经投射通路损害，引起大鼠学习记忆损害而建立的AD痴呆模型。NBM是重要的胆碱能神经核团，在AD病人脑内人们发现βAP纤维沉积主要分布于皮层和某些边缘结构以及投射到这些部位的基底前脑[3]。我们的实验结果表明，βAP操作NBM后，大鼠的学习、记忆能力均下降，实验操作简便，HE染色后也证实在NBM处注射部位有细胞破坏，在胆碱能投射通路海马、额叶的神经细胞也看到细胞变性和胶质细胞增生。
, http://www.100md.com
βAP损害NBM及胆碱能神经投射通路的机制尚不清楚。Suo等[4]发现，在大鼠βAP增加脑血管的阻力，脑血流量下降，βAP增加脑血管的阻力，脑血流量下降，βAP能直接并特异性地收缩血管，与AD患者早期rCBF下降有关。Arispe等[5]的体外试验发现合成的βAP可形成一种跨越脂双层的离子通道，这些通道可有效地转运钙离子，而且这种改变早于淀粉样斑块的形成，推测与βAP的细胞毒性有关。Ueda等[6]的通过膜片钳技术发现，尼莫的平和Vit E都能抑制βAP所导致的钙离子内流。Weiss等[7]在培养的神经细胞中也发现尼莫的平能减少βAP所引起的损害。因此神经元钙离子失衡在βAP引起神经细胞损害中起重要作用。我们的参麦治疗实验结果也支持这一观点。有研究表明，参麦的主要成分之一人参皂甙能降低神经细胞内钙浓度[8]。通过参麦治疗2周后，大鼠学习记忆能力有所改善，但治疗组大鼠与对照组比较仍有差异。这说明钙拮抗剂治疗后不能完全抑制βAP所导致的行为学损害，可认为在βAP所致的大鼠痴呆过程中，除神经元钙离子失衡外，可能还存在其它机制，有必要进一步研究。
, http://www.100md.com
核工业基金资助题(Y800060-1)
参考文献
1 Paxinos G,Waston C.The rat brain in stereotaxic coordinates.2nd ed.Orlando;Academic 1986∶17
2 李琳.非遗传性老年性痴呆的运物模型及行为学、病理学改变.生理科学进展，1997，28(4)∶325
3 Wisniewski T,et al.Alzheimer's disease and soluble AB.Neurobiology of Aging,1994,15(2)∶143
4 Suo Z,et al.Soluble Alzheimer's beta-amyloid constricts the cerebral vasculature in vivo.Neurosci Lett,1998,257(2)∶77
, 百拇医药
5 Arispe N,et al.Alzheimer's disease amloid beta protein forms calcium channeles in bilayer membranes∶blockade by tromethamine and aluminum.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90∶567
6 Ueda K,et al.Amyloid beta protein potentiates Ca2+influx through L-type voltage-sensitive Ca2+channels∶a possible involvement of free radicals.J Neurochem,1997,68(1)∶265
7 Weiss JH,et al.Ca2+channel blockers attenuate beta-amyloid peptide toxicity to cortical neurons in culture.J Neurochem,1994,62(1)∶372
8 杨迎，等.人参皂甙Rb1和Rg1促智作用抑制探讨.药学学报，1994，29∶241
(1999年2月12日收稿), http://www.100md.com